笃斯越橘（Vaccinium uliginosum Linn.）又称都柿、甸果、地果等，是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）的多年生落叶灌木，产于黑龙江大兴安岭北部、吉林长白山等地[1]。笃斯越橘果肉细腻，可加工为果汁和果酒，也能作为果酱、酸奶、果冻等产品的配料，具有较高的商业价值和营养价值[2]。果实中不仅含有丰富的花色苷，还富含绿原酸、山奈酚和维生素C等多种营养物质[3]。以上多种营养物质具备较强的抗氧化活性，且能够起到美容养颜、抗氧化、预防脑神经衰老、降低血压血脂、增强免疫力等作用[4-5]。
果胶是一种存在于陆生植物细胞壁中的天然离子多糖，在加入二价阳离子后会发生链-链缔合形成水凝胶。果胶主要来自柑橘类水果的果皮，但也存在于其他植物中（如马铃薯、蓝莓等）[6]。根据其酯化程度，果胶可分为两大类：高甲氧基果胶和低甲氧基果胶。酯化度大于50%的高甲氧基果胶主要用于增稠和胶凝性能，低甲氧基果胶由于糖分低而广泛应用于食品领域，如作为胶凝剂、稳定剂和脂肪替代品。
低酯果胶的钙凝胶机理更符合低热量食品的应用趋势。因此，为扩大果胶的应用范围，越来越多学者进行了果胶改性的研究，低酯化是一种重要的果胶基团取代改性方法，通常使用碱法、酸法以及酶法等进行果胶改性，酶法与其他方法相比，具有产物分子量高以及反应底物专一性的特点[7]。目前，关于果胶改性的研究多集中于苹果果胶及柑橘类果胶等，关于酶法低酯化改性应用于笃斯越橘低酯果胶制备的报道鲜见。
不同的提取方法对果胶提取率也有一定影响[8]。果胶的提取方法可以分为以下4 种：化学法、物理法、生物法、复合法。超声辅助酶法属于复合法，这种复合方法具有提取效率高、提取时间短、成本低、能耗低等特点[9]。暂未有超声辅助酶法提取笃斯越橘果胶的报道。本研究采用超声辅助酶法提取笃斯越橘果实果胶（Vaccinium uliginosum pectin，VUP），通过响应面分析试验对超声辅助酶法提取果胶工艺进行优化，以果胶提取率为考察指标，考察超声时间、超声温度、加酶量、pH值的影响。改性后得到低酯化笃斯越橘果胶（modified Vaccinium uliginosum pectin，MVUP），对比分析两者理化性质，并探究二者对羟基自由基、2，2′-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]阳离子自由基和1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用。本研究旨在开发完善的果胶提取工艺，为笃斯越橘果胶的工业化生产提供技术支撑，以期进一步提高笃斯越橘副产品的加工价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
笃斯越橘果实：采自吉林省汪清兰家林场；0.5%咔唑试剂：广检（广州）检测科技有限公司；纤维素酶（10 000 U/g）、食用油、硫酸亚铁、柠檬酸、水杨酸、DPPH（≥98.5%）：上海麦克林生化科技股份有限公司；果胶甲基酯酶（10 000 PE/g）：深圳松山电子科技有限公司；ABTS+抗氧化能力试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；无水乙醇：天津科密欧化学试剂有限公司；磷酸氢二钠、浓盐酸：上海国药集团化学试剂有限公司；复合过氧化氢消毒剂（3%～6%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
PTYB 520电子天平：福州华志科学仪器有限公司；E0-600B鼓风干燥箱：亚速旺（上海）商贸有限公司；KQ-250B超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TGL-15B离心机：上海安亭科学仪器厂；1*3BPT循环水式多用蠕动泵：长沙明杰仪器有限公司；HBS-ScanY全波长酶标分析仪：南京德铁实验设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 笃斯越橘果胶的提取
冷冻笃斯越橘果实用蒸馏水洗净，放入烧杯中，90 ℃水浴10 min，捣碎后过纱布，滤渣置于鼓风干燥箱50 ℃烘干72 h。将烘干的笃斯越橘果实磨碎，过筛（80 目筛网），样品置于干燥器中备用。
取1 g笃斯越橘果实粉末，利用NaOH/HCl溶液调节pH值，按料液比1∶40（g/mL）加0.1 mol/L柠檬酸缓冲液、0.2 mol/L磷酸氢二钠辅助提取，加入纤维素酶酶解7 h，酶解结束后90 ℃水浴10 min灭酶，将样品于45 ℃下超声55 min，超声结束后于4 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，按体积比1∶1加入无水乙醇，4 ℃下醇沉24 h，醇沉结束后继续在4 000 r/min条件下离心10 min，静置4～8 h后抽滤，取滤渣50 ℃烘干，粉碎后得笃斯越橘果实粗果胶（VUP）。
笃斯越桔果实果胶提取率（D，%）的计算公式如下。
式中：M1为滤纸及果胶质量，g；M2滤纸质量，g；M3为笃斯越橘果实粉末样品质量，g。
1.3.2 笃斯越橘果实果胶提取单因素试验
精确称取笃斯越橘果实粉末3 份，每份样品量为（1.00±0.01） g，按照1.3.1中的果胶提取方法设置不同料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL）]、pH值（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5）、超声温度（35、45、55、65、75 ℃）、超声时间（35、45、55、65、75 min）、加酶量（0.05、0.07、0.09、0.11、0.13 g）对笃斯越橘果实果胶提取率的影响。
1.3.3 Box-Behnken响应面试验设计
基于单因素试验结果，选择对试验结果影响较大的超声时间、超声温度、pH值和加酶量为影响因素，以果胶提取率为响应值，使用Design-Expert 13软件，依据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，采用四因素三水平的设计方案进行试验设计，结果见表1。
表1 响应面试验设计的因素水平值及编码
Table 1 Codes，factors，and levels of response surface experiments
因素水平A加酶量/gB超声温度/℃C pH值D超声时间/min-10.05352.54500.07453.55510.09554.565
1.3.4 果胶脱色
参考刘少阳等[10]的方法进行果胶脱色。
1.3.5 甲基酯酶法改性
参考韦鑫等[11]的方法进行果胶改性，得到MVUP。1.3.6 果胶理化性质指标及性能检测
1.3.6.1 果胶水分含量测定
参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》[12]中的方法进行水分含量的测定。
1.3.6.2 果胶酸不溶灰分
参考GB 25533—2010《食品安全国家标准 食品添加剂 果胶》[13]中的方法进行酸不溶灰分的测定。
1.3.6.3 持水力测定
称取果胶样品（m1，g）各1.0 g分别加入30 mL蒸馏水，室温静置1 h，4 500 r/min离心10 min，去上清液，称质量（m2，g），持水力（C，g/g）计算公式如下。
1.3.6.4 持油力测定
称取果胶样品（m3，g）各1.0 g加入30 mL食用油，室温静置2 h，4 500 r/min离心20 min，去上清液，称质量（m4，g），持油力（Y，g/g）计算公式如下。
1.3.6.5 酯化度的测定
参考李晓娇等[14]的方法进行酯化度的测定。
1.3.6.6 总半乳糖醛酸含量的测定
参考让凤菊等[15]的方法进行测定，所得回归方程为y=0.565 5x+0.301 7，相关系数R2=0.933 2。根据标准曲线回归方程计算样品中果胶总半乳糖醛酸的含量。
1.3.7 抗氧化活性测定
1.3.7.1 ABTS+自由基清除率测定
参照Jiang等[16]的方法并稍作改动，ABTS+自由基清除率（A，%）计算公式如下。
式中：A1为样品溶液与ABTS稀释液的吸光度；A2为样品溶液与磷酸缓冲液的吸光度；A0为空白对照液吸光度。
1.3.7.2 DPPH自由基清除率测定
参照魏佳仪等[17]的方法并稍作改动，DPPH自由基清除率（P，%）计算公式如下。
式中：A i为待测样品溶液与DPPH自由基乙醇混合溶液的吸光度；A j为待测样品溶液与无水乙醇混合溶液的吸光度；A 0为DPPH自由基乙醇溶液与待测样品溶剂混合液的吸光度。
1.3.7.3 羟基自由基清除率的测定
参照向君豪等[18]的方法并稍微改动。羟基自由基清除率（O，%）计算公式如下。
式中：A1为待测样品溶液与硫酸亚铁溶液、双氧水溶液、水杨酸-乙醇溶液的吸光度；A2为不加水杨酸的样品溶液本底吸光度；A 0为空白对照液的吸光度。
1.4 数据处理
所有试验无特殊说明均重复3 次，以Excel 2019整理数据，以Design-Expert 13.0进行显著性分析及回归分析并作图，运用Origin 2024软件绘制折线图与响应面图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 料液比对果胶提取率的影响
料液比对果胶提取率的影响见图1。
图1 料液比对果胶提取率的影响
Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on pectin yield
由图1可知，VUP提取率随着溶剂体积的增加，呈现先升高后下降的趋势，当料液比为1∶40 （g/mL）时，提取率最高。当液料比超过1∶40 （g/mL）时，果胶提取率呈现下降趋势。溶剂体积过高时，果胶溶出达饱和，反而增加杂质的溶出，影响果胶溶出[19]。因此1∶40 （g/mL）为最佳料液比。
2.1.2 pH值对果胶提取率影响
pH值对果胶提取率的影响见图2。
图2 pH值对果胶提取率的影响
Fig.2 Effect of pH value on pectin yield
由图2可知，VUP提取率随pH值升高呈现先上升后下降趋势。当pH值为3.5时，果胶提取率最高。当提取液pH值越低，果胶提取率越低，这是由于酸性较强的溶剂会促使果胶发生降解从而导致提取率下降[20]。因此选择pH值2.5、3.5、4.5进行后续响应面优化试验。
2.1.3 超声温度对果胶提取率的影响
超声温度对果胶提取率的影响见图3。
图3 超声温度对果胶提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on pectin yield
由图3可知，随着超声温度的升高，VUP提取率呈现先升高后降低的趋势，当超声温度为45 ℃时，提取率最高。超声温度过高时，纤维素酶的酶活力逐渐下降，使得果胶提取率也下降[21]。因此选择超声温度35、45、55 ℃进行后续响应面优化试验。
2.1.4 超声时间对果胶提取率的影响
超声时间对果胶提取率的影响见图4。
图4 超声时间对果胶提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on pectin yield
由图4可知，随着超声时间的延长，VUP提取率呈现先升高后降低的趋势，当超声时间为55 min时，提取率最高。超声时间过长时，果胶中部分不稳定的结构会发生脱脂而降解，从而使得果胶提取率下降。因此选择超声时间45、55、65 min进行后续响应面优化试验。
2.1.5 加酶量对果胶提取率的影响
加酶量对果胶提取率的影响见图5。
图5 加酶量对果胶提取率的影响
Fig.5 Effect of enzyme dosage on pectin yield
由图5可知，随着纤维素加酶量的增加，VUP提取率呈现先升高后降低的趋势，当纤维素加酶量为0.07 g时，提取率最高。在超声波与纤维素酶的双重作用下纤维素酶慢慢与笃斯越橘果实相互作用，促进了果胶从果实组织中溶出[22]。当纤维素加酶量过大时，过多的纤维素酶会完全包裹住笃斯越橘果实颗粒，导致果胶提取率下降[23]。因此选择加酶量0.05、0.07、0.09 g进行后续响应面优化试验。
2.2 响应面优化试验结果
2.2.1 Box-Behnken响应面试验结果与分析
基于单因素试验结果，对VUP提取影响较为明显的4 个单因素（pH值、超声温度、超声时间、加酶量）进行响应面设计，响应面试验结果见表2。
表2 Box-Behnken响应面试验设计方案及结果
Table 2 Box-Behnken experimental design and results
试验序号ABCDY提取率/%1-10-108.1920-10-17.80301-108.244-1-1007.615100-17.55600009.72700009.79800-1-18.55900009.831010-108.1511-100-17.93120-1108.161310017.791400009.8215-11007.5116001-18.371700118.501800-118.531910108.0120010-17.7821-10017.862201018.012300009.762411007.49251-1007.242601108.08270-1017.80280-1-108.0729-10108.27
采用Design-Expert 13.0软件对VUP提取率试验结果进行方差分析，得到二次多项式回归方程为Y=9.78-0.095A+0.035 8B-0.028 3C+0.042 5D+0.087 5AB-0.055AC+0.077 5AD-0.062 5BC+0.057 5BD+0.037 5CD-1.17A2-1.15B2-0.480 7C2-0.812D2。
对表3中模型及回归系数进行显著性分析，结果见表4。
表3 方差分析结果
Table 3 Anova result
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
方差来源离差平方和自由度均方F值P值显著性模型16.28141.16663.88＜0.000 1**A加酶量0.108 310.108 361.81＜0.000 1**B超声温度0.015 410.015 48.790.010 2*C pH值0.009 610.009 65.500.034 3*D超声时间0.021 710.021 712.370.003 4**AB0.030 610.030 617.480.000 9**AC0.012 110.012 16.910.019 9*AD0.024 010.024 013.710.002 4**BC0.015 610.015 68.920.009 8**BD0.013 210.013 27.550.015 7*CD0.005 610.005 63.210.094 8 A28.8918.895 074.55＜0.000 1**B28.5318.534 870.76＜0.000 1**C21.511.5855.67＜0.000 1**D24.2814.282 441.08＜0.000 1**残差0.024 5140.001 8失拟项0.016 4100.001 60.808 30.644 3绝对误差0.008 140.002 0总离差16.3128 R 20.998 5 R2Adj0.997 0
表4 笃斯越橘果胶理化指标
Table 4 Physicochemical indicators of VUP
组别总半乳糖醛酸含量/%酸不溶灰分含量/%酯化度/%水分含量/%持水力/（g/g）持油力/（g/g）VUP82.76±0.570.2554.50±4.047.903.40±0.025.00±0.03 MVUP89.54±0.070.9637.50±1.058.579.50±0.0618.00±0.04 GB 25533—2010《食品安全国家标准 食品添加剂 果胶》≥65≤1≤12
由表4可知，结果表明该回归模型P＜0.000 1，表明该模型极显著，其失拟项P=0.644 3，不显著。说明试验设计可靠，可对二次回归方程相应值进行预测，并且该模型的决定系数以及校正决定系数分别为R2=0.998 5，R2Adj=0.997 0；说明该模型的拟合程度良好，误差较小，能解释响应值的变化，并且表明预测值与实测值间具有高度相关性。变异系数为0.99%，说明置信度高，因此可以利用该回归方程对果胶提取率进行预测与分析。
由F值可知，各因素对果胶提取率的影响顺序为A＞D＞B＞C，即加酶量＞超声时间＞超声温度＞pH值；且4 个因素对果胶提取率的影响均非简单的线性关系，一次项A、D、二次项A2、B2、C2、D2和交互项AB、AD、BC均为影响极显著因素（P＜0.01）；一次项B、C和交互项AC、BD均为影响显著因素（P＜0.05）；交互项CD为影响不显著因素（P＞0.05）。
2.2.2 响应面分析
响应面如图6所示。
图6 各因素交互作用对果胶提取率的响应面分析
Fig.6 Interactive effects of factors on pectin yield by response surface analysis
图6 分别展示了加酶量（A）、超声温度（B）、pH值（C）、超声时间（D）4 个因素两两交互作用对笃斯越橘果胶提取率的影响。加酶量与超声温度的交互作用使提取率呈单峰变化，峰值出现在加酶量约0.07 g、超声温度约45 ℃处，等高线呈椭圆形，表明二者交互作用显著；加酶量与超声时间的交互作用使提取率先升后降，顶点在加酶量约0.07 g、超声时间约55 min处，等高线呈椭圆形，说明二者交互作用显著；超声温度与超声时间的交互作用显著，曲面在温度约45 ℃、时间约55 min时达到峰值，等高线呈椭圆形；pH值与超声时间的交互作用使提取率呈单峰变化，顶点在pH值约3.5、时间约55 min处，等高线呈椭圆形，表明二者交互作用显著。
根据Design-Expert-13.0软件预测的回归模型分析得出果胶提取的最佳条件为加酶量0.069 23 g、超声温度45.154 6 ℃、pH值3.472 5、超声时间55.241 9 min，此条件下果胶提取率为9.787 01%。为方便试验进行，将条件修正为加酶量0.07 g、超声温度45 ℃、pH值3.5、超声时间55 min，在该条件下，重复平行试验，得出果胶提取率平均值为9.82%，与最大的果胶提取率预测值的相对误差为0.033%，表明该笃斯越橘果胶提取工艺优化准确可行，且该数据具有一定的参考价值。
2.3 两种笃斯越橘果胶理化指标测定结果对比
对超声辅助酶法提取笃斯越橘果胶后的VUP、MVUP理化指标进行检测，结果见表4。
由表4可知，VUP及MVUP的半乳糖醛酸含量均高于国家标准规定的含量，酯化度测定结果表明VUP果胶为高酯果胶（酯化度＞50%），MVUP为低酯果胶（酯化度≤50%）。此外VUP、MVUP的半乳糖醛酸含量、水分含量和酸不溶灰分含量的测定结果均符合GB 25533—2010要求。MVUP相对于VUP而言具有较强的持水力和持油力。
2.4 抗氧化能力分析
MVUP与VUP的抗氧化能力见图7～图9。
图7 MVUP与VUP的ABTS+自由基清除率
Fig.7 ABTS+ free radical scavenging rate of MVUP versus VUP
由图7可知，随着样品浓度的增大，VUP、MVUP的ABTS+自由基清除能力增加，且MVUP清除率一直高于VUP。当样品浓度为2.0 mg/mL时，MVUP的ABTS+自由基清除率达（75.87±0.70）%，VUP清除率达（69.40±1.1）%，均为两者最高值，但仍弱于VC。
由图8可知，随着样品浓度的增大，MVUP、VUP的DPPH自由基清除的能力也随之提高，当浓度在1.2 mg/mL时，MVUP的DPPH自由基清除率明显大于VUP，在2.0 mg/mL时，MVUP的DPPH 自由基清除率为（69.15±0.70）%，而VUP的DPPH自由基清除率为（62.82±2.48）%，均为两者最高值。
图8 MVUP与VUP的DPPH自由基清除率
Fig.8 DPPH free radical scavenging rate of MVUP versus VUP
由图9可知，随着样品浓度的增大，VUP及MVUP的羟基自由基的清除能力随之提高，且MVUP的羟基自由基清除率一直高于VUP的羟基自由基清除率。当样品浓度为2.0 mg/mL时，两者清除率均达到最高值，其中MVUP的羟基自由基清除率达到（89.09±0.25）%，强于VUP的羟基自由基清除率（85.62±0.76）%，最接近VC的羟基自由基清除率，两者清除率都达到了85%以上，说明MVUP与VUP对羟基自由基都具有良好的清除作用。
图9 MVUP与VUP的羟基自由基清除率
Fig.9 Hydroxyl radical scavenging rate of MVUP versus VUP
3 讨论与结论
商品果胶多数是柑橘类果胶及苹果果胶。通过响应面结果得出在最佳条件下笃斯越橘果实果胶提取率平均值为9.82%，低于酸法提取沃柑皮的最佳平均提取率（21.36%），但是高于超声波辅助提取柑橘幼果果胶最佳提取率（6.11%）[24-25]。这可能是由于果实中含有一定水分，在提取、烘干过程中水分流失导致果胶提取率偏低，但是从高于柑橘幼果果胶提取率这一点可以看出，笃斯越橘果实中果胶多糖含量较高。
VUP改性后，其酯化度低于50，低酯化效果显著，低酯果胶仅在Ca2+存在时就能形成凝胶，不受糖含量的影响，非常适合作为乳化剂、稳定剂等在食品中应用。其应用效果也受持水力和持油力的影响[26-27]。MVUP持水力、持油力值均高于马铃薯多糖（持水力为4.097，持油力为4.398）[28]。说明MVUP更有助于改善食品系统中的感官特性，具有作为高脂肪食品系统中良好的增稠剂和稳定剂的潜力。果胶多糖的自由基清除率与样品浓度之间均呈显著正相关关系，对枸杞叶多糖的研究也得出相似的结论[29]。DPPH自由基清除能力值较低，这可能是因为MVUP与VUP为粗果胶，并未纯化。纯化后的果胶多糖可能具有更为特异的结构和生物活性，抗氧化效果可能更加精确[30]。
本研究使用超声辅助酶法对笃斯越橘果实果胶（VUP）进行提取，确定了最佳工艺为料液比1∶40 （g/mL）、加酶量0.07 g、超声温度45 ℃、pH值3.5、超声时间55 min，此条件下VUP提取率为9.82%。VUP经酶法低酯化改性后得到MVUP，研究发现与VUP相比，低酯化后的MVUP酸不溶灰分及水分含量更高，具有良好的持水力与持油力，且半乳糖醛酸含量高达（89.54±0.07）%。VUP与MVUP对ABTS+自由基、DPPH自由基和羟基自由基均有清除作用，MVUP对各自由基抗氧化能力均强于VUP，且均与样品浓度呈正相关，且均低于VC。由此，未来可深入研究超声波辅助酶提取VUP及MVUP的结构构成等，探究其发挥抗氧化作用的主要结构单元，为日后笃斯越橘果胶深入研究提供参考依据，并对提高笃斯越橘资源利用率和产品附加值具有重要意义。
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