连翘为木犀科连翘属植物连翘的干燥果实，具有消肿散结、疏散风热等多重功效[1]。现代研究表明，连翘还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝、神经保护等药理作用[2-6]。连翘叶为植物连翘的叶子。连翘叶的化学成分与连翘果实十分接近，甚至连翘苷、连翘酯苷、连翘脂素等活性成分的含量更高[7-8]。连翘嫩叶可制成茶用于日常饮用，有资料记载自汉代起连翘叶茶就被人们当作茶饮，有延年益寿、美容养颜等功效[9]。连翘红茶是连翘叶茶目前主要的茶饮品种之一。
茶多酚类物质是从茶叶中提取的多羟基酚类化合物的总称，是决定茶叶风味和品质的主要物质[10]，具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、降血脂、降血糖以及抗病毒等多种生物活性[11]。目前，茶多酚的提取主要是利用水、有机溶剂进行提取，虽然提取方法简单，但是纯度较低、提取成本高且不环保[12]。低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）作为一种新型绿色溶剂，在2003年首次被Abbott等人所提出[13]。DES具有低蒸气压、不易燃性、液体范围宽、无毒性、易制备、可生物降解、可系统化设计的化学结构等特性，这些特性使DES有机会成为传统有毒性有机溶剂的绿色替代品[14]。然而，DES蒸气压低、不易挥发，在目标化合物中的分离难度较大[15]。
近年来，可切换低共熔溶剂的应用越来越广泛。该类低共熔溶剂能在环境条件（温度、pH值、CO2、光照等）改变的情况下状态发生变化（亲/疏水转化、极性/非极性转化、溶液/沉淀的转化等）[16]。Cai等[17]以烷醇胺类作为氢键受体，甲酚类作为氢键供体制备温度响应型低共熔溶剂用于提取灵芝多糖。Zhang等[18]以饱和脂肪酸作为氢键受体，芳樟醇作为氢键供体制备可切换低共熔溶剂用于提取小米多酚。Yan等[19]以氨基醇作为氢键受体，酚类化合物作为氢键供体制备温度响应型低共熔溶剂用于同时提取五味子中的木脂素和多糖。这些研究显示使用可切换低共熔溶剂提取目标化合物，提取率高且目标化合物与提取溶剂分离效果好。
本研究采用超声波辅助可切换低共熔溶剂提取连翘红茶多酚，利用单因素试验和响应面试验优化提取工艺，以期为连翘红茶多酚的高效、绿色、可持续提取提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
连翘红茶：山西农业大学天然活性成分提取分离应用及农产品精深加工实验室自制，粉碎后过60 目筛，备用。氢氧化钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；没食子酸：上海蓝季科技发展有限公司；正辛酸：山东科源生化有限公司；芳樟醇：上海麦克林生化科技有限公司；无水碳酸钠：天津市天力化学试剂有限公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司；盐酸：山西同杰化学试剂有限公司；无水乙醇：天津市方大同正化工有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电子恒温水浴锅（DZKW-4）：北京中兴伟业仪器有限公司；高速冷冻离心机（5417R）：德国艾本德股份公司；静音智能超声波清洗器（KS-500XDS）：昆山洁力美超声仪器有限公司；分光光度计（Cary 60 UV-Vis）：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 可切换DES的制备
将芳樟醇作为氢键供体，正辛酸作为氢键受体，以1∶2的物质的量比混合，在80 ℃下不断搅拌，直至形成均匀透明的液体，该液体为合成的疏水性可切换DES。然后，将4% NaOH溶液以4∶1的体积比加入到合成的疏水性可切换DES中，将其转换为亲水性可切换DES。
1.3.2 超声波辅助可切换DES提取连翘红茶多酚
准确称取0.03 g连翘红茶粉末置于2 mL离心管中，加入1.2 mL亲水性可切换DES，充分混合。在60 ℃下超声波辅助提取40 min。提取完成后8 000 r/min离心15 min，收集上清液。
1.3.3 对照试验
将水和60%乙醇溶液作为提取溶剂进行对照试验。按照1.3.2的提取方法，进行连翘红茶多酚的提取。
1.3.4 连翘红茶多酚含量的测定
连翘红茶多酚含量的测定参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[20]。连翘红茶多酚得率（L，mg/g）按公式（1）计算。
式中：C为连翘红茶多酚的质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；m为连翘红茶粉末质量，g。
1.3.5 单因素试验设计
以连翘红茶多酚得率为评价指标进行单因素试验，考察料液比[1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]、超声温度（40、50、60、70、80 ℃）、超声时间（20、30、40、50、60 min）对连翘红茶多酚得率的影响。
1.3.6 响应面试验设计
根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计连翘红茶多酚提取工艺优化试验。以连翘红茶多酚得率为响应值，进行三因素三水平的响应面试验分析，响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments
因素水平A料液比/（g/mL）B超声温度/℃C超声时间/min-11∶30603001∶40704011∶508050
1.3.7 可切换DES的回收与再利用
将1 mol/L HCl溶液以3∶5的体积比加入提取液中，将亲水性可切换DES转换为疏水性可切换DES，8 000 r/min离心5 min，分别收集上层DES相和下层水相。上层疏水性可切换DES按照1.3.1的方法重新转换为亲水性可切换DES后即可用于提取新的样品。
1.4 数据分析
所有试验均重复3 次，使用Excel软件统计分析数据，Origin 2021软件绘图，Design-Expert 13软件进行响应面分析。
2 结果与分析
2.1 对照试验
将水、60%乙醇溶液和可切换DES作为提取溶剂提取连翘红茶多酚，并进行比较，结果如图1所示。
图1 提取溶剂对连翘红茶多酚得率的影响
Fig.1 Effect of extraction solvent on the yield of Forsythia suspensa red tea polyphenols
由图1可知，使用可切换DES提取连翘红茶多酚得率较高，约为水的2.65倍、60%乙醇溶液的1.31倍。
2.2 单因素试验结果
料液比、超声时间、超声温度对连翘红茶多酚得率的影响见图2。
图2 各因素对连翘红茶多酚得率的影响
Fig.2 Effects of various factors on the yield of Forsythia suspensa red tea polyphenols
由图2（a）可知，料液比为1∶20～1∶60 （g/mL）时，连翘红茶多酚得率呈先上升后下降的趋势，并在1∶40 （g/mL）时达到最大值（76.722 8 mg/g）。可能是因为料液比为1∶40 （g/mL）时多酚的溶出已经达到饱和，当料液比为1∶50～1∶60 （g/mL）时反而会使其它杂质溶出[21]。因此，选择料液比为1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL）进行后续响应面试验。
由图2（b）可知，随超声时间延长，连翘红茶多酚得率呈现上升趋势，并在40 min时达到最大值（76.903 7 mg/g），之后随超声时间延长，连翘红茶多酚得率呈现下降趋势。可能是因为超声时间过长，溶出的多酚易被氧化或者结构被破坏[22]。因此，选择超声时间为30、40、50 min进行后续响应面试验。
由图2（c）可知，随着超声温度升高，连翘红茶多酚得率呈现上升趋势，并在70 ℃时达到最大值（82.228 7 mg/g），之后随着超声温度升高，连翘红茶多酚得率呈现下降趋势。可能是因为温度过高，部分热敏性的多酚被降解[23]。因此，选择超声温度为60、70、80 ℃进行后续响应面试验。
2.3 响应面试验结果
响应面试验结果和方差分析结果见表2和表3。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface experiments
因素试验号A（料g/m液L比）/温B度超/声℃时C间超/m声in多（酚mg得/g率）/11∶40704082.047 821∶50703075.583 231∶40803068.755 541∶40704082.469 851∶40603070.142 061∶50705075.093 471∶40704082.168 481∶50804071.815 691∶30705078.852 1101∶30804071.053 0111∶40805073.276 7121∶40704082.741 1131∶50604072.117 0141∶40704082.288 9151∶40605073.578 1161∶30604073.132 7171∶30703070.013 1
表3 方差分析结果
Table 3 Results of analysis of variance
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01；***表示影响高度显著，P＜0.001。
来源平方和自由度均方F值P值显著性A 249.63149.63382.94＜0.000 1***模型408.13945.35349.92＜0.000 1***A0.303 510.303 52.340.169 8 B2.0712.0715.970.005 2**C33.24133.24256.48＜0.000 1***AB0.790 610.790 66.100.042 8*AC21.76121.76167.88＜0.000 1***BC0.294 410.294 42.270.175 5 B2199.331199.331538.14＜0.000 1***C268.20168.20526.27＜0.000 1***残差0.907 270.129 6失拟项0.612 030.204 02.770.175 4纯误差0.295 140.073 8总和409.0316
使用Design-Expert 13软件分析试验数据，得到回归方程：Y=82.34+0.194 8A-0.508 6B+2.04C+0.444 6AB-2.33AC+0.271 3BC-3.43A2-6.88B2-4.02C2。
由表3可知，回归模型高度显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.175 4＞0.05），模型与实际情况拟合程度较好。R2=0.997 8，R2Adj=0.994 9，进一步说明模型方程能够很好地反映真实的试验值。各因素对连翘红茶多酚得率的影响大小顺序为超声时间＞超声温度＞料液比。
一次项中C项对连翘红茶多酚得率的影响高度显著（P＜0.001），B项极显著（P＜0.01），A项不显著（P＞0.05），说明超声温度和超声时间对连翘红茶多酚得率的影响较大，料液比影响较小。交互项中BC项不显著（P＞0.05），AB项显著（P＜0.05），AC项高度显著（P＜0.001），说明料液比和超声时间交互作用对连翘红茶多酚得率的影响较大，料液比和超声温度次之，超声温度和超声时间影响较小。二次项对连翘红茶多酚得率的影响均高度显著。两因素交互作用对连翘红茶多酚得率影响的响应面和等高线如图3所示。
图3 两因素交互作用对连翘红茶多酚得率的影响
Fig.3 Effect of two factors interaction on the yield of Forsythia suspensa red tea polyphenols
使用Design-Expert 13软件分析得出理论上最优提取条件为料液比1∶39.339 5（g/mL）、超声温度69.667 9 ℃、超声时间42.715 5 min，在此条件下的连翘红茶多酚得率为82.621 7 mg/g。但因实际操作的局限性，选择料液比1∶40（g/mL）、超声温度70 ℃、超声时间43 min，在此条件下进行3 次验证试验，得出连翘红茶多酚得率为（82.590 3±0.377 7）mg/g，与理论值接近。
2.4 可切换DES的回收与再利用
可切换DES使用次数对连翘红茶多酚得率的影响如图4所示。
图4 可切换DES使用次数对连翘红茶多酚得率的影响
Fig.4 Effect of switchable DES usage times on the yield of Forsythia suspensa red tea polyphenols
由图4可知，随着可切换DES重复使用次数的增加，连翘红茶多酚得率仍较高。因此，该可切换DES在连翘红茶多酚提取中具有良好的可循环性。
3 结论
采用超声波辅助可切换DES提取连翘红茶多酚。可切换DES提取连翘红茶多酚与水、60%乙醇溶液提取相比，使用可切换DES进行提取时多酚得率更高，约为水的2.65倍、60%乙醇溶液的1.31倍。超声波辅助可切换DES提取连翘红茶多酚的最佳工艺条件为料液比1∶40（g/mL）、超声温度70 ℃、超声时间43 min，此条件下连翘红茶多酚得率为（82.590 3±0.377 7）mg/g。可切换DES在重复使用4 次后，连翘红茶多酚的得率仍然较高，其在连翘红茶多酚提取中具有良好的可循环性。试验结果为连翘红茶多酚的高效、绿色、可持续提取提供了理论参考。
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