随着人口快速老龄化和预期寿命延长，糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）发病率持续攀升，疾病进展最终可导致终末期肾病[1]。此类患者通常需依赖肾脏透析或肾移植进行治疗[2]。肾间质纤维化是DKD不可逆的特征性病理改变，其核心机制为纤连蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白等细胞外基质过度沉积，在疾病进展中发挥关键作用[3]。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smads信号通路可介导细胞外基质积累，直接诱发纤维化病变[4]，因此抑制该通路被认为是预防DKD的潜在治疗策略。此外，活性氧过量产生和炎症因子释放是导致肾功能不全及肾纤维化的重要因素[5]，而肾凋亡作为DKD进展的核心生物学指标，从疾病早期至终末期在肾小球和肾小管中持续发生[6]，细胞色素c释放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）激活是线粒体通路调控肾凋亡的特征性标志[7]。目前临床药物对DKD的治疗效果尚不理想，开发新型替代疗法以控制病情进展已成为迫切需求[8]。
三疣梭子蟹是我国重要的经济海产品，其卵中富含磷脂类成分。前期研究已从三疣梭子蟹卵中鉴定出12种磷脂，主要包括磷脂酰胆碱（32.28%）、磷脂酸（19.61%）、磷脂酰丝氨酸（26.51%）、磷脂酰乙醇胺（8.81%）和磷脂酰肌醇（7.96%）[9]。三疣梭子蟹卵源磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine from Portunus trituberculatus eggs，Pt-PS）中富含多不饱和脂肪酸，其中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）占比超过50%。前期研究证实了Pt-PS可改善高脂饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素抵抗并调节肠道菌群[10]，但其在2型糖尿病相关肾脏疾病中的作用尚未得到验证。因此，本文通过链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）结合高脂饮食（high-fat diet，HFD）诱导的2型糖尿病小鼠模型，在体内探讨Pt-PS的肾脏保护作用，重点检测其对TGF-β/Smads信号通路和线粒体依赖性凋亡通路的影响，并评估其对氧化应激和炎症反应的调控作用，旨在为海洋生物活性产物的临床应用提供理论依据，明确Pt-PS作为新型肾脏保护剂的潜力。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜三疣梭子蟹卵（-20 ℃冷冻保存）：市售；氯仿、甲醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；C57BL/6J小鼠（雄性，6周龄）：北京维通利华实验动物技术有限公司；标准饲料、高脂饲料：跬步千里生物科技（宣城）有限责任公司；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：美国Invitrogen公司；二甲苯、脂肪专用固定液、苏木精—伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液套装、马松（Masson）染色液、天狼星红染液：武汉赛维尔生物科技有限公司；纤维连接蛋白抗体、II型胶原蛋白抗体、Bax抗体、剪切型胱天蛋白酶抗体、Bcl-2抗体、细胞色素c抗体：圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记聚合物、磷酸盐缓冲液：赛维尔生物科技有限公司；Trizol试剂、SYBR绿色荧光染料、IP裂解缓冲液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒、三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane-buffered saline with tween-20，TBST]缓冲液、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）含量检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；肾脏氧化及代谢物试剂盒（尿糖、总蛋白、尿酸、肌酐、白蛋白、尿白蛋白、血尿素氮、尿尿素氮、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶）、小鼠血清酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-10）、胰岛素检测ELISA试剂盒、血糖含量测试试剂盒：上海酶联生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
1200型高效液相色谱：安捷伦科技有限公司；BX43F型荧光显微镜：日本奥林巴斯公司；iQ5型实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Tanon 5200化学发光成像仪：上海天能科技有限公司；XS105DU电子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。
1.3 方法
1.3.1 Pt-PS的制备
参照前期研究方法[10]提取Pt-PS，先采用氯仿-甲醇法提取三疣梭子蟹卵中的总脂质，通过硅胶柱层析分离，获得磷脂组分，再利用高效液相色谱从磷脂组分中纯化Pt-PS。
1.3.2 动物实验
雄性C57BL/6J小鼠（6周龄），饲养于温度（23±1） ℃、12 h光照/黑暗周期的环境中，单笼饲养。所有实验方案均经浙江海洋大学动物伦理委员会批准（伦理号：20210310）。将小鼠随机分为4组（每组10只）：对照组（喂食标准饲料，腹腔注射与其他组等体积的生理盐水）、STZ/HFD组[喂食高脂饲料（29%碳水化合物、16%蛋白质、55%脂肪），第8周腹腔注射40 mg/kg STZ）]、0.50% Pt-PS组（饲料中添加0.50% Pt-PS，其余同STZ/HFD组处理）、1.50% Pt-PS组（饲料中添加1.50% Pt-PS，其余同STZ/HFD组处理）。22周实验方案结束后，连续3 d收集24 h尿液样本进行代谢指标定量分析；第23周进行小鼠心脏穿刺取血和双侧肾切除获取肾组织，去除结缔组织，生理盐水冲洗并吸干水分，称量双侧肾脏总质量。
实验前测初始体质量，每周固定时间测定1次，处死前测终末体质量；每2周采用“3天称量法”，记录初始饲料量、剩余总饲料量（含洒落量），排除污染饲料，计算小鼠日均摄入量；热量摄入基于食物摄入量与饲料热量密度计算（标准饲料约15.9 kJ/g，高脂饲料约21.8 kJ/g）。
1.3.3 尿液和血液指标检测
采用血糖含量测试试剂盒检测空腹血糖水平，通过胰岛素检测ELISA试剂盒检测血清胰岛素浓度，计算胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR），计算公式如下。
式中：H为HOMA-IR；Y为胰岛素浓度，mU/L；K为空腹血糖水平，mmol/L；22.5为标准化常数。
通过肾脏氧化及代谢物试剂盒检测尿糖含量、总蛋白含量、尿酸含量、白蛋白含量、肌酐含量、尿白蛋白含量、血尿素氮浓度、尿尿素氮浓度及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶浓度，以评估肾脏功能。
1.3.4 HE染色、天狼星红染色和Masson染色
肾组织样本经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，制备6 µm连续切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，进行HE染色以评估肾脏组织结构；采用天狼星红染液染色和Masson染色显示胶原沉积，对肾小管萎缩程度和肾脏纤维化区域进行定量分析，胶原沉积以红色或蓝色显色为阳性，计算阳性区域占总横截面积的比值。
1.3.5 免疫组织化学染色
石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，山羊血清封闭后，切片与纤维连接蛋白抗体（1∶100，体积比）、II型胶原蛋白抗体（1∶100，体积比）、Bax抗体（1∶100，体积比）、剪切型胱天蛋白酶抗体（1∶100，体积比）、Bcl-2抗体（1∶100，体积比）、细胞色素c抗体（1∶100，体积比）于4 ℃孵育过夜。经HRP标记聚合物孵育和苏木精-伊红染液复染后，用荧光显微镜观察切片，并通过Image J软件对免疫染色区域进行定量。
1.3.6 肾脏氧化应激和炎症相关指标检测
肾组织在磷酸盐缓冲液（pH7.2）中匀浆，7 500×g离心10 min，取上清液检测氧化应激和炎症相关指标。采用相应试剂盒检测6项氧化应激相关指标：MDA含量、CAT活性、SOD活性、T-AOC、NO含量和GSH-Px活性；通过小鼠血清ELISA试剂盒检测4种肾脏炎症因子[肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）]的水平。
1.3.7 实时荧光定量PCR
采用Trizol试剂提取肾组织总RNA并逆转录为cDNA，在qRT-PCR仪上使用SYBR绿色荧光染料进行扩增。扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，共42个循环。PCR引物序列如表1所示。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因，检测TGF-β1、Smad2和Smad3的mRNA表达水平。
表1 PCR引物序列
Table 1 PCR primer sequences
基因正向引物反向引物TGF-β15′-GATTGTTGCCATCAACGACC-3′5′-GTGCAGGATGCATTGCTGAC-3′Smad25′-GCTCTCCGGCTGAACTGTCT-3′5′-GTGCCAGCCGTATCTCTGGT-3′Smad35′-CCAGCACACAATAACTTGGA-3′5′-AGACACACTGGAACAGCGGA-3′TNF-α5′-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT-3′5′-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3′IL-1β5′-CTCGGCCAAGACAGGTCGCTC-3′5′-CCCCCACACGTTGACAGCTAGG-3′IL-65′-TTCTTGGGACTGATGCTG-3′5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT-3′IL-105′-GGAGGGGTTCTTCCTTGGGA-3′5′-GTTTTCAGGGATGAAGCGGC-3′β-actin5′-CAAGGCATTGCTGACAGGATG-3′5′-TGCTGATCCACATCTGCTGG-3′
1.3.8 蛋白质免疫印迹（western blot，WB）分析
采用IP裂解缓冲液提取肾组织总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）定量后，经10% SDS-PAGE分离后转移至聚偏二氟乙烯膜，封闭后与相应一抗4 ℃过夜孵育，用TBST缓冲液清洗3次，加入二抗室温孵育1 h，使用化学发光成像仪显影。以β-actin作为内参，检测TGF-β1、Smad2、Smad3、剪切型胱天蛋白酶、Bax、Bcl-2、TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的蛋白表达量。
1.3.9 肾组织细胞质组分分离
肾组织在IP裂解缓冲液中匀浆，经14 000×g、4 ℃离心30 min，再经100 000×g、4 ℃离心10 min，收集上清液，通过WB检测细胞色素c蛋白表达。
1.4 统计学分析
数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析后进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 Pt-PS对2型糖尿病小鼠基本生理指标、血液及尿液肾功能相关参数的影响
Pt-PS对2型糖尿病小鼠基本生理指标、血液及尿液肾功能相关参数的影响见表2。
表2 Pt-PS对2型糖尿病小鼠基本生理指标、血液及尿液肾功能相关参数的影响
Table 2 Effects of Pt-PS on basic physiological parameters and blood，urine renal function-related parameters of the mouse model of type 2 diabetes mellitus
注：与对照组相比，#表示差异显著（P＜0.05），##表示差异极显著（P＜0.01）；与STZ/HFD组相比，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
血液尿液食物摄热量体质量肾脏质组别入量/摄入/空腹血糖胰岛素血尿素氮尿糖总蛋白尿酸白蛋白肌酐尿白蛋白β-N-乙酰氨基尿尿素增量/gHOMA-（g/周）（kJ/周）量/mg水平/浓度/浓度/含量/含量/含量/含量/含量/含量/肌酐葡萄糖苷酶氮浓度/IR（mmol/L）（mU/L）（mmol/L）（µmol/L）（g/L）（g/L）（g/L）（mmol/L）含量浓度/（U/L）（mol/L）对照组11.78±31.34±537.0±38.61±7.54±9.07±3.04±8.06±0.17±1.56±0.69±0.81±0.67±1.21±3.20±0.78±1.413.0543.80.970.630.810.320.700.010.090.030.040.050.090.210.06 STZ/26.15±26.09±716.3±121.22±12.32±14.23±7.79±16.27±1.12±3.73±1.42±3.09±1.50±2.06±6.72±1.88±HFD组3.88##2.82#56.6#2.65##1.04##1.13##0.89##0.96##0.08##0.35##0.09##0.33##0.14##0.12##0.62##0.17##0.50% 20.07±26.84±736.6±80.03±10.36±12.07±5.56±14.34±0.88±3.39±1.13±2.55±1.46±1.74±6.75±1.35±Pt-PS组2.30*3.7465.61.47**0.88*0.71*0.78*0.820.07*0.330.11*0.23*0.170.14*0.560.08*1.50% 16.54±26.58±729.6±57.97±8.65±10.36±3.98±8.31±0.74±2.42±0.85±1.63±1.02±1.60±5.15±1.14±Pt-PS组2.03**2.8958.31.19**0.93**0.92**0.45**0.62**0.02**0.14**0.08**0.12**0.08**0.11*0.41**0.09**
如表2所示，与对照组相比，STZ/HFD组小鼠体质量增量极显著增加（P＜0.01），这与高热量饮食的摄入相关；与对照组相比，STZ/HFD组小鼠的肾脏质量、空腹血糖水平、胰岛素浓度及HOMA-IR均极显著升高（P＜0.01），表明具有肥胖和胰岛素抵抗特征的2型糖尿病小鼠模型成功构建。与STZ/HFD组相比，0.50% Pt-PS组和1.50% Pt-PS组小鼠的体质量增量、肾脏质量、空腹血糖水平、胰岛素浓度及HOMA-IR均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），热量摄入无统计学差异（P＞0.05）。上述结果表明，Pt-PS可有效改善2型糖尿病相关的代谢紊乱。
由表2可知，与STZ/HFD组相比，1.50% Pt-PS组小鼠的血尿素氮和尿尿素氮浓度均极显著降低（P＜0.01），0.50% Pt-PS组小鼠的尿尿素氮浓度显著下降（P＜0.05）。此外，与STZ/HFD组相比，1.50% Pt-PS组显著降低了小鼠的尿糖含量、总蛋白含量、尿酸含量、白蛋白含量、肌酐含量、尿白蛋白含量与肌酐含量比值及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶浓度（P＜0.05，P＜0.01）。以上结果表明，Pt-PS可多维度改善肾脏功能指标，具有肾脏保护功效。
2.2 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾损伤、肾纤维化的影响Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾损伤的影响见图1。
图1 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾损伤的影响
Fig.1 Effects of Pt-PS on renal damage in mice treated with STZ/HFD
由图1可知，与STZ/HFD组相比，0.50% Pt-PS组和1.50% Pt-PS组均能显著抑制STZ/HFD诱导的肾小管萎缩（P＜0.05，P＜0.01）。与对照组相比，STZ/HFD组小鼠肾小球和肾间质中的胶原积累极显著增加，而0.50% Pt-PS组和1.50% Pt-PS组可不同程度减少胶原沉积（P＜0.05，P＜0.01）。
为进一步验证Pt-PS对肾纤维化的治疗作用，通过免疫组织化学染色、qRT-PCR和WB检测肾纤维化相关指标，结果分别见图2～图4。
图2 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾纤维化的影响
Fig.2 Effects of Pt-PS on renal fibrosis in mice treated with STZ/HFD
由图2可知，与STZ/HFD组相比，0.50% Pt-PS组和1.50% Pt-PS组可以明显降低小鼠肾脏中纤维连接蛋白和Ⅱ型胶原蛋白的浓度。由图3可知，与STZ/HFD组相比，1.50% Pt-PS组显著下调了STZ/HFD诱导的TGF-β1、Smad2和Smad3的mRNA表达（P＜0.05，P＜0.01）；0.50% Pt-PS组显著下调了TGF-β1和Smad2的mRNA表达（P＜0.05）。由图4可知，1.50% Pt-PS可极显著降低STZ/HFD小鼠肾脏中TGF-β1、Smad2和Smad的蛋白表达（P＜0.01）；与STZ/HFD组相比，0.50%Pt-PS组小鼠的Smad3蛋白表达显著降低（P＜0.05），而TGF-β1和Smad2的蛋白表达水平与STZ/HFD组无统计学差异。上述结果表明，Pt-PS通过抑制TGF-β/Smads信号通路缓解肾纤维化。
图3 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾纤维化相关基因mRNA表达的影响
Fig.3 Effects of Pt-PS on the mRNA levels of genes associated with renal fibrosis in mice treated with STZ/HFD
图4 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表达的影响
Fig.4 Effects of Pt-PS on the protein levels of TGF-β1， Smad2，and Smad3 in the kidneys of mice treated with STZ/HFD
2.3 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏细胞凋亡的影响
凋亡是糖尿病肾病进展过程中的常见严重病理改变，caspase 3可被关键蛋白细胞色素c激活，是凋亡的特征性标志物。免疫组织化学染色和WB结果见图5、图6。
图5 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏细胞凋亡相关蛋白的免疫组织化学染色结果的影响
Fig.5 Effects of Pt-PS on the immunohistochemical staining results of renal apoptosis-related proteins in mice treated with STZ/HFD
图6 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏细胞凋亡相关蛋白的免疫印迹结果的影响
Fig.6 Effects of Pt-PS on the western blot results of renal apoptosis-related proteins in mice treated with STZ/HFD
由图5、图6可知，与对照组相比，STZ/HFD组小鼠肾脏中剪切型胱天蛋白酶和细胞质细胞色素c蛋白表达水平极显著升高（P＜0.01），表明模型动物存在明显凋亡；与STZ/HFD组相比，1.50% Pt-PS组剪切型胱天蛋白酶和细胞质细胞色素c浓度显著降低（P＜0.05，P＜0.01），0.50% Pt-PS组细胞色素c浓度也显著降低（P＜0.05）。此外，与STZ/HFD组相比，0.50% Pt-PS组和1.50% Pt-PS组均显著降低了Bax蛋白表达水平（P＜0.05，P＜0.01）。与STZ/HFD组相比，1.50% Pt-PS组的Bax蛋白表达水平极显著降低（P＜0.01），且Bcl-2蛋白表达水平极显著升高（P＜0.01）。上述数据表明，Pt-PS可抑制肾脏细胞凋亡。
2.4 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏氧化应激的影响
Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏氧化应激的影响见图7。
图7 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏氧化应激的影响
Fig.7 Effects of Pt-PS on renal oxidative stress in mice treated with STZ/HFD
活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量产生可诱导肾功能障碍和损伤，由图7可知，与对照组相比，STZ/HFD组小鼠的MDA含量和NO含量极显著升高（P＜0.01），GSH-Px活性、SOD活性、T-AOC和CAT活性极显著降低（P＜0.01），表明模型动物存在明显的肾脏氧化应激。与STZ/HFD组相比，1.50% Pt-PS组使MDA含量和NO含量分别极显著降低了32.43%和19.68%（P＜0.01），使GSH-Px活性、SOD活性、T-AOC和CAT活性分别升高24.30%、30.34%、109%和57.90%（P＜0.05，P＜0.01）；与STZ/HFD组相比，0.50% Pt-PS组显著降低了MDA含量（P＜0.05），并显著提高了GSH-Px活性和T-AOC（P＜0.05，P＜0.01）。以上结果表明，Pt-PS可抑制2型糖尿病小鼠的肾脏氧化应激。
2.5 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏炎症的影响
炎症是加重2型糖尿病患者肾功能障碍和损伤的重要因素，本研究检测了Pt-PS对肾脏炎症的影响，结果见图8、图9。
图8 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏炎症因子浓度的影响
Fig.8 Effects of Pt-PS on the concentrations of renal inflammatory factors in mice treated with STZ/HFD
图9 Pt-PS对STZ/HFD小鼠肾脏炎症因子蛋白和mRNA表达的影响
Fig.9 Effects of Pt-PS on the protein and mRNA levels of renal inflammatory factors in mice treated with STZ/HFD
由图8可知，与STZ/HFD组相比，1.50% Pt-PS组小鼠肾脏中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度显著降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-10的浓度极显著升高（P＜0.01）；0.50% Pt-PS组小鼠TNF-α和IL-6的浓度显著降低（P＜0.05）。
由图9可知，与STZ/HFD组相比，1.50% Pt-PS组极显著下调了TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达和TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达，上调了IL-10的蛋白表达和IL-10的mRNA表达（P＜0.01）；0.50% Pt-PS组的TNF-α和IL-6的mRNA表达显著降低（P＜0.05），IL-10的mRNA表达显著升高（P＜0.05），IL-6蛋白表达显著降低（P＜0.05）。这些数据表明，Pt-PS可减轻2型糖尿病小鼠的肾脏炎症。
3 讨论与结论
高血糖、活性氧异常产生及炎症反应可导致肾脏损伤和功能障碍。本研究旨在探究Pt-PS对2型糖尿病小鼠肾脏的保护作用及机制。前期研究已证实Pt-PS具有降血糖功效，本研究进一步发现，Pt-PS可显著改善STZ/HFD诱导的2型糖尿病小鼠肾脏损伤和纤维化，肾纤维化主要经由TGF-β/Smads信号通路介导[11]，该通路可被细胞外基质分子合成激活[12]。Pt-PS可降低体质量增量、尿糖含量、总蛋白含量、尿酸含量、白蛋白含量、肌酐含量、尿白蛋白含量与肌酐含量比值、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶浓度及血/尿素氮浓度，逆转肾小球功能受损相关指标异常，缓解肾小管萎缩等病理改变。
机制研究表明，Pt-PS通过多重途径发挥肾脏保护作用：通过抑制TGF-β/Smads信号通路发挥抗肾纤维化作用[13-14]，明显降低肾脏中TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表达，减少肾小球和肾间质胶原沉积及纤维连接蛋白和Ⅱ型胶原蛋白的异常积聚，这些证据表明，Pt-PS的抗纤维化作用可归因于其对TGF-β/Smads信号通路的阻断。该作用与黄芪多糖[15]、黄芩苷[16]等天然活性物质的抗纤维化机制一致。
DKD的发生与代谢紊乱密切相关，高血糖、肥胖、氧化应激和炎症等因素会显著增加DKD患病风险，可单独或协同激活TGF-β/Smads信号通路[17]，同时会显著加速肾脏细胞凋亡的进程[18]。本研究显示，STZ/HFD诱导的2型糖尿病小鼠表现为高血糖、肥胖和肾脏质量/体质量比值升高，而Pt-PS干预可明显改善这些指标，且该改善作用与肾功能障碍及纤维化的缓解密切相关。Pt-PS通过阻断线粒体通路抑制肾细胞凋亡，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax、胞浆细胞色素c及剪切型胱天蛋白酶水平；Pt-PS通过改善氧化应激状态，降低肾脏MDA含量和NO含量，提升SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性和T-AOC；Pt-PS通过调节炎症反应，降低TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度及mRNA、蛋白表达，升高抗炎症因子IL-10水平，这些改善作用与TGF-β/Smads通路的阻断密切相关。多项研究证实氧化应激和促炎因子的缓解可抑制肾纤维化，如Liu等[19]证实沙蟾毒精A可通过改善SOD、MDA和GSH-Px等氧化应激指标来缓解肾纤维化；Jiang等[20]发现薯蓣皂苷元能通过减少IL-1β和IL-6等全身促炎细胞因子来减轻肾纤维化和细胞凋亡。这些证据共同表明，Pt-PS对炎症和氧化应激的抑制与其在2型糖尿病小鼠中表现的肾脏保护活性存在强关联性。
本研究证实Pt-PS可抑制STZ/HFD诱导的2型糖尿病小鼠的肾脏损伤和功能障碍，该作用与其改善高血糖和肥胖状态密切相关。Pt-PS通过抑制TGF-β/Smads信号转导缓解肾纤维化，通过阻断线粒体通路抑制肾凋亡，且其对氧化应激和炎症反应的改善作用也参与了肾脏保护机制。综上，Pt-PS具有开发为DKD辅助治疗药物的潜力。
[1] BAVANANDAN S, NORONHA I L, TCHOKHONELIDZE I, et al.Metabolic disorder-associated kidney disease and diabetic kidney disease in developing countries[J]. Kidney International, 2025, 108(3): 380-387.
[2] HUO J L, LI P P, FENG Q, et al. Targeting mitochondrial dysfunction by natural products for the treatment of diabetic kidney disease[J]. Phytotherapy Research, 2025, 39(12): 5717-5743.
[3] NI L H, ZHOU Q Y, GAO X Y, et al. EphrinB2 alleviates tubulointerstitial fibrosis in diabetic kidney disease[J]. Journal of Translational Medicine, 2025, 23(1): 821.
[4] WANG X, SUN Z G, FU J, et al. LRG1 loss effectively restrains glomerular TGF-β signaling to attenuate diabetic kidney disease[J].Molecular Therapy, 2024, 32(9): 3177-3193.
[5] ZHENG Y, YI H X, ZHAN Z X, et al. Reactive oxygen/nitrogen species scavenging and inflammatory regulation by renal-targeted bio-inspired rhodium nanozymes for acute kidney injury theranostics[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2024, 662: 413-425.
[6] HE S S, LI X Y, HE Y Y, et al. High-density lipoprotein nanoparticles spontaneously target to damaged renal tubules and alleviate renal fibrosis by remodeling the fibrotic niches[J]. Nature Communications, 2025, 16: 1061.
[7] LI J Y, SUN X, WANG X, et al. PGAM5 exacerbates acute renal injury by initiating mitochondria-dependent apoptosis by facilitating mitochondrial cytochrome c release[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2024, 45(1): 125-136.
[8] 岑筠, 王英, 黄利华. 糖尿病肾病发病机制及临床治疗的应用研究进展[J]. 广州城市职业学院学报, 2025, 19(1): 90-95.CEN Yun, WANG Ying, HUANG Lihua. Progress in the pathogenesis and clinical treatment of diabetic nephropathy[J]. Journal of Guangzhou City Polytechnic, 2025, 19(1): 90-95.
[9] SU L J, ZHU H L, CHEN S C, et al. Anti-obesity and gut microbiota regulation effects of phospholipids from the eggs of crab, Portunus trituberculatus, in high fat diet-fed mice[J]. Marine Drugs,2022, 20(7): 411.
[10] HU S W, DU M Y, SU L J, et al. Phosphatidylserine from Portunus trituberculatus eggs alleviates insulin resistance and alters the gut microbiota in high-fat-diet-fed mice[J]. Marine Drugs, 2020, 18(9):483.
[11] 肖雅文, 肖瑛, 郭兵. 糖尿病肾小管-间质纤维化进程中负性调控相关蛋白的研究进展[J]. 生理科学进展, 2022, 53(3): 200-206.XIAO Yawen, XIAO Ying, GUO Bing. Research progress on negative regulation-related proteins in the renal tubular-interstitial fibrosis process in diabetes[J]. Progress in Physiological Sciences, 2022,53(3): 200-206.
[12] 张博玲, 金智生, 陈彦旭, 等. TGF-β1/ERK信号通路与糖尿病肾病肾纤维化的发病机制研究进展[J]. 实用中医内科杂志,2023, 37(9): 38-41, 181.ZHANG Boling, JIN Zhisheng, CHEN Yanxu, et al. Research progress on TGF-β1/ERK signaling pathway and pathogenesis of diabetic nephropathy renal fibrosis[J]. Journal of Practical Traditional Chinese Internal Medicine, 2023, 37(9): 38-41, 181.
[13] BHADANGE R, DAGAR N, GAIKWAD A B. Levosimendan mitigates renal fibrosis via TGF-β1/Smad axis modulation in UUO rats[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2025, 187: 118124.
[14] WEI Q H, PAN Y B, TIAN L L, et al. Sang-Bai-Pi extract and its constituent regiafuran C ameliorate renal fibrosis through TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin signaling pathways[J]. Phytomedicine,2025, 136: 156351.
[15] MENG X, WEI M M, WANG D, et al. Astragalus polysaccharides protect renal function and affect the TGF-β/Smad signaling pathway in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. The Journal of International Medical Research, 2020, 48(5): 0300060520903612.
[16] WANG H, JIANG Q T, ZHANG L Z. Baicalin protects against renal interstitial fibrosis in mice by inhibiting the TGF-β/Smad signalling pathway[J]. Pharmaceutical Biology, 2022, 60(1): 1407-1416.
[17] 王一帆, 郭建波, 邵宝仪, 等. TGF-β1/SMAD在糖尿病肾病中的作用机制与研究进展[J]. 四川大学学报(医学版), 2023, 54(6):1065-1073.WANG Yifan, GUO Jianbo, SHAO Baoyi, et al. The role of TGF-β1/SMAD in diabetic nephropathy: Mechanisms and research development[J]. Journal of Sichuan University (Medical Sciences), 2023,54(6): 1065-1073.
[18] SHARAWI Z W, ABASS S A, ZUBAIR M A, et al. Khellin mitigates cisplatin-induced renal injury by targeting oxidative stress, inflammation, and apoptosis: Integration of network pharmacology,molecular docking, and preclinical validation[J]. Pharmaceuticals,2025, 18(6): 836.
[19] LIU H L, HUANG Z, LI Q Z, et al. Schisandrin A alleviates renal fibrosis by inhibiting PKCβ and oxidative stress[J]. Phytomedicine,2024, 126: 155372.
[20] JIANG S S, PAN S, HU X, et al. Modulating the gut microbiota and inflammation is involved in the effect of diosgenin against diabetic nephropathy in rat[J]. Frontiers in Pharmacology, 2025, 16:1555849.