随着全球经济发展和人口的不断增长，人们对于水产品的需求量不断增加，水产品的养殖量持续上升。据统计，2023年，全国水产品总产量7 116.17万t，同比增长3.64%。其中，养殖产量5 809.61万t，捕捞产量1 306.56万t；海水产品产量3 585.32万t，同比增长3.64%；淡水产品产量3 530.85万t，同比增长3.65%[1]。在鱼类加工过程中，通常会产生占鱼体质量40%～60%的副产物。从全球范围看，每年鱼类废弃物的生成量大致处于720～1 200万t，且这些副产物中的绝大多数尚未得到高效利用[2]，仅有极其微量部分被转化用于饲料生产，其余绝大部分则被直接废弃，这一现象不仅造成资源的严重损耗，而且使得大量有机废弃物进入生态环境，给土壤、水体等生态要素带来严峻的污染问题。例如，大量废弃的鱼鳞堆积后，在自然环境中很难快速分解，随着雨水冲刷进入水体，会不断消耗水中的溶解氧，导致水体缺氧，破坏水生生物的生存环境，严重威胁水生生物系统的平衡。
鱼鳞作为鱼类最主要的副产物，含有多种丰富的蛋白质和灰分，其中蛋白质（主要为胶原蛋白和角蛋白）含量约占鱼鳞干物质含量的70%，胶原蛋白占鱼鳞干物质含量的11.59%～38.30%[3]。胶原蛋白通常由3 条多肽链构成，多数由2条α1肽链和1条α2肽链构成，少数由3条α1肽链构成[4]。这些肽链均由特定序列的氨基酸组成，这些氨基酸残基之间通过肽键紧密相连，形成一条具有一定柔性的长链。在3条多肽链相互作用时，它们依靠氢键、范德华力以及疏水相互作用等非共价键力，精准缠绕、折叠，构建出稳定且复杂的三维空间构象[5]。正是由于其独特的结构，使得胶原蛋白具有生物降解性、弱抗原性、凝胶性和良好的生物相容性，并且被广泛应用于功能食品、生物医药和化妆品等领域[6]。随着健康理念的广泛普及，人们对抗氧化产品的需求持续增长，研究人员发现从水产品中制取的抗氧化活性肽展现出巨大的应用潜能。鱼鳞胶原蛋白内部存在特定序列肽段，在机体面临氧化应激情况时，可展现出显著的抗氧化活性。这些抗氧化活性肽通过促进超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的合成与表达，来调节机体内的抗氧化酶系统，进而增强机体自身的抗氧化防御能力，帮助维持细胞内氧化还原平衡，使细胞在面对氧化应激时能够更好地保持稳定状态。
近年来，从水产品中制取抗氧化活性肽的研究引起了越来越多学者的关注，国内外学者已从鲢鱼、罗非鱼、草鱼等鱼鳞蛋白酶解液中制备出具有显著抗氧化活性的肽段[7-9]。然而对鱼副产物尤其是鱼鳞抗氧化肽的系统化研究相对较少，多数研究仅限于中间某一环节的提取或分离纯化等。这也造成了鱼鳞抗氧化肽的研究不系统、上下环节衔接不匹配等问题，如较高效的抗氧化肽提取方法可能并不适用于较高得率的纯化方法。因此，本文主要综述鱼鳞的脱钙工艺、胶原抗氧化肽的制备工艺、纯化方法、鉴定方法以及抗氧化活性评价等各环节采用的方法及其优缺点，旨在为鱼鳞的高质化利用提供理论参考。
1 鱼鳞的脱钙工艺
鱼鳞中含有大量矿物质，如磷酸盐、碳酸盐、羟基磷灰石等，以羟基磷灰石占比最高，且与胶原蛋白黏附紧密，难以分离，这极大影响了胶原蛋白提取率[2]。因此，脱钙工艺的优化就成为鱼鳞胶原提取的关键。
目前，常见的脱钙方法有酸法、螯合法、物理辅助法。酸法主要通过酸与钙盐之间的化学反应。当酸（如盐酸、柠檬酸、乳酸等）与鱼鳞接触时，酸电离出的氢离子会与钙盐中的碳酸根离子、磷酸根离子发生反应，在此过程中，钙盐结构被破坏，钙以离子形式进入溶液，从而达成脱钙目的。Chen等[9]以盐酸作为脱钙剂，对草鱼鱼鳞进行处理，选择料液比为1∶10 （g/mL），将混合物在室温下搅拌1.5 h进行脱钙处理。肖莉等[10]以柠檬酸为脱钙剂，在单因素试验的基础上，引入星点设计-响应面优化法，并建立了各因素与鱼鳞脱钙率关系的数学回归模型，优化后脱钙率达到76.46%。林艳云等[11]将草鱼鱼鳞洗净后粉碎，用10%的乳酸浸泡2 h，以料液比为1∶15 （g/mL）对鱼鳞进行脱钙。在酸法方面，不同研究者分别使用柠檬酸、盐酸、乳酸等对不同鱼类的鱼鳞进行脱钙处理，脱钙率各有不同，多种脱钙方法各有优势，而在实际应用中可以根据不同的鱼鳞种类、所需达到的脱钙率标准以及具体的试验或生产条件等因素来综合选择合适的脱钙方法。常见鱼鳞脱钙方法见表1。
表1 常见鱼鳞脱钙方法
Table 1 Common decalcification methods for fish scales
复杂螯合法乙二胺提取效率高，成本较高，[13-15]方法脱钙试剂优点缺点参考文献酸法盐酸、柠檬提取时间短提取介质易残[9-12]酸、乳酸等留，纯化过程四乙酸对胶原蛋白破坏提取时间长较小物理辅超声波辅助、提取效率高，对胶设备成本高，[16]助法磁力搅拌等原蛋白的影响小能耗过大
乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），能够与Ca、Mg、Fe、Pb、Cu、Mn等多种金属离子螯合。EDTA结构中含多个羧基与氨基，在溶液中会电离成带负电的离子，如乙二胺四乙酸根离子。而鱼鳞中的钙以碳酸钙、磷酸钙等钙盐形式存在，其中的钙离子具有空轨道可接受电子对。当EDTA与鱼鳞接触，乙二胺四乙酸根离子会与钙离子发生螯合反应，EDTA分子中的多个配位原子（羧基和氨基中的氧、氮原子）与钙原子形成多个配位键，将钙离子紧密包裹，生成稳定的螯合物。由于EDTA与钙形成的螯合物稳定性常数高，使得钙从鱼鳞钙盐结构中脱离，以螯合物形式存于溶液中，实现脱钙。正是基于这个原理，EDTA法在应用时能与鱼鳞中的Ca2+、Mg2+进行螯合，形成络合物溶解在溶液中，最终实现去除Ca2+、Mg2+的效果。Bhagwat等[15]先用EDTA对鲤鱼鱼鳞进行脱钙处理，再用乙酸处理得到胶原蛋白的产率为9.79%（基于湿重）。然而，不同的螯合方式及条件对各类鱼鳞的脱钙效果有所差异。在实际操作中，需要依据鱼鳞的具体特性、预期的脱钙程度以及经济成本、环保要求等多方面因素，全面权衡后选取最适配的螯合脱钙策略。
超声波辅助脱钙主要通过在液体介质中，超声波传播产生空化效应，其负压半周期使微小气泡膨胀，正压半周期令气泡急剧收缩、崩溃，在局部产生数千摄氏度高温和数百兆帕压力，冲击破坏鱼鳞表面钙盐晶体结构，增加钙盐与脱钙剂接触面积，利于脱钙反应进行。同时，超声波的振动能加速传质，促进脱钙剂分子向鱼鳞表面扩散，以及反应产物从鱼鳞表面扩散到溶液主体，减小液体边界层厚度。此外，超声波产生的局部高温高压环境，可改变反应活化能，降低酸与钙盐等脱钙反应的能量障碍，其机械作用还能使反应物分子充分混合，多方面促进脱钙反应高效进行。李文凤等[16]采用超声波辅助柠檬酸法对黄花鱼鱼鳞脱钙工艺进行优化，在料液比1∶19 （g/mL）、柠檬酸浓度10.5%、超声时间65 min的条件下脱钙率高达99.18%。不同物理辅助手段与脱钙剂组合，对不同鱼鳞脱钙的效果各异。实际应用时，需综合考虑鱼鳞品种、处理规模、设备条件以及成本效益等因素，精准筛选出最契合的物理辅助脱钙方案，以满足不同场景下的脱钙需求。
2 胶原蛋白抗氧化肽的提纯方法
2.1 胶原蛋白抗氧化肽的提取方法
常见的胶原蛋白的提取方法主要有碱提取法、酸提取法、盐提取法、酶提取法、热水提取法以及超声波辅助提取法等，这些方法的原理都是根据胶原蛋白自身所具有的特性，通过改变胶原蛋白所处的溶液环境，从而能够完成胶原蛋白的提取。
2.1.1 酸提取法
酸提取法是借助酸性溶液对胶原蛋白进行提取。其基本原理是利用低离子强度的酸性介质，去破坏胶原与其他分子之间的盐键和希夫碱，使胶原纤维分离。在酸提取法中，常用的酸有乙酸、柠檬酸、盐酸以及乳酸等，通过此方法提取得到的产物，被称作酸溶性胶原蛋白。李翠娟[17]使用不同浓度的盐酸提取胶原蛋白，经过优化得出在盐酸浓度0.6 mol/L、料液比6∶100 （g/mL）、脱钙时间3 h的条件下，胶原蛋白提取率最高。苏俊豪等[18]用乙酸从黄河鲤鱼鳞片中提取胶原蛋白，在最佳条件下最高提取率为4.2%。Liu等[19]通过氢氧化钠和柠檬酸相辅助的方法从鲈鱼鳞片中提取胶原蛋白。常见的酸提取法见表2。
表2 酸提取法对胶原蛋白提取率的影响
Table 2 Effect of acid extraction methods on collagen extraction yield
注：—表示文献中未提及。
提取剂提取率/%原料优点缺点参考文献盐酸70.6淡水鱼鳞提取效率较高强酸腐蚀设备，可能残留有害物质[17]乙酸4.2黄河鲤鱼鱼鳞安全性高，环境友好，提取率偏低，工业化价值有限[18]减少对胶原蛋白的破坏柠檬酸—鲈鱼鳞片强螯合能力提升纯度成本较高且工艺复杂[19]乙酸21.92；22.20；巨骨舌鱼腹部皮肤；——[20]31.43巨骨舌鱼腰部皮肤；巨骨舌鱼尾部皮肤
在酸提取法的研究中，不仅需关注提取率，还要注重产物的质量和性能。虽然柠檬酸提取的胶原蛋白提取率并非最高，但提取出的胶原蛋白在流变学特性、热稳定性等方面表现出色，更适合用于某些特定的工业应用，如食品添加剂和生物医学材料等。乳酸作为一种天然有机酸，酸性较弱，对胶原蛋白结构破坏较小，所得产物活性高，在提取鱼鳞胶原蛋白时，除了具有一定的提取效果，还能赋予产物较好的生物相容性和可降解性，在生物医学领域具有潜在的应用价值。盐酸提取法虽可行，但强酸环境会导致胶原蛋白部分结构被破坏，影响其功能特性和生物活性，在实际应用方面所取得的效果不够理想。
在后续的研究中，一方面可以继续探索不同酸的组合使用或与其他提取方法相结合，提高提取率的同时减少对胶原蛋白结构的破坏。例如，可以尝试将酸提取法与酶法提取相结合，利用酶的特异性提高提取效率和产物品质。另一方面，可以深入研究提取过程中的工艺参数优化，如酸的浓度、液料比、提取时间等，来探究最佳的提取条件，从而提高胶原蛋白的提取效果和品质。还可以尝试在酸提取过程中添加一些辅助剂，如抗氧化剂、表面活性剂等，以保护胶原蛋白的活性和提高提取效率。
2.1.2 碱提取法
碱提取法是采用碱液当作媒介，从原料里把胶原蛋白中萃取出来。在这个操作过程中，常用的处理剂主要是石灰、氢氧化钠以及碳酸钠等碱性物质。因为胶原蛋白一旦处在碱液环境里，就会发生肽键水解反应，会让产物相对分子质量大幅下降，从而破坏产物原有的三螺旋结构。温慧芳等[21]以氢氧化钙溶液作为提取剂对胶原蛋白进行提取，发现在料液比1∶10 （g/mL）、添加1.6%的Ca（OH）2、70 ℃条件下提取9 h，提取率可达到79.67%。韩玮等[22]也利用氢氧化钠溶液成功提取了罗非鱼皮中的胶原蛋白。常见的碱提取法见表3。
表3 碱提取法对胶原蛋白提取率的影响
Table 3 Effect of alkaline extraction methods on collagen extraction yield
注：—表示文献中未见该项数据。
提取剂提取率/%原料优点缺点参考文献氢氧化钙79.67鮰鱼皮提取效率高、提取周期短破坏胶原蛋白三螺旋结构，可能导致产物降解为明胶[21]氢氧化钠溶液—罗非鱼皮提取能力强，工艺成本较低去除残留碱液成本较高[22]
碱提取法在胶原蛋白提取中具有一定的特点和利弊。碱液能有效分解和溶解细胞外基质中的其他组分，实现胶原蛋白有效释放，提高提取效率；可以去除蛋白质以外的杂质如糖类、脂类以及部分核酸残留物，提升胶原蛋白提取物的纯度。但是胶原蛋白在碱性环境中会发生肽键水解反应，导致产物的相对分子质量显著降低，难以保持原有的三螺旋结构；在强碱条件下，会破坏胶原蛋白的三级和四级结构，降低其功能特性及生物活性；长时间或高浓度碱处理可能引发胶原蛋白降解生成小分子片段，提取后需要进行酸碱中和以及进一步的纯化处理，增加了工艺复杂性[23]。
后续研究的过程中可以探索更温和的碱性物质或优化碱液处理的工艺参数，如浓度和处理时间，减少其对胶原蛋白结构的破坏。或者结合其他提取方法，如在碱提取后采用酶提取法或酸提取法进一步处理，以提高胶原蛋白的含量和稳定性。在碱提取初步打破原料组织架构、释放部分胶原蛋白后，选用特定的蛋白酶进行二次处理，可依据酶的专一性切割特性，精准去除胶原蛋白分子周边的杂蛋白，进一步提升纯度。结合酸提取法，则可利用酸性环境对金属离子杂质的螯合去除能力，净化胶原蛋白产品，同时调节其电荷特性，优化在不同应用场景下的溶解性与稳定性。
2.1.3 酶提取法
酶提取法是在成功提取酸溶性胶原蛋白的基础上，通过引入特定的蛋白酶，对胶原分子进行精准而有限度的降解处理。这一过程中，酶的作用主要集中在切割胶原分子的末端肽段，从而使得胶原分子的主体部分得以在酸性环境中充分溶解。在具体试验中，酶通常选择胃蛋白酶，以乙酸为酸性介质，为酶促反应提供适宜的环境条件。经过酶法提取后，所得的产物被命名为胃蛋白酶促溶性胶原蛋白，该产物具有优良的生物相容性和生物活性。常见的酶主要有胃蛋白酶、碱性蛋白酶及木瓜蛋白酶等。苑园园等[24]以脱钙鱼鳞粉为原料提取胶原蛋白，得到最佳工艺条件为胃蛋白酶添加量6%、料液比1∶50 （g/mL）、水解时间2 h。曾丽琴等[25]利用碱性蛋白酶处理沙丁鱼鱼鳞确定提取胶原蛋白的最佳条件，碱性蛋白酶在胶原蛋白提取过程中展现出较快的提取速度、相对较低的成本以及稳定的酶活性。在碱性条件下，该酶能够有效地降解组织中的非胶原蛋白成分，从而有助于实现高纯度胶原蛋白的提取。然而，碱性蛋白酶提取过程中可能会引发胶原蛋白结构的部分损失，并且其对环境的要求也相对较高。Maliha等[26]采用木瓜蛋白酶从皮革废料中提取胶原蛋白，以4%粗木瓜蛋白酶水解5%脱灰粉末，在60 ℃和pH5条件下提取6 h，胶原蛋白提取率达到最高水平。常见的酶提取法见表4。
表4 酶提取法对胶原蛋白提取率的影响
Table 4 Effect of enzymatic extraction methods on collagen extraction yield
注：—表示文献中未见该项数据。
提取试剂提取率/%原料优点缺点参考文献胃蛋白酶—脱钙鱼鳞粉高效保留胶原蛋白活性，ACE抑制率高成本较高，需严格控制pH值和温度[24]碱性蛋白酶43.44±1.59沙丁鱼鱼鳞广谱适用性，脱脂能力强易受温度波动影响，需额外纯化[25]木瓜蛋白酶—皮革废料环保、天然来源提取率低，适用性受限[26]风味酶28.51大西洋鲑提取率高，可去除原料的腥味成本较高，反应条件苛刻[27]无花果酶0.85，13.08～17.83鳙鱼头部，鳙鱼生鱼片特异性强提取率低，原料利用率有限[28]
酶提取法基于酸溶性胶原提取原理，引入特定蛋白酶，通过精准作用于胶原分子末端肽段，促使胶原主体于酸性环境下溶解，进而获取具备良好生物相容性及活性的胶原蛋白。在实际操作流程中，常选取乙酸作为胃蛋白酶的酸介质。诸多研究针对不同原料展开探索，所获最佳提取条件存在差异，涉及酶添加量、料液比、水解时间、酸浓度等关键参数。具体而言，胃蛋白酶提取具有条件温和、特异性显著、易于调控且环境友好等特性，但其提取速率较慢、酶成本偏高、稳定性欠佳，易出现失活现象；碱性蛋白酶提取速度快、成本低廉、酶活性稳定，对提升胶原蛋白纯度有所助益，不过该方法易造成胶原蛋白结构受损，且对环境要求较为严苛；木瓜蛋白酶同样可实现有效提取，具有提升胶原蛋白提取率的作用，还能赋予产物一定的水容量与泡沫稳定性优势[29]。
现阶段酶的种类较为有限，且各类酶存在突出缺陷，因而迫切需要研发兼具高效、低成本、高稳定性及环境友好特性的新型酶制剂，后续可以研发新型酶制剂或对现有酶进行改良，通过跨学科协作，融合生物技术、化学工程、材料学等多学科知识，提高酶的活性和稳定性，降低成本和失活风险。同时，积极探索酶提取法与其他提取方法的结合，如与酸提取法、超声波辅助法等相结合，发挥各自优势，提高提取效率和质量。进一步优化提取工艺参数，如酶的用量、反应时间、温度等，以减少胶原蛋白结构损失，同时提高提取率。加强对提取过程中环境因素的控制和优化，满足碱性蛋白酶等对环境的要求，确保提取过程的稳定性和可靠性。
2.1.4 盐提取法
盐法提取胶原蛋白的原理并不复杂，主要依靠盐离子破坏胶原分子和其他分子之间的相互作用，将胶原蛋白提取出来。在中性条件下，当盐离子的浓度达到一定程度，胶原蛋白就会溶解。同时胶原的溶解情况会受到中性盐效应的影响，有些盐能让胶原更稳定，可有些盐却会降低胶原的构象稳定性，从而对胶原蛋白的提取过程产生不利的影响。Park等[30]通过干盐法和湿盐法加速猪皮胶原蛋白的水解，产生更多低分子量明胶，并改善凝胶强度、黏度和乳化性。然而，由于该技术在盐中的溶解度较低，从而导致该技术在胶原蛋白提取中的应用中会受到限制，所以不适用来提取胶原蛋白。综上所述，盐法提取胶原蛋白利用盐离子破坏胶原分子与其他分子的作用实现提取，虽然Park等[30]的研究表明干盐法和湿盐法能加速猪皮胶原蛋白水解并改善其相关性能，但因其在盐中溶解度较低，致使该技术在胶原蛋白提取领域的广泛应用面临挑战，未来需致力于突破溶解度难题，以拓展其应用前景。
2.1.5 热水提取法
热水提取法在胶原蛋白提取方面优势明显，它的提取条件比较容易实现，操作步骤也不复杂，提取过程中造成的损失量少，而且得率还比较高，更重要的是，它能在很大程度上维持胶原蛋白原本的结构和生理活性，与其他提取法相比更适合来提取胶原蛋白，但是热水提取法的提取效率较低，需要更长的提取时间并且高温可能对胶原蛋白的结构造成一定程度的损伤，影响其性质和功能。常见的热水提取法见表5。
表5 热水提取法对胶原蛋白提取率的影响
Table 5 Effect of hot water extraction methods on collagen extraction yield
原料提取率/%优点缺点最佳提取条件参考文献乌鱼鱼鳞31.72～50.97温度与提取率关系明确提取率波动较大，能耗较高当提取温度从60 ℃逐步升高到100 ℃，[31]得率从31.72%增加到50.97%青鱼鱼鳞70.71提取率较高，原料易获取提取条件较为苛刻固液比1∶14 （g/mL），浸提2.5 h，温度75 ℃[32]鳕鱼皮83.75提取率高，胶原蛋白质量好原料来源有限，预处理过程较复杂pH5.0，温度为42 ℃，提取时间为25 h[33]草鱼鱼鳞45.47原料来源广，成本较低提取率相对较低，提取过程可能产生鱼鳞∶水=1∶20 （g/mL），121 ℃提取15 min[34]较多杂质
黄丽金等[31]采用热水法提取乌鱼鱼鳞胶原蛋白，当提取温度从60 ℃逐步升高到100 ℃，乌鱼鱼鳞表面的破损越来越严重，鱼鳞胶原蛋白得率从31.72%增加到50.97%。李敏[32]采用热水法对青鱼鱼鳞胶原蛋白进行提取，在固液比1∶14 （g/mL）、75 ℃条件下浸提2.5 h时的提取率达70.71%。赵睿等[33]以鳕鱼皮为原料，采用热水法提取胶原蛋白，得到最佳提取工艺条件为pH5.0、提取温度42 ℃、提取时间25 h。钱曼等[34]在鱼鳞与水料液比1∶20 （g/mL）、121 ℃条件下提取15 min，对草鱼鱼鳞胶原蛋白提取率达45.47%。综合来看，热水提取法虽具备反应条件适宜、操作步骤简单、产物损失量少、得率较高以及能维持胶原蛋白结构和生理活性等优点，然而其提取效率偏低、耗时较长，高温还可能损伤胶原蛋白结构，从上述对不同种类鱼鳞或鱼皮的试验数据中可明显看出提取效果受多种因素影响。在实际应用时，需谨慎权衡该方法的利弊，依据原料特性、目标产物质量与产量要求等，精准调控提取条件，以实现优势最大化，同时规避其固有缺陷对提取效果的不利影响。
2.1.6 其他辅助提取法
由于传统的酸法、碱法、酶法以及热水提取法存在生产周期较长、提取效率较低的问题。为此，近年来，研究人员持续探索更优的胶原蛋白提取办法。经过不断尝试，已成功将超声波技术和超高压技术应用于胶原蛋白的提取过程中，这两项技术可以有效缩短生产周期，进一步提高提取效率，具体见表6。
表6 其他辅助提取法对胶原蛋白的影响
Table 6 Effect of other auxiliary extraction methods on collagen extraction yield
注：—表示文献中未提及。
方法原料优点缺点参考文献超声波辅助乙酸提取肌腱胶原蛋白显著缩短提取周期；提高得率—[35]超声波辅助胃蛋白酶提取肌腱胶原蛋白提高提取率，缩短提取时间，不改变胶原蛋白结构—[35]超声波处理—缩短提取时间，增加了胶原蛋白的热稳定性—[36][37][12]离子液体结合类导体屏蔽家蚕蛹提高了研究的科学性和效率离子液体种类有限、离子液体的回收成[38]模型提取本高、对环境有潜在影响酶辅助和超声波辅助提取燕窝提升提取效率，大幅缩短提取时间对设备和操作要求更高、纯化难度大、[39]成本高、时间长
Chanmangkang等[35]使用超声波辅助乙酸和超声波辅助蛋白酶提取金枪鱼肌腱胶原蛋白，能够显著缩短提取周期，提高提取率。Zheng等[36]和Ma等[37]采用超声波辅助法破坏胶原蛋白原纤维，从而促进酸和酶处理，缩短提取时间，同时增加了提取的胶原蛋白的热稳定性。
其他辅助提取方法中，超声波技术与超高压技术的应用能有效缩短传统提取方法的提取时间。例如超声波辅助乙酸提取鲈鱼皮胶原蛋白能够显著缩短了提取周期，超声波协同胃蛋白酶在提高提取率的同时不改变胶原蛋白结构，以及超声波辅助提取深海红鱼皮酶溶性胶原蛋白虽然会改变胶原蛋白部分理化结构，但是能够缩短提取时间，提高提取效率。超高压技术预处理方法能提高凝胶强度并缩短预处理时间，但是超声波辅助提取可能会改变胶原蛋白部分理化结构，影响其性能。
后续可以针对超声波的参数设置，进一步展开研究，寻求在缩短提取时间的同时尽量减少对胶原蛋白理化结构的影响。通过优化超高压技术的工艺条件，寻找既能提高凝胶强度和缩短预处理时间，又能保证较高提取率的最佳工艺条件。同时也可以考虑将超声波技术与超高压技术结合使用，再与传统提取方法进行合理的组合，以充分发挥各自的优势，同时克服其不足之处，从而更好的对胶原蛋白进行提取。
2.2 抗氧化肽的分离纯化方法
常见的抗氧化肽的分离纯化方法主要有超滤法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、反相高效液相色谱法，具体见表7。
表7 抗氧化肽分离纯化方法对比
Table 7 Comparison of antioxidant peptide separation and purification methods
分离纯化方法原料优点缺点参考文献操作简便、设备成本低、且易于实现工业分离精度不足、膜易堵塞、不规则肽影响截留效果[38-40]超滤法抗氧化肽放大离子交换抗氧化肽高选择性分离，处理量大，反应条件和pH值要求严格，[40]色谱法适于规模化纯化对中性或电荷相似肽分离效果差凝胶过滤抗氧化肽分离范围广，操作相对简单，分离时间长；对性质相似、分子量差异小的抗氧化肽，[41-42]色谱法对肽的活性影响较小分离效果欠佳；凝胶介质成本高反相高效液抗氧化肽分离效率高，重复性好，结果可靠，运行成本高，有机溶剂消耗大；对样品纯度及前处理要求苛刻，[41-42]相色谱法分离条件精确；可与多种检测器联用色谱柱易堵塞；有机溶剂会致使部分抗氧化肽变性失活
2.2.1 超滤法
超滤是一种膜分离技术，它依靠压力差来实现分离操作。通常情况下，超滤膜能够截留的分子量范围处于1～10 000 kDa之间。超滤分离具有操作方便、处理量大、处理时间短、产品回收率高、滤膜可反复多次使用、不改变产品的性能和活性、分离条件温和等优点。目前广泛应用于大分子类物质的浓缩和脱盐、大分子杂质脱除、大分子与中等分子之间的分级分离与纯化，且大多数都能实现工业规模的应用[43]。如庄永亮等[44]采用截留相对分子量分别为1 kDa和3 kDa的超滤膜对海蜇胶原蛋白酶解产物进行分级分离，有效提高了产物抗氧化活性，其中相对分子量小于1 kDa的超滤组分抗氧化活性最强。Ortizo等[45]研究罗非鱼内脏蛋白时使用超滤法对水解产物进行分离分级。
超滤法具有操作简便、设备成本低、易于工业放大的优势，能依据分子量差异快速筛选分离，还支持高通量处理；但也存在分离精度不足，难以分离相近分子量肽，膜易堵塞需频繁维护，以及不规则肽可能影响截留效果等问题。
2.2.2 离子交换色谱法
离子交换色谱的原理是离子交换剂放置在水溶液中时会膨胀。在此过程中，吸附剂骨架上的官能团所携带的交换离子会解离。这些解离的离子可以在吸附剂的网络结构内自由移动。如果溶液中还有其他相同类型的离子，这些离子也会扩散到网络吸附剂中。一旦这两个离子的浓度差相差较大，就会产生驱动力，导致吸附剂和溶剂主体之间产生等量交换。离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷，因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换层析时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离[43]。
2.2.3 凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法的原理是不同溶质进入分离介质的程度不同，在液相中的保留时间不同。凝胶的孔径与溶质分子大小的关系决定了色谱过程中溶质在色谱柱中的保留时间，由于保留时间不同可以分离出不同的物质。每种凝胶介质都有一个特定的分子量分类范围，其分类范围是凝胶介质的一个重要参数。根据其分级范围，溶质分子可分为3 类：1）相对分子量大于分级范围上限的分子称为全排阻分子，其只能从凝胶颗粒间隙中穿过，且通过颗粒间隙时阻力最小，过程最短，最先从色谱柱中洗脱。2）相对分子量低于分级范围下限的分子称为全渗透分子，它们完全进入凝胶颗粒网，洗脱时阻力最大，过程最长，是最后从层析柱中被洗脱的。3）相对分子质量处于分级范围内的分子则是部分渗透分子，这些分子就是该凝胶介质能够有效分离的对象。凝胶色谱法具有分离条件温和、产品回收率高、生物活性好、分离面宽等优点[46]。
2.2.4 反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法是一种液相色谱法，基于溶质和固定相之间的疏水相互作用，对物质进行分离和分析。在反相高效液相色谱中，使用相对高极性的液体作为流动相，与非极性固定相相结合。反相高效色谱是目前高效液相色谱分离中应用最广泛的分离方式。
这里提到的“正相”和“反相”主要是根据固定相和流动相的相对极性来区分的。传统的配分色谱与反相色谱的不同之处在于，它使用极性相对较高的材料作为固定相，而使用极性相对较低的溶液作为流动相。在色谱操作中，样品中极性较低的组分由于其分布系数较大，首先随流动相流出；极性较高的组分的分布系数较小，会在固定相停留较长时间才流出。而反相层析刚好与此相反，其固定相非极性强而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低的后被洗脱[43]。
2.2.5 其他分离方法
针对抗氧化活性肽的分离纯化，除上述方法外，还有双水相萃取法[47]、亲和层析[48]、聚丙烯酰胺电泳法[49]、毛细管区带电泳法[50]、毛细管等电聚焦电泳[51]、毛细管凝胶电泳[52]和胶束电动毛细管层析[53]，但关于这些方法分离纯化抗氧化肽的研究报道较少，可作为下一步的研究方向。
综上所述，抗氧化肽的分离纯化手段丰富多样，每种方法皆呈现出独特的优势与局限。凝胶过滤色谱法基于分子尺寸差异实现不同分子量抗氧化肽的分离，操作简易，条件温和，对肽的活性影响较小。然而，其分离过程流速相对缓慢，对于分子量相近的抗氧化肽，分辨率欠佳，且凝胶介质成本较高，限制了其大规模应用。离子交换色谱法利用肽分子的电荷特性进行分离，具备良好的选择性和较大的处理量，适用于大规模纯化。但该方法对缓冲液体系的选择及pH值的精确控制要求极为严格，对于电荷性质相似的抗氧化肽，分离难度较大，且在分离过程中可能因吸附作用导致肽的损失，影响回收率。反相高效液相色谱（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法以其卓越的分离效率和良好的重复性著称，能够实现复杂样品中抗氧化肽的高分辨率分离，并可与多种灵敏的检测器联用，为分析检测提供便利。但此方法依赖昂贵的仪器设备，运行成本高昂，对样品的纯度和前处理要求极高，同时，在分离过程中使用的有机溶剂可能导致部分抗氧化肽的结构改变，从而使其活性丧失。超滤法通过选择合适孔径的超滤膜，依据分子量大小对抗氧化肽进行初步的分级筛选，操作简便，易于放大至工业规模。但该方法的分离精度有限，难以有效分离分子量相近的抗氧化肽，且超滤过程中膜污染问题较为常见，需要定期清洗或更换膜组件，增加了运行成本。除了前面提到的传统方法，还有不少技术也在抗氧化肽的分离纯化领域崭露头角，比如双水相萃取法、亲和层析，还有聚丙烯酰胺电泳法、毛细管区带电泳法、毛细管等电聚焦电泳、毛细管凝胶电泳以及胶束电动毛细管层析等。这些技术各自都蕴含着独特的应用潜力，有望为抗氧化肽的分离纯化工作带来新的突破和进展。尽管目前针对这些方法在抗氧化肽分离方面的研究报道相对较少，但它们为进一步拓展和优化抗氧化肽的分离纯化策略提供了新的方向。
在实际应用中，分离纯化方法的选择需紧密结合样品的物理化学性质、目标抗氧化肽的特性以及研究的具体需求，通过综合考量各方法的优缺点，设计出最优的分离流程，以实现高效、精准的分离纯化目标。随着科学技术的迅猛发展，新型的分离纯化技术与分析方法不断涌现，这无疑将为抗氧化肽的深入研究及其在食品、医药、化妆品等领域的广泛应用提供更为坚实的技术支撑。
3 抗氧化肽结构鉴定
3.1 质谱分析法
质谱分析法是一种高度精密的分析技术，其通过将多肽分子转化为离子并进行质谱分析，能够提供详尽的分子结构以及相对丰度信息[54]。这种方法的优点十分显著，它不仅具备高分辨率，能精准测定质量，还能够获取多肽的氨基酸序列和一级结构信息。但该方法也存在一定的局限性，其中较为突出的就是对数据库的依赖程度较高。通常情况下，质谱分析法需将试验结果与已知的蛋白质数据库进行比对，以确定多肽的序列[55]。即便质谱法存在依赖数据库这样的局限性，但它在多肽分析领域的地位依旧举足轻重。特别是在研究抗氧化肽的序列和结构时，质谱分析法能给出许多关键信息，这些信息对于深入探究抗氧化肽的生物活性，挖掘其在实际应用中的潜力有很大的帮助，能够更清楚地了解抗氧化肽在不同领域可能发挥的作用。
对蛋白质与多肽的结构进行分析与鉴定的常用方法有连续流快原子轰击质谱（cntinuous-flow fast atom bombarment mass spectrometry，cf-FAB）法、电喷雾离子化质谱法（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）以及基质辅助激光解吸/离子化 -飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF）法。它们在原理、性能及应用上各有特点，具体见表8。
表8 常见质谱分析法
Table 8 Common mass spectrometry analysis methods
质谱方法原理优点缺点参考文献连续流快原子弱离子化技术，将肽类离子化为[M+H]+或[M-H]-中等分辨率；可与其他分离该技术精确度偏低，且单独使[56]轰击质谱法形式，常与高效液相色谱（high performance liquid 技术结合用于鉴定肽链氨基用时功能受限，需与其他技术chromatography，HPLC）、毛细管区带电泳等联用酸序列；适合少量样品分析联用电喷雾离子化质使蛋白质或多肽产生多价离子化，可分析相对分子分析大分子蛋白；精确度在设备较为复杂，对样品的纯度[57]谱法质量达1×105 Da的蛋白0.01%左右；适合分析复杂蛋等要求较高，样品制备过程相白质或多肽混合物对繁琐基质辅助激光解通过激光使与基质混合的蛋白质或多肽离子化，根适合蛋白质多肽混合物质相对样品的结晶条件要求较高；[58]吸/离子化-飞行据离子飞行时间测定相对分子质量对分子质量测定，灵敏度和侧重于相对分子质量测定；对时间质谱法分辨率较高复杂氨基酸序列分析有局限
cf-FAB是一种弱离子化技术，将肽类离子化为[M+H]+或[M-H]-形式，其分辨率处于中等水平，精确度大于0.2 amu，流速一般在0.5～1.5 µL/min。该技术常与HPLC、毛细管区带电泳等联用，以此实现对肽链氨基酸序列的分离鉴定。其优势在于可与其他分离技术结合分析少量样品，但精确度相对有限，单独使用时在氨基酸序列鉴定方面存在局限。与ESI-MS和MALDI-TOF相比，cf-FAB在离子化方式上较为温和，这使得它对肽类结构的破坏较小，适合分析对结构变化敏感的样品。不过，其在分析大分子蛋白的能力上远不及ESI-MS，且在相对分子质量测定的准确性和灵敏度方面也逊于MALDI-TOF。
ESI-MS能够使蛋白质或多肽产生多价离子化，可对高达1×105的相对分子质量蛋白进行分析，分辨率在1 500～2 000 amu，精确度约0.01%。该技术在分析复杂蛋白质或多肽混合物时优势明显。与cf-FAB相比，ESI-MS可以处理更高分子量的样品，且分辨率和精确度都较高。与MALDI-TOF相比，ESI-MS产生的多价离子有利于分析复杂混合物中的各组分，但ESI-MS设备复杂，对样品纯度要求高，样品制备繁琐。
MALDI-TOF是精确测定蛋白质或多肽相对分子质量的核心技术，尤其适用于蛋白质多肽混合类物质相对分子质量的测定，具有高灵敏度和分辨率。与液相色谱联用能高效鉴定多肽，多种质谱技术串联时，可同时测定多肽相对分子质量和氨基酸序列。相较于cf-FAB，MALDI-TOF在相对分子质量测定的准确性和灵敏度上具有显著优势；与ESI-MS相比，MALDI-TOF对样品结晶条件要求严苛，对杂质敏感，但在处理混合样品时，能更快速地给出相对分子质量信息。
综上所述，在实际科研中，需依据样品特性（如分子量大小、纯度、是否为混合物等）、分析目的（侧重分子量测定、氨基酸序列分析或二者兼顾）及试验条件（设备可用性、成本、时间限制等），综合考量并合理选择质谱技术，以满足蛋白质与多肽结构分析与鉴定的复杂需求。
3.2 不同方法联用
纯化多肽的一级结构通常通过液相色谱串联质谱、电离子喷雾质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行鉴定。上述3 种方法各有其独特的优势、局限性和适用场景。然而，在深入解析抗氧化肽的结构和功能关系时，仅采用单一的分离和鉴定方法通常难以满足研究需求。因此，在进行研究时，有必要将不同的分离方法与实际情况相结合，从而能够达到更好的鉴定效果。
4 结语
本文综述了现有关于鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的制备、纯化及其抗氧化活性评价相关研究。鱼鳞脱钙过程中酸法、螯合法、物理辅助法各有利弊，实际应用需综合考量多种因素，未来多种方法的交叉融合是提升脱钙效率与质量的关键方向。胶原蛋白抗氧化肽提取方法多样，其中酸、碱、酶、盐、热水及其他辅助提取法各具特点，后续研究应聚焦于方法联用、工艺参数优化及辅助剂添加等方面，以增强提取效果。在抗氧化肽分离纯化方法中，超滤法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法以及反相高效液相色谱法等各有优劣，实际操作时需依样品与目标肽特性及研究需求合理选择或组合，同时关注新兴技术发展。结构鉴定方面，质谱分析法是核心，cf-FAB、ESI-MS、MALDI-TOF等技术原理与性能各异，应根据样品及试验条件恰当选用或联用。总体而言，鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽研究现状虽有进展，但仍面临挑战与机遇，后续需持续优化各工艺环节、加强技术融合创新、深入探究结构功能关系并完善活性评价体系，以推动其在多领域广泛应用，实现鱼鳞资源高值化利用与水产加工产业可持续发展。
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