海洋环境的特殊性使海洋微生物具备独特的代谢方式，更赋予了它们产生生物活性物质的巨大潜力。海洋动植物共附生微生物是指附着在动植物表面的微生物以及生长在海洋动植物内部并与动植物存在着互惠互利或一方受益的共生或寄生关系的微生物[1]，研究发现，许多具有开发前景的活性物质是由与海洋动植物共生或附生的微生物产生的[2]。Chen等[3]从中国黄海海绵（Ophlitaspongia sp.）中分离出151株可培养细菌，通过活性筛选发现其中94株具有抗菌活性，多株菌具有编码聚酮合酶及非核糖体肽等抗菌物质的生物合成基因簇。Abraham等[4]从海洋菌株Marinispora CNQ-140中鉴定出合成马里霉素B的生物合成基因簇，并通过异源表达技术使其在链霉菌中成功表达了该化合物，该抗生素不仅具有显著的抗菌活性，而且展现出较强的抗癌细胞功效。Fu等[5]从中村氏矶海绵（Agelas nakamurai）中分离到一种新型溴吡咯生物碱酯agenakasine，该化合物对肺炎克雷伯氏菌具有显著抑制作用。Yao等[6]研究发现，柳珊瑚来源真菌Penicillium steckii P2648 次级代谢产物中的化合物橘霉素对多种病原菌（包括大肠杆菌Escherichia coli 25922和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 2592）显示出优异的抗菌活性。
海胆为棘皮动物门（Echinodermata）海胆纲（Echinoidea）动物。海胆纲的部分种类自古即为滋补佳品，富含多糖、蛋白、脂肪酸、微量元素和色素等成分，具有多种生物学活性[7-10]。目前对海胆共附微生物也有一些研究报道，张连茹等[11]研究发现海胆卵内生菌的发酵液具有抗菌、抗氧化及抗肿瘤活性，黄苛等[12]从南海硇洲岛沿海地区采集的马粪海胆中分离出的106株细菌，其中59株具有抗菌活性，强抗菌活性的有10株，Nedashkovskaya等[13-17]从虾夷马粪海胆中分离到一系列新型的能够产生色素的海洋细菌KMM6050T、KMM6049T、KMM6058T以及KMM 6038T、KMM6172T。但是对这些菌株的生物活性及其活性物质的研究尚不深入，有的菌株生物活性未检测或者活性菌株的活性物质未进行纯化鉴定，活性物质的结构性质及作用机理等有待深入研究。本研究以本课题组前期分离筛选的1株具有抑菌活性的海胆共附生细菌DNC2为试验材料[18]，分析其抑菌活性组分并对该组分的抗肿瘤活性进行检测，以期为该菌株的活性代谢产物的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海胆共附生细菌DNC2：大连海洋大学食品科学与工程学院微生物实验室分离保存；海水：采集自大连海洋大学校内海域，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，4 ℃保存备用；大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens ATCC 13124）、变形杆菌（Proteus vulgaris ATCC 13315）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 11562）、串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）、雪腐格氏霉菌（Gerlachia nivalis）、番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、西瓜尖镰孢菌（Fusarium oxysporumf. sp.niveum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht）：中国科学院大连化学物理研究所天然产物及糖工程研究组；肝肿瘤细胞HepG2、慢性粒白血病癌细胞K562、乳腺癌细胞MDA-MB-231、乳腺癌细胞MCF-7：第二军医大学；海虾：青岛海泰生物技术有限公司；蛋白胨、琼脂粉、牛肉膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、十二烷基磺酸钠、蔗糖、过硫酸铵、巯基乙醇、甘油、甘氨酸、溴酚蓝、四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）、甲醇、氢氧化钠、乙酸、三羟甲基氨基甲烷（均为分析纯）：齐齐哈尔安泰生物工程有限公司；正丁醇、石油醚（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；乙酸乙酯（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（pH7.4、0.01 mol/L）：国药集团化学试剂有限公司；95％医用酒精：铁岭康泰消毒剂有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
250B恒温培养箱：常州国华电器有限公司；Q/BKYY22-2001净化工作台：上海跃进医疗器械有限公司；LDZH-150L立式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；NU-5500二氧化碳培养箱：天美（中国）科学仪器有限公司；H1750R台式高速冷冻离心机：华洋（上海）生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株抑菌活性部分的确定
按照文献[18]中的方法对海胆共附生细菌DNC2进行培养，将10 mL海胆共附生细菌DNC2的发酵液在4 ℃条件下4 000×g离心15 min，沉淀菌体用无菌水洗涤后再用200 µL无菌水悬浮，离心上清液用0.22 µm滤膜过滤得去菌体发酵液，分别检测去菌体发酵液（阴性对照为该菌株的空白培养基）和菌体（阴性对照为无菌水）的细菌抑制活性。
1.3.2 发酵液中活性组分的确定
有机溶剂对发酵液进行萃取：将4 mL去菌体发酵液分别与1 mL乙酸乙酯、正丁醇、石油醚有机溶剂混合，室温下振荡1 h，静置2 h，分别测定水相和有机相的抑菌活性。
硫酸铵对发酵液进行沉淀：利用硫酸铵沉淀法[19]沉淀菌体发酵液的蛋白质，并进行抑菌活性检测，分别取40 mL已制备好的去菌体发酵液，分别加入硫酸铵至饱和度为50%、60%、70%、80%和90%，于4 ℃沉淀24 h，10 000×g离心30 min，弃上清液，收集沉淀。将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，置于透析袋（截留分子量为3.5 kDa）中4 ℃透析并冷冻干燥（搁板加热温度为42.5 ℃、干燥室压力为55 Pa），将干燥物分别配制10 mg/mL的溶液测定抑菌活性，确定沉淀的最佳硫酸铵饱和度，最佳饱和度硫酸铵的沉淀物用分离胶为12%和浓缩胶为5%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测。
1.3.3 抑制细菌活性的测定
用滤纸片法[20-22]检测抑制细菌活性，将牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）倒于分区的培养皿中，吸取0.1 mL含量一致的细菌指示菌培养液置于牛肉膏蛋白胨固体培养基表面涂布均匀，将直径为6 mm的灭菌滤纸片放在培养基表面，在滤纸片上加10 µL的待测样品溶液，阴性对照的滤纸片上加10 µL用于溶解样品的溶剂，阳性对照的滤纸片上加10 µL的75%酒精（将95％医用酒精与蒸馏水按照体积比4∶1混合）；然后在37 ℃恒温培养箱中倒置培养孵育48 h，用尺子测量并且记录抑菌圈直径。
1.3.4 蛋白质的抑真菌活性检测
用牛津杯法[22-23]检测蛋白质对真菌指示菌的影响，在灭菌的沙氏固体培养基（蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）表面加上100 µL对数生长期指示菌培养液并涂布均匀，每个培养基表面放上5 个灭菌的牛津杯，分别设置试验组（150 µL的蛋白质溶液，浓度为0.5、1.0、2.0 mg/mL）、阳性对照组（4 µL/mL 噻霉酮溶液）和空白组（无菌水）滴加到牛津杯中，每种指示菌做3 个平行，培养皿于4 ℃放置24 h，再置于恒温培养箱中30 ℃培养3～5 d，测量并记录抑制效果。
1.3.5 蛋白质的海虾毒性实验
利用海虾毒性法[24]对硫酸铵沉淀蛋白进行细胞毒性测定。分别取 10.0、5.0、2.5 mg/mL的硫酸铵沉淀蛋白溶液50 µL于3 个带刻度试管中，分别将4 mL海水和10只健康的海虾加入各试管，用海水定容至5 mL，此时蛋白质终浓度为25、50、100 µg/mL，另取3只试管不加蛋白样品只加海水和海虾作为空白对照。自然光下孵育24 h后计算海虾存活率（R，%），计算公式如下。
式中：Nt为在蛋白溶液中孵育24 h后仍存活的海虾数量；N0为每个试管中初始加入的健康海虾总数，10。
1.3.6 MTT法检测待测蛋白质样品对肿瘤细胞的影响
参照文献[25-26]中的方法将对数生长期肿瘤细胞（3×104 个/mL）加入96 孔培养板，每个孔内加入100 µL的细胞悬液，在37 ℃条件、5％ CO2浓度的二氧化碳培养箱中孵育24 h，在细胞全部贴壁后，分别加入150 µL硫酸铵沉淀蛋白溶液再培养24 h，在每孔加入20 µL MTT溶液（5 mg/mL）培养4 h，弃去上清液，在每孔内加入二甲基亚砜150 µL，充分溶解后测定570 nm波长处的OD值，按如下公式计算抑制率。
式中：Y为抑制率，%；A对照为对照组吸光度；A试验为试验组吸光度。
1.4 数据处理
采用SPSS 26.0软件分析结果，使用Microsoft Excel 2019进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 抑菌活性成分存在部位的确定
对海胆共附生细菌DNC2的去除菌体发酵液和菌体，分别检测它们的抑菌活性，结果见表1。
表1 海胆共附生细菌DNC2菌株的发酵液和菌体的抑菌活性
Table 1 Antimicrobial activity of fermentation broth and bacterial cells of DNC2
注：++表示抑菌圈直径为8～＜9 mm；+++表示抑菌圈直径为9～＜10 mm；++++表示抑菌圈直径≥10 mm；-表示无抑菌圈。
对指示菌的抑菌圈直径/mm样品枯草芽孢杆菌变形杆菌大肠杆菌产气荚膜梭菌（B. subtilis）（P. vulgaris）（E. coli）（C. perfringens）菌体++++++++++去菌体发酵液+++++++++++++阳性对照++++++++阴性对照----
由表1可知，去除菌体的发酵液和菌体均显示出一定的抑菌活性，海胆共附生细菌DNC2有可能通过多种不同的化学成分对其他细菌产生抑制作用，去菌体发酵液的抑菌活性明显比菌体的抑菌活性强。
2.2 发酵液的有机溶剂萃取物抑菌活性检测结果
利用有机溶剂萃取法得到的海胆共附生细菌DNC2去菌体发酵液的有机相和水相进行抑菌活性测定，结果见表2。
表2 有机溶剂萃取物的抑菌活性
Table 2 Antimicrobial activity of components extracted using organic solvents
注：+表示抑菌圈直径为6～＜8 mm；++表示抑菌圈直径为8～＜9 mm；-表示无抑菌圈。
对指示菌的抑菌圈直径/mm样品枯草芽孢杆菌变形杆菌大肠杆菌产气荚膜梭菌（B. subtilis）（P. vulgaris）（E. coli）（C. perfringens）阳性对照++++发酵原液+++++石油醚相/水相-/+-/+-/++-/+乙酸乙酯有机相/水相-/+-/++-/+-/+正丁醇有机相/水相-/++-/+-/+-/+
由表2可知，乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取得到的有机相部分均无抑菌活性，而其对应的水相均具有抑菌活性，因此发酵液的活性成分极可能为极性物质。
2.3 硫酸铵沉淀物质的抑菌活性检测结果
由于有机溶剂萃取的海胆共附生细菌DNC2去菌体发酵液的组分抑菌活性均不明显，而水相部分的抑菌活性较好，因此进一步用硫酸铵对去菌体发酵液进行沉淀。不同硫酸铵饱和度沉淀蛋白的抑菌活性见图1。
图1 不同硫酸铵饱和度沉淀蛋白的抑菌活性
Fig.1 Antimicrobial activities of proteins precipitated by ammonium sulfate at different saturation levels
如图1所示，在5 种饱和度的硫酸铵沉淀物中，60%饱和度的硫酸铵沉淀物对于变形杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌和大肠杆菌的抑制作用最好，因此后续试验采用60%饱和度硫酸铵进行沉淀。
60%饱和度硫酸铵沉淀蛋白质的分子量分布结果见图2。
图2 60%饱和度硫酸铵沉淀蛋白质的分子量分布
Fig.2 Molecular weight distribution of proteins precipitated by ammonium sulfate at 60% saturation
由图2可知，60%饱和度硫酸铵沉淀的蛋白质分别在20、30、34、63、100 kDa左右各有1条带。
2.4 海胆共附生细菌DNC2蛋白的抑真菌效果
海胆共附生细菌DNC2蛋白的抗真菌活性见表3。
表3 海胆共附生细菌DNC2蛋白质的抗真菌活性
Table 3 Antifungal activity of proteins from DNC2
注：+++表示抑菌圈直径≥20 mm；++表示抑菌圈直径为15～＜20 mm；+表示抑菌圈直径为10～＜15 mm；-表示抑菌圈直径＜10 mm。
对真菌指示菌的抑菌圈直径/mm组别西瓜尖镰孢菌青枯雷尔氏菌尖孢镰刀菌雪腐格氏霉菌串珠镰刀菌番茄灰霉菌（Gerlachia nivalis）（Fusarium moniliforme）（Fusarium axysporumf. （Ralstonia（Fusarium oxyspo-sp. Niveum）solanacearum）（Botrytis cinerea）rum Schlecht）0.5 mg/mL组---+++1.0 mg/mL组---+++2.0 mg/mL组++++++阳性对照组+++++++++++++空白组------
由表3可知，60%饱和度硫酸铵沉淀的海胆共附生细菌DNC2蛋白质对青枯雷尔氏菌、番茄灰霉菌和尖孢镰刀菌具有较好的抑菌效果，在浓度为0.5 mg/mL时抑菌直径达到10～＜15 mm；海胆共附生细菌DNC2蛋白质浓度在2.0 mg/mL时对串珠镰刀菌、雪腐格氏霉菌和西瓜尖镰孢菌也有抑制作用，抑菌圈直径达到10～＜15 mm，表明海胆共附生细菌DNC2蛋白质在番茄、辣椒和瓜类等作物病害的生物防治方面具备广阔的开发价值与应用潜力。
2.5 海胆共附生细菌DNC2蛋白质的海虾毒性实验结果
海虾毒性法具有速度快（仅需24 h）、不需无菌操作、价格低廉等优点，且海虾毒性法与人鼻咽癌9KB细胞毒性实验有良好的相关性，细胞毒性的半数有效剂量（median effective dose，ED50）值一般是海虾毒性半数致死量（median lethal dose，LD50）值的1/10[27]。海胆共附生细菌DNC2蛋白质对海虾毒性见图3。
图3 海胆共附生细菌DNC2蛋白质对海虾毒性
Fig.3 Toxicity of proteins from DNC2 towards juvenile prawn
如图3所示，海胆共附生细菌DNC2蛋白质对海虾的存活率有明显的影响，在海胆共附生细菌DNC2蛋白质浓度为25、50、100 µg/mL时，海虾存活率分别为19.2%、7.7%和0%，而空白对照为86.7%，表明海胆共附生细菌DNC2蛋白质具有明显的海虾毒性。
2.6 海胆共附生细菌DNC2蛋白质对肿瘤细胞的抑制效果
由于海虾毒性实验法只是一种初步的筛选抗肿瘤活性的方法，因此进一步用MTT法检测海胆共附生细菌DNC2蛋白质对肝肿瘤细胞HepG2、慢性粒白血病癌细胞K562、乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响，结果见图4。
图4 海胆共附生细菌DNC2蛋白质对肿瘤细胞活力的抑制作用
Fig.4 Inhibitory effects of proteins from DNC2 on tumor cell viability
如图4所示，海胆共附生细菌DNC2蛋白质对4 种肿瘤细胞均有抑制作用，在10～300 µg/mL的蛋白质浓度范围内，海胆共附生细菌DNC2蛋白质对4 种肿瘤细胞的抑制作用随蛋白质浓度升高整体呈增强的趋势，在蛋白质浓度为300 µg/mL时，对慢性粒白血病癌细胞K562的抑制率达到95.87%，对肝肿瘤细胞HepG2的抑制率为90.40%，对乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制率为95.67%，对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用较弱，为77.71%。
3 结论
硫酸铵能沉淀出海胆共附生细菌DNC2发酵液中的抑菌活性组分，该硫酸铵沉淀物主要包括5 个蛋白条带，海胆共附生细菌DNC2蛋白具有较高的生物活性，能抑制6 种植物病原菌指示菌及4 种细菌指示菌，也能够明显地抑制多种肿瘤细胞增殖，比如肝肿瘤细胞HepG2、慢性粒白血病癌细胞K562、乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌细胞MDA-MB-231。鉴于海胆共附生菌株DNC2的胞外蛋白所具备的广谱抗菌活性和抑制肿瘤活性，该蛋白在食品工业领域的防腐保鲜、农业领域的生物防治及新药研发方面均具有较大的应用潜力，后续工作将进一步对抑菌抗肿瘤活性蛋白组分进行分离、结构鉴定，并对纯化活性蛋白的理化性质进行研究，为该菌株活性蛋白的应用提供理论依据。
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