沙棘（Hippophae thamnoides L.）是多年生的落叶性灌木或小乔木，是一种喜光、抗旱、抗风沙、耐盐碱且生长性极好的小浆果植物，沙棘果颜色呈现橘黄色[1]。沙棘在我国分布极为广泛，在青海、西藏、新疆、甘肃、宁夏等地均有大面积种植[2-3]。在青海省主要分布有西藏沙棘和肋果沙棘，西藏沙棘产自玉树、海北、海东及大通，肋果沙棘产自囊谦、久治、兴海和祁连[4]。《晶珠本草》记其为“达日布”果，其“锐、轻，治培根病”。沙棘具有多种生理活性，可健胃消食、保护肝脏，具有抑菌活性、抗肿瘤活性，对心血管疾病具有治疗作用，是一种既可以食用又可以入药的资源[5-8]。沙棘色素是沙棘中具有显色功能的一类生物活性成分，其颜色鲜亮、对食品的着色力很强、安全性比较高、天然色素开发具有很大潜力，在食品加工、化妆品等方面具有良好的应用前景[9-11]。
目前，沙棘色素提取方法较多，主要包括以下几种：1）溶剂法提取沙棘色素，工艺步骤简单，操作方便，对于设备的要求也较低，但其提取的效率较低，且产物中会有有机溶剂残留，提取物的质量较差[12]；2）微波辅助提取沙棘色素，是通过微波破坏沙棘的细胞结构，使沙棘内容物溶出，该方法的优势在于提取时间较短，但随着微波功率的增加，整个体系的温度随之升高，而温度过高会导致部分色素发生分解，最终导致提取效率较低[13]；3）超声波辅助提取沙棘色素，是利用一定频率的波段破坏细胞的组织结构，从而提高沙棘色素成分的提取效果，缩短提取时间，加快溶出速度。但该提取法会对环境造成噪音污染且此方法的实施需要工业化超声设备的支持[14]；4）酶提取法是利用酶反应的高特异性来分解细胞间基质和细胞壁中的物质[15]，该方法操作简单，耗时较短，无有机溶剂及噪音污染，已广泛运用于天然色素的提取[16-17]。本研究以沙棘为原料，采用酶法提取沙棘色素，通过响应面法优化提取工艺，并对其稳定性进行研究，以期为沙棘色素的后续深入研究及开发利用提供技术支撑与理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘：采自青海省西宁市大通县，经青海师范大学生命科学学院尚军副教授鉴定为沙棘（Hippophae thamnoides L.）。
纤维素酶（200 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）、果胶酶（100 000 U/g）：江苏奥福生物科技有限公司；氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；氯化钠、氯化锌、三氯化铁（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；无水三氯化铝（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；无水氯化钙（分析纯）：天津市登科化学试剂有限公司；β-胡萝卜素（纯度＞98%）、维生素C（纯度＞99.7%）：东北制药集团股份有限公司；过氧化氢、无水乙醇、95%乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
H·SWX-420BS型电热恒温水温箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；V-5100PC型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；FA2204C型电子天平：上海越平科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准曲线的绘制
准确称取β-胡萝卜素1.00 mg，用60%乙醇溶液充分溶解并定容至100 mL，用移液枪分别吸取质量浓度0.1 g/L的β-胡萝卜素0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，然后用丙酮定容于25 mL容量瓶，配得的溶液质量浓度分别为0.001、0.002、0.004、0.008、0.012、0.016 mg/mL，然后用紫外分光光度计在波长450 nm处，测定各吸光度，并绘制标准曲线[18]。
1.3.2 沙棘色素提取液的制备
称取沙棘果实2.0 g于烧杯中，用钵杵将沙棘果实捣碎，倒入60％乙醇溶液，酶解45 min后得到酶处理液[酶解条件为液料比12∶1（mL/g）、pH5.2、酶用量0.02 g、酶解温度40 ℃]，过滤后取滤液，在最大吸收波长450 nm处测定吸光度[19]。
1.3.3 单因素试验
称取2.0 g沙棘果实、0.02 g纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶，倒入24 mL乙醇溶液（60％），调节pH值为5.2，在40 ℃下酶解45 min，过滤后在450 nm处测定所得滤液的吸光度，筛选出吸光度最高的酶[20]。再以沙棘色素的吸光度为响应值，考察酶用量（0.004、0.010、0.016、0.020、0.040 g）、酶解时间（90、105、120、135、150 min）、酶解温度（30、40、50、60、70 ℃）、液料比[4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1 （mL/g）]、酶解pH值（4.6、5.2、5.8、6.4、7.0）5 个因素对沙棘色素吸光度的影响[21-23]。
1.3.4 响应面优化试验
通过单因素试验，确定出对沙棘色素吸光度影响较大的因素，根据响应面设计软件，利用Box-Behnken原理设计响应面优化试验[24]，确定酶解法提取沙棘色素的最佳工艺条件。响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平A 酶解B 酶解C 酶解D 液料比/因素时间/min温度/℃pH值（mL/g）-1105405.28∶10120505.812∶11135606.416∶1
1.3.5 稳定性试验
1.3.5.1 氧化还原剂对沙棘色素稳定性影响
采取最优组合酶解提取色素后，取12.5 mL沙棘色素提取液，用60%乙醇溶液定容至250 mL容量瓶中，取30 mL沙棘色素溶液加入氧化还原剂H2O2，取5 mL沙棘色素溶液加入氧化还原剂维生素C，分别在室温下静置5 h，每隔1 h在波长450 nm处测定其吸光度[25-26]。
1.3.5.2 光照对沙棘色素稳定性影响
在最优酶解条件下提取色素后，取12.5 mL沙棘色素提取液，用60%乙醇溶液定容至250 mL容量瓶中，取50 mL沙棘色素溶液3 份，分别于室内自然光、室外太阳光和避光下放置5 h，每隔1 h在波长450 nm处测定其吸光度[27]。
1.3.5.3 金属离子对沙棘色素稳定性影响
配制5 种无机盐类（Na+、Ca2+、Fe3+、Al3+、Mg2+）溶液，各溶液浓度均为0.01 mol/L。在最优酶解条件下提取色素后，取12.5 mL沙棘色素提取液，用60%乙醇溶液定容至250 mL容量瓶中，取25 mL沙棘色素溶液6 份，第1组加入1.0 mL蒸馏水（对照）、第2组加入1.0 mL NaCl溶液、第3组加入CaCl2溶液、第4组加入FeCl3溶液、第5组加入AlCl3溶液、第6组加入MgCl2溶液，充分摇匀后置于避光处，放置9 h，每隔3 h在波长450 nm处测定其吸光度[28-29]。
1.4 数据处理
使用 Excel 整合试验数据，每个试验点重复3 次，使用 SPSS Statistics 26.0、Design-Expert 13软件进行统计分析，采用Origin 2024、Graph Pad Prism 10软件作图。
2 结果与分析
2.1 β-胡萝卜素标准曲线的绘制
β-胡萝卜素标准曲线如图1所示。
图1 β-胡萝卜素标准曲线
Fig.1 β-carotene standard curve
沙棘色素中含有β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是一种常见的天然色素，其在化学结构和吸收光谱特性上与沙棘色素中的某些成分有相似性。在构建标准曲线时，使用β-胡萝卜素可以作为一种与沙棘色素有内在关联的参照物质。β-胡萝卜素在450 nm左右有较强的吸收峰，因此本试验中沙棘色素含量以450 nm下吸光度表示。在0.001～0.016 mg/mL浓度范围内，β-胡萝卜素浓度与其在450 nm处的吸光度呈良好的线性关系，回归方程为y=4.048 07x+0.000 2（R2=0.994 38）。
2.2 沙棘色素酶的筛选试验结果
在最大吸收波长450 nm处测定沙棘色素提取液的吸光度，结果如表2所示。
表2 沙棘色素酶的筛选试验结果
Table 2 Enzyme screening for H. thamnoides pigments
酶果胶酶0.289 90.291 50.290 80.290 7吸光度g1g2g3g不添加酶0.271 90.271 50.271 90.271 8中性蛋白酶0.274 90.275 30.277 40.275 9纤维素酶0.298 70.299 90.298 90.299 2
由表2可知，加入纤维素酶时测得的吸光度最高，其次是果胶酶、中性蛋白酶，最终确定纤维素酶为试验所需酶。
2.3 单因素试验结果
2.3.1 纤维素酶用量对沙棘色素提取效果的影响
酶用量对沙棘色素吸光度的影响见图2。
图2 酶用量对沙棘色素吸光度的影响
Fig.2 Effects of enzyme dosage on the absorbance of H. thamnoides pigments
由图2可知，沙棘色素吸光度随着纤维素酶用量的增加呈先上升后下降的趋势，当纤维素酶用量为0.020 g时，提取液吸光度达到最大值，表明在此条件下色素的溶出浓度最高，间接反映出提取效果可能达到最佳，之后随着酶用量增加提取效果有所下降。这可能是适量的纤维素酶可以破坏植物细胞壁，使沙棘色素更容易溶出，反应更易发生；当酶用量超过0.020 g时，过多的酶可能会对提取物产生非特异性吸附或者干扰提取过程中的其他成分，从而使沙棘色素提取效果有所下降。因此，选择0.020 g作为酶用量。
2.3.2 酶解时间对沙棘色素提取效果的影响
酶解时间对沙棘色素吸光度的影响见图3。
图3 酶解时间对沙棘色素吸光度的影响
Fig.3 Effects of enzyme digestion time on the absorbance of H. thamnoides pigments
如图3所示，沙棘色素吸光度随着酶解时间的延长呈现先上升后下降趋势，当酶解时间为120 min时，提取液吸光度达到最大，表明在此条件下色素的溶出浓度最高，间接反映出提取效率可能达到最佳，之后随着酶解时间的延长，色素提取效果逐渐降低。这可能是随着酶解时间延长，酶与沙棘结合更充分，当时间超过120 min时，可能导致沙棘色素稳定性下降，对沙棘色素的提取效果产生了影响。故选择酶解时间为105、120、135 min进行后续优化试验。
2.3.3 酶解温度对沙棘色素提取效果的影响
酶解温度对沙棘色素吸光度的影响见图4。
图4 酶解温度对沙棘色素吸光度的影响
Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on the absorbance of H. thamnoides pigments
如图4所示，酶解温度在30～50 ℃时，沙棘色素提取液的吸光度随着酶解温度的升高而逐渐增加，在酶解温度50 ℃时吸光度达到最大值；当酶解温度继续升高，提取液吸光度呈下降趋势，其原因可能是温度过高，部分色素分解，导致色素提取效果降低；也可能是温度超过了酶的最适温度，使酶活性降低，进而影响沙棘色素的提取效果。故选择酶解温度为40、50、60 ℃进行后续优化试验。
2.3.4 液料比对沙棘色素提取效果的影响
液料比对沙棘色素吸光度的影响见图5。
图5 液料比对沙棘色素吸光度的影响
Fig.5 Effects of liquid-to-material ratio on the absorbance of H. thamnoides pigments
如图5所示，沙棘色素吸光度随着溶剂体积的增加呈现先上升后下降的趋势，液料比为12∶1 （mL/g）时，吸光度达到最高，之后随着溶剂体积的增加，吸光度呈下降趋势，进而影响沙棘色素的提取效果。其原因可能是溶剂体积过高，色素被过度稀释，致使提取液吸光度减小，故选择液料比为8∶1、12∶1、16∶1 （mL/g）进行后续优化试验。
2.3.5 酶解pH值对沙棘色素提取效果的影响
酶解pH值对沙棘色素吸光度的影响见图6。
图6 酶解pH值对沙棘色素吸光度的影响
Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis pH on the absorbance of H. thamnoides pigments
如图6所示，随着酶解pH值增大，沙棘色素吸光度呈现先上升后下降趋势，在pH值为5.8时，沙棘色素吸光度达到最高；酶解pH值大于5.8，吸光度会降低。其原因可能是酶处理液中的酶解pH值超过了酶的最适pH值，影响纤维素酶活性，酶解速率下降，进而影响沙棘色素的提取效果，故选择酶解pH值5.2、5.8、6.4进行后续优化试验。
2.4 响应面法优化沙棘色素提取工艺
2.4.1 响应面试验设计及结果
根据单因素试验结果，选取酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶解pH值（C）、液料比（D）为变量因素，以沙棘色素提取液吸光度（Y）为响应值，酶用量固定选用0.02 g，进行四因素三水平的响应面优化试验，试验设计及结果见表3。
表3 响应面试验设计与结果
Table 3 Design and results of response surface test
编号ABCD吸光度110-101.314310101.3755100-11.353200-1-11.2374001-11.393600001.710700001.68880-1-101.22590-1011.0711001-101.3671100001.61512-100-11.401
续表3 响应面试验设计与结果Continue table 3 Design and results of response surface test
编号ABCD吸光度13-1-1001.3031410011.095150-10-11.2451611001.4121700001.655180-1101.234191-1001.30720-10011.1732100-111.0742200111.0992301101.3652400001.61925-11001.31826010-11.39527-10-101.3282801011.17429-10101.206
运用Design-Expert 13软件可得到沙棘色素提取试验的拟合二次回归方程模型：Y=1.66+0.010 5A+0.054 0B+0.010 6C-0.111 5D+0.022 4AB+0.045 9AC-0.007 6AD-0.003 0BC-0.011 7BD-0.032 8CD-0.149 9A2-0.171 16B2-0.195 8C2-0.259 2D2。
对回归方程进行方差分析，其结果如表4所示。
表4 模型方差分析结果
Table 4 Analysis of variance for the model
注：*表示影响显著，p＜0.05；**表示影响极显著，p＜0.01；***表示影响高度显著，p＜0.001。
方差来源平方和自由度均方F值p值显著性模型0.879 1140.062 828.33＜0.000 1***A酶解时间0.001 310.001 30.601 10.451 1 B酶解温度0.034 910.034 915.770.001 4**C酶解pH值0.001 310.001 30.604 30.449 9 D液料比0.149 210.149 267.30＜0.000 1***AB0.002 010.002 00.909 10.356 5 AC0.008 410.008 43.800.071 4 AD0.000 210.000 20.105 30.750 3 BC0.000 010.000 00.015 90.901 3 BD0.000 510.000 50.246 80.627 0 CD0.004 310.004 31.940.185 2 A20.145 710.145 765.75＜0.000 1***B20.189 910.189 985.66＜0.000 1***C20.248 610.248 6112.15＜0.000 1***D20.435 910.435 9196.67＜0.000 1***残差0.031 00.002 214失拟项0.024 2100.002 41.410.396 4误差0.006 940.001 7总离差0.910 128
由表4可知，模型的F值为28.33，p＜0.000 1，试验模型高度显著，失拟项F=1.41，p=0.396 4＞0.05，说明试验模型能够较好地拟合试验数据。R2=0.965 9，R2adj=0.931 8，离散系数为3.52，说明该试验模型拟合程度较好，试验误差较小。由此可知，该试验的回归模型能够很好地反映响应面数值的变化。D、A2、B2、C2和D2对沙棘色素提取效果具有高度显著影响（p＜0.001）。根据F值大小可知，各因素中对沙棘色素提取效果影响依次为液料比＞酶解温度＞酶解pH值＞酶解时间。综上所述，该回归模型可以用于优化沙棘色素提取工艺。
2.4.2 各因素交互作用的影响
根据响应面试验测定结果，各因素交互作用对沙棘色素提取效果影响见图7。
图7 试验因素间交互作用的响应面
Fig.7 Response surface plot for the interactions among the test factors
响应曲面坡度越陡峭，说明两因素的交互作用对沙棘色素提取效果影响越显著，响应曲面坡度越平缓，则影响不显著[30]。由图7和表4可知，AB（酶解时间与酶解温度）、AD（酶解时间与液料比）、BC（温度与酶解pH值）以及BD（酶解温度与液料比）的p值均大于0.05，曲面平缓，交互作用不显著。AC（酶解时间与酶解pH值）与CD（酶解pH值与液料比）的p值虽大于0.05，但曲面较陡，接近显著，存在一定交互趋势。
综上，各因素交互作用均未达显著水平（p＞0.05），表明沙棘色素提取效果主要受单因素的主效应和二次效应影响（A2、B2、C2、D2，p＜0.001），而非因素间的协同交互作用。
2.4.3 沙棘色素最佳工艺条件确定和验证
最终得到最佳工艺参数为液料比11.109∶1 （mL/g）、酶解温度51.693 ℃、酶解pH值 5.831、酶解时间120.917 min，此时沙棘色素提取液吸光度为1.675。根据实际操作性，对求得的工艺条件进行修正：酶解温度52 ℃、酶解时间121 min、酶解pH值 5.83、酶解液料比11.1∶1 （mL/g）。在该条件下提取1 次，沙棘色素提取液的理论吸光度为1.675。在优化条件下进行了3 次验证试验，沙棘色素提取液的吸光度分别为1.664、1.676和1.678，平均值为1.672，与预测值相近，说明模型与实际数据拟合较好，根据此模型优化的工艺条件可靠。
2.5 稳定性试验
2.5.1 氧化还原剂对沙棘色素稳定性影响
2.5.1.1 H2O2对沙棘色素稳定性影响
H2O2对沙棘色素稳定性的影响见图8。
图8 H2O2对沙棘色素稳定性的影响
Fig.8 Effects of H2O2 on the stability of H. thamnoides pigments
如图8所示，与空白组相比，加入H2O2的沙棘色素提取液吸光度在4 h内呈持续显著下降趋势。这表明H2O2作为强氧化剂，能显著破坏沙棘色素的稳定性。其作用机理可能涉及对色素分子中不饱和共轭结构或酚羟基等活性基团的氧化，导致发色团降解。因此，在沙棘色素及其产品的生产、储存过程中，应严格避免与过氧化氢等氧化性物质接触。
2.5.1.2 维生素C对沙棘色素稳定性影响
维生素C对沙棘色素稳定性的影响见图9。
图9 维生素C对沙棘色素稳定性的影响
Fig.9 Effects of vitamin C on the stability of H. thamnoides pigments
如图9所示，与空白组相比，加入维生素C后色素溶液的吸光度同样发生显著性下降。维生素C作为还原剂，可能通过改变体系的氧化还原电位，或直接与色素分子发生氧化还原反应，从而导致色素结构改变或褪色。该结果进一步证实氧化还原环境对沙棘色素稳定性影响显著。在实际应用中，需注意避免与强还原性物质共存。
2.5.2 光照对沙棘色素稳定性影响
光照对沙棘色素稳定性的影响见图10。
图10 光照对沙棘色素稳定性的影响
Fig.10 Effects of light on the stability of H. thamnoides pigments
如图10所示，在室内避光条件下，5 h内吸光度仅轻微下降，表明色素在无光环境中相对稳定。室内自然光照射下，吸光度下降速率加快，说明散射光具有一定破坏作用。在室外太阳光直射条件下，吸光度变化呈现先下降后略微回升的非单调趋势。初期（1～3 h）的快速下降可能与紫外线及强光引发的光氧化降解有关；后期（4～5 h）的轻微回升，推测可能是由于色素降解产物在450 nm处产生了新的吸收峰，或发生了某些光致异构化反应。综上所述，光照尤其是紫外线和强直射光，是导致沙棘色素不稳定的关键环境因素。因此，建议在沙棘色素的储存、运输及产品加工过程中采取严格的避光措施。
2.5.3 金属离子对沙棘色素稳定性影响
金属离子对沙棘色素稳定性的影响见图11。
图11 金属离子对沙棘色素稳定性的影响
Fig.11 Effects of metal ions on the stability of H. thamnoides pigments
由图11可知，在供试的几种金属离子中，Fe3+与Al3+均引起了沙棘色素溶液吸光度的显著变化，且趋势相似，均为吸光度上升。其中，Fe3+的影响最为显著，Al3+的影响次之。吸光度的显著增大表明，Fe3+与Al3+可能与沙棘色素分子中的某些基团（如酚羟基、羧基等）发生了络合或螯合反应，生成了在450 nm处摩尔吸光系数更大的新络合物，或改变了色素的聚集状态，从而增强了其吸光能力。Na+、Ca2+和Mg2+等离子对沙棘色素提取液的吸光度未产生显著影响，说明这些离子对色素的光学性质干扰较小。上述结果表明，Fe3+和Al3+能与沙棘色素发生明显的相互作用，并非简单地导致色素降解，而是可能改变其化学形态并显著影响其显色强度。在生产、储存及应用过程中，需关注此类金属离子存在可能导致的色泽加深或色差变化。
3 结论
本研究以沙棘为试验原料，通过酶法提取沙棘色素，使用纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶进行试验，单因素分析后选择纤维素酶作为沙棘色素的酶制剂。通过响应面法优化酶解法提取沙棘色素工艺，最终确定最优工艺条件为酶解温度为52 ℃、液料比为11.1∶1 （mL/g）、酶解时间为121 min、酶解pH值为5.83。同时，在确定的最佳提取条件下，对沙棘色素的稳定性进行研究，试验结果表明：氧化还原剂对沙棘色素有一定影响，要避免沙棘色素与其接触；太阳光照射会影响沙棘色素稳定性，应当避光保存，防止阳光直射；Fe3+对于沙棘色素稳定性有显著影响，Al3+对其有一定影响，在生产应用过程中应当减少这两类金属离子与沙棘色素的接触。通过酶法提取沙棘色素，其操作简单、条件温和，提取出来的沙棘色素具有一定稳定性。本研究为沙棘色素的开发与生产提供了理论依据，对于今后更好地开发利用沙棘资源提供了科学依据。
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