红枣多糖对免疫抑制小鼠血清代谢组学的影响

红枣（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科枣属植物枣树的果实[1]，自古被列为“五果”之一，枣树在我国已有4 000多年的栽培历史，集中种植于西北及黄河流域干旱及半干旱地区[2]。新疆红枣产量占全国总产量的53.6%，主产于南疆若羌、和田及阿克苏等地，主要种植品种为灰枣和骏枣。红枣具有较高的营养价值，含有多糖[3-4]、维生素[5]、氨基酸及酚酸[6]等营养物质，其中碳水化合物含量为80.86%～85.63%，还原糖含量为57.61%～77.93%，可溶性纤维含量为0.57%～2.79%，不可溶性纤维含量为5.24%～7.18%，蛋白质含量为4.75%～6.86%，脂质含量为0.37%～1.02%，水分含量为17.38%～22.52%，灰分含量为2.26%～3.01%[7]。红枣是药食同源的干果，适用于补中益气、脾虚食少以及养血安神等[8]。

近年来，植源性天然产物作为一种有价值的免疫调节化合物资源受到研究者的广泛关注。其中多糖类物质植源性天然产物已被证实具有免疫调节活性。从化学组成来看，植物多糖可分为单一多糖和杂聚糖，杂聚糖由多种不同的单糖分子通过不同位点和构型的糖苷键相互连接而成[9]。从功能基团来看，植物多糖的分子结构中不仅包含中性糖组分，还含有酸性糖基团，使其结构多样性更加丰富[10-11]。Cui等[12]研究发现，两种红枣多糖组分能诱导RAW 264.7细胞CO的生成并刺激先天免疫反应。Chi等[13]研究发现，冬枣多糖能够显著提高抗氧化酶的活性水平和CD4+/CD8+的比例，并显著降低脂质过氧化物丙二醛和白细胞介素-10的表达水平，从而增强小鼠的免疫调节功能。Zhao等[14]研究发现，冬枣多糖的单糖组成包括尿酸、半乳糖和阿拉伯糖，能够促进淋巴细胞体积变大，数量增多，且尿酸是刺激机体免疫反应的重要因素。

本研究对红枣多糖作用于免疫抑制小鼠的血清代谢组学进行分析，考察红枣多糖干预前后免疫抑制小鼠的差异代谢物，分析富集所涉及的差异代谢途径，探讨红枣多糖对免疫抑制小鼠代谢途径的影响，以期为进一步有效利用红枣活性成分提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Balb/c 小鼠[雄性，（20±2）g，6～8 周龄，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2023-0001]：新疆医科大学动物实验中心；若羌灰枣：产自新疆若羌县；葡萄糖（分析纯）、环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）（分析纯）、纤维素阴离子交换柱（DEAE-52）、葡聚糖凝胶柱（Sephadex G-100）：北京索莱宝科技有限公司；正丁醇、苯酚、硫酸、氯化钠（均为分析纯）：天津市鑫铂特化工有限公司；无水乙醇、三氟乙酸（均为分析纯）：天津市北联精细化学品开发有限公司；酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒：江苏酶免实业有限公司；单糖标准品、溴化钾（均为分析纯）：美国Sigma公司；甲醇、乙腈（均为分析纯）：美国赛默飞世尔科技公司；2-氯-L-苯丙氨酸（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（分析纯）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

1.2 仪器与设备

冷冻离心机（Fresco 17）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；混匀仪（XW-80A）：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；组织研磨器（Potter-Elvehjem）：浙江美壁仪器有限公司；超声波清洗器（KQ-3200DB）：上海舒美超声仪器有限公司；真空浓缩仪（Savant SPD120）：德国艾本德公司；滤膜（0.2 µm）：天津市津腾实验设备有限公司；液相色谱仪（Vanquish）、质谱仪（Orbitrap Exploris 120）：美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 红枣多糖的提取及分离纯化

红枣多糖提取：红枣去核，60 ℃烘干，粉碎，过40 目筛，红枣粉经石油醚处理24 h，得到去脂样品，备用。采用超声辅助-热水浸提的方法提取红枣多糖。准确称取2.000 0 g脱脂红枣粉末置于锥形瓶中，加入60 mL的蒸馏水[料液比1∶30（g/mL）]，超声处理20 min，于70 ℃水浴条件下提取3 h，提取液经抽滤，真空浓缩，加入4倍体积的95%乙醇，醇沉12 h，5 000 r/min离心10 min，得到红枣多糖。利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱和葡聚糖G-100凝胶柱层析对红枣多糖进行分离纯化，得到红枣多糖组分（HP）。

1.3.2 免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白的测定

在4 ℃下3 500 r/min离心全血10 min制备血清样本。根据ELISA检测试剂盒说明书测定小鼠血清中免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）和免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）的表达水平。

1.3.3 红枣多糖作用于免疫抑制小鼠

本实验选用BALB/c雄性小鼠进行免疫调节活性研究，小鼠经过适应性喂养7 d后，随机选取10只小鼠作为正常对照组（normal controlgroup，NC），对其余小鼠腹腔注射80 mg/kg CTX，建立免疫抑制小鼠模型。采用SPSS软件将免疫抑制小鼠随机分为5组，每组10只，分别为模型对照组（model control group，MC）、阳性对照组（positive control group，PC）、红枣多糖低剂量组（low dose HP treated group，HP-L）、红枣多糖中剂量组（middle dose HP treated group，HP-M）、红枣多糖高剂量组（high dose HP treated group，HP-H）。红枣多糖（HP）冻干粉用生理盐水溶解，红枣多糖低剂量组（HP-L）小鼠按50 mg/（d·kg bw）进行灌胃，红枣多糖中剂量组（HP-M）小鼠按100 mg/（d·kg bw）进行灌胃，红枣多糖高剂量组（HP-H）按150 mg/（d·kg bw）进行灌胃，连续灌胃7 d后，所有小鼠禁食12 h，处死。

1.3.4 代谢组学实验流程

代谢组学实验流程见图1。

液相色谱-质谱联用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）检测条件如下。

色谱条件：ACQUITY UPLC@HSS T3（2.1 mm× 100 mm，1.8 µm）色谱柱，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 µL。

质谱条件：正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为-2.50 kV，鞘气5.80 psi（1 psi=6.895 kPa），辅助气1.45 psi。毛细管温度325 ℃，以分辨率60 000进行一级全扫描，一级离子扫描范围m/z 100～1 000，并采用高能碰撞解离（higher-energy collisional dissociation，HCD）进行二级裂解，碰撞能量为30%，二级分辨率为15 000（m/z 200 处）。

1.4 数据分析

通过Proteowizard软件包（v3.0.8789）中MSConvert工具将原始质谱下机文件转换为mzXML文件格式。采用R XCMS软件包进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理。p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著，p＜0.001为差异高度显著。

2 结果与分析

2.1 红枣多糖（HP）对免疫抑制小鼠免疫球蛋白表达的影响

HP对免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白水平的影响见图2。

由图2（A）可知，与正常对照组（NC）小鼠相比，环磷酰胺能够高度显著降低小鼠血清中IgA的表达水平（p＜0.001）。红枣多糖干预后，与模型对照组（MC）免疫抑制小鼠相比，HP-M、HP-H和PC组小鼠血清中IgA的表达水平高度显著升高（p＜0.001）。由图2（B）可知，与NC组小鼠相比，环磷酰胺（CTX）可以高度显著降低小鼠血清中IgM的表达水平（p＜0.001）。红枣多糖干预后，与模型对照组（MC）免疫抑制小鼠相比，HP-L组小鼠血清中IgM的表达水平无显著变化，HP-M、HP-H和PC组小鼠血清中IgM的表达水平极显著上升（p＜0.01）。说明红枣多糖可以通过促进免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白IgA和 IgM 的表达来增强机体的免疫能力。与HP-M组相比，HP-H组的增强效果更佳，因此本研究以红枣多糖高剂量组[150 mg/（d·kg bw）]为红枣多糖受试组进行血清代谢组学分析。

2.2 红枣多糖（HP）作用于免疫抑制小鼠的代谢组学分析

2.2.1 样本代谢谱的整体分析及多元统计分析

通过LC-MS对未处理的正常对照组（NC）小鼠、造模成功的模型对照组（MC）小鼠以及给予红枣多糖干预的受试组（HP）小鼠进行代谢轮廓比较。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，能够观察到各组小鼠血清样本的代谢轮廓分布情况。基于PCA结果，采用正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）对数据进行更深入的挖掘与解析。

2.2.1.1 样本总离子流色谱结果

正常对照组（NC）、模型对照组（MC）和红枣多糖受试组（HP）的总离子流图结果如图3所示。

由图3可知，各峰形对称且基线平稳，呈现出较好的分离度色谱峰，其反应时间与相对强度具有相对稳定性。

2.2.1.2 样本主成分分析

正常对照组（NC）和模型对照组（MC）对比及红枣多糖受试组（HP）与模型对照组（MC）对比的PCA得分散点图如图4所示。

由图4可知，正常对照组（NC）与模型对照组（MC）样品区分明显，表示环磷酰胺导致小鼠代谢物发生变化；模型对照组（MC）与红枣多糖受试组（HP）样品在负离子模式下，第一主成分有一定的分离趋势。

2.2.1.3 样本正交-偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）

样本正交-偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）具有比主成分分析更好的分离效果，通过在正负离子模式下对模型对照组（MC）与正常对照组（NC）、红枣多糖受试组（HP）与模型对照组（MC）进行对比，其样本正交-偏最小二乘法-判别分析得分图如图5所示。

由图5（a）和图5（b）可知，在正离子模式下，NC组与MC组呈现出明显的分离趋势，HP组与MC组之间也具有明显的分离趋势。由图5（c）和图5（d）可知，在负离子模式下，NC组与MC组、HP组与MC组样品均明显分离，表明环磷酰胺改变了正常小鼠的代谢物变化，红枣多糖干预也改变了免疫抑制小鼠的代谢物变化。

2.2.1.4 置换检验

通过OPLS-DA 置换检验对各组之间的代谢物变化进一步分析，结果如图6所示。

由图6可知，在正负离子模式下，正常对照组（NC）与模型对照组（MC）小鼠血清OPLS-DA模型解析程度参数R2X分别为0.473和0.464，R2Y为0.993和0.998，预测能力参数Q2分别为0.886和0.936，满足预测的R2和Q2点均低于右上的原始R2和Q2点，置换检验结果符合要求；在正负离子模式下，计算得出模型对照组（MC）和红枣多糖受试组（HP）小鼠血清OPLS-DA模型解析程度参数R2X分别为0.461和0.373，R2Y为0.998和0.991，预测能力参数Q2分别为0.696和0.587，满足预测的R2和Q2点均低于右上的原始R2和Q2点，置换检验结果符合要求表明该模型在正负离子模式下均具有较高的可解释度和可预测度，可对数据进行分析。

2.2.2 差异代谢物的可视化分析

火山图分析与层次聚类法两种手段，具有可视化特性，被广泛应用于生物样本组的比较研究领域。火山图能够同时反映变化倍数与统计显著性这两个维度的信息，层次聚类可以揭示样本间相似性关系。

2.2.2.1 差异代谢物火山图分析

差异代谢物筛选火山图见图7。

由图7（a）可知，正常对照组（NC）和模型对照组（MC）小鼠血清中存在783 种差异代谢物，其中328 种差异代谢物上调，455 种差异代谢物下调。由图7（b）可知，模型对照组（MC）和红枣多糖受试组（HP）小鼠血清中存在303 种差异代谢物，其中207 种差异代谢物上调，96 种差异代谢物下调。

2.2.2.2 差异代谢物的层次聚类分析

为了评价差异代谢产物的合理性，全面显示样品之间的关系，对各组样品中差异代谢物进行层次聚类分析。模型对照组（MC）与正常对照组（NC），红枣多糖受试组（HP）与模型对照组（MC）的聚类分析图如图 8所示。不同颜色的深浅标识差异代谢物的相对表达，高表达以红色表示，低表达以蓝色表示。

由图8可知，模型对照组（MC）与正常对照组（NC），红枣多糖受试组（HP）与模型对照组（MC）样品中存在差异代谢物上调或下调情况。

2.2.3 差异代谢物的鉴定与筛选

将p＜0.05和投影重要性指标（variable importance in the projection，VIP）＞1.0的内源性物质作为潜在的差异代谢物，筛选出正常对照组（NC）与模型对照组（MC）样品中存在783 种差异代谢物，红枣多糖受试组（HP）与模型对照组（MC）样品中存在303 种差异代谢物，主要的差异代谢物如表1、表2所示。其中与免疫调节相关的差异代谢物有缬氨酸、苯丙氨酸及脯氨酸。

有文献表明，缬氨酸和苯丙氨酸是潜在的免疫调节代谢产物[15-16]。由表1和表2可知，与正常对照组（NC）相比，模型对照组（MC）小鼠血清中缬氨酸的含量显著下降（p＜0.05），说明环磷酰胺（CTX）导致小鼠的氨基酸代谢异常；红枣多糖干预后，与模型对照组（MC）相比，红枣多糖能够显著提高小鼠血清中缬氨酸和苯丙氨酸的含量（p＜0.05）。Gao等[17]研究发现，乳杆菌 ZJ615 能够改变脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠肠道内容物中的苯丙氨酸与缬氨酸，进而调节宿主肠道内氨基酸的利用。研究发现，脯氨酸能够调节线粒体功能，影响细胞的增殖或死亡[18]。脯氨酸代谢与不同细胞间的各种代谢途径相协调，并且脯氨酸积累与许多细胞过程密切相关。与正常对照组（NC）相比，模型对照组（MC）小鼠血清中脯氨酸含量显著下降（p＜0.05）；与模型对照组（MC）相比，红枣多糖受试组（HP）小鼠血清中脯氨酸的含量显著升高，因此可以推测出红枣多糖能够通过调节免疫抑制小鼠脯氨酸的代谢来缓解小鼠的氧化应激以及抵挡病原体的入侵，从而增强免疫抑制小鼠的免疫调节能力[19-20]。以上结果表明，缬氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸是红枣多糖作用于免疫抑制小鼠的生物标志物。

2.2.4 差异代谢物的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

差异代谢物的KEGG富集分析结果如图9所示。

由图9可知，与正常对照组（NC）相比，模型对照组（MC）小鼠代谢通路的差异主要以花生四烯酸代谢、产生IgA的肠道免疫网络、牛磺酸和低牛磺酸代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR）信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢、柠檬酸（tricarboxylic cycle acid，TCA）循环、精氨酸的生物合成、小细胞肺癌、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、癌症中的中心碳代谢这11条代谢通路为主。与模型对照组（MC）相比，红枣多糖干预后，差异代谢物主要富集于转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-beta）信号通路、亚油酸代谢、磷酸戊糖途径、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）信号通路和哮喘等代谢途径，其中亚油酸代谢途径与机体的免疫调节能力有关。研究发现，TCA 循环是碳水化合物、脂肪和氨基酸发生氧化的共同途径，能为机体提供能量[21-22]。与正常对照组（NC）相比，环磷酰胺（CTX）可以使小鼠血清中的柠檬酸含量降低。红枣多糖干预后，与模型对照组（MC）相比，红枣多糖能够提高小鼠血清中柠檬酸的水平，进一步促进脂肪酸的合成过程。与正常对照组（NC）相比，环磷酰胺能够显著增加差异代谢物（9Z，12Z，15Z）-十八碳- 9，12，15-三烯酸的含量（p＜0.05）。与模型对照组相比，红枣多糖能够显著降低（9Z，12Z，15Z）-十八碳- 9，12，15-三烯酸的含量，并且显著增加亚油酸的含量，说明红枣多糖可以通过调节亚油酸代谢途径来减轻环磷酰胺对小鼠造成的免疫低下，从而发挥免疫调节作用。

3 结论

目前已发现多种具有免疫调节活性的植源性天然产物，如皂苷类、酯类、多糖类等。本研究采用LC-MS技术，将模型对照组（MC）和红枣多糖受试组（HP）小鼠血清进行差异代谢物分析，结果表明，模型对照组（MC）和红枣多糖受试组（HP）小鼠血清中存在303 种差异代谢物，其中207 种差异代谢物上调，96 种差异代谢物下调，并发现缬氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸是红枣多糖作用于免疫抑制小鼠的生物标志物。红枣多糖作用于免疫抑制小鼠的差异代谢物的KEGG分析表明，差异代谢物主要富集在TGF-beta信号通路、亚油酸代谢、磷酸戊糖途径、PPAR 信号通路和哮喘等代谢通路，其中亚油酸代谢途径与机体的免疫调节能力有关。说明红枣多糖可以通过调节免疫抑制小鼠内代谢物的产生，从而发挥免疫调节活性。

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