谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是主要的L-谷氨酸生产菌株[1-2]。C. glutamicum 细胞壁核心成分为肽聚糖层，肽聚糖共价连接阿拉伯半乳聚糖，阿拉伯半乳聚糖另一端则连接分枝菌酸，细胞壁外侧主要分布着海藻糖分枝菌酸酯层。因此，C. glutamicum 细胞壁外层为分枝菌酸酯膜层。C. glutamicum 细胞壁的组成和结构对L-谷氨酸发酵生产具有重要影响[3-5]。抑制C. glutamicum 肽聚糖合成相关的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺-1-羧基乙烯基转移酶编码基因murA 和尿苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸脱氢酶编码基因murB 可以降低细胞壁的完整性，提高L-谷氨酸产量[4]。
海藻糖（α-D-吡喃葡萄糖基-1，1-α-D-吡喃葡萄糖苷）是一种非还原性二糖，广泛存在于微生物、植物和动物体内。在C. glutamicum 菌株细胞中，由海藻糖和分枝菌酸形成的分枝菌酸酯是细胞壁的重要组分，分布在菌体最外侧，对细胞功能具有重要影响[1，6]。目前，在C. glutamicum 中发现了3 条海藻糖合成途径。第一条为海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，OtsA）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，OtsB）途径，该途径能将葡萄糖-6-磷酸和尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖转化为海藻糖。第二条为麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖海藻糖水解酶途径，利用麦芽糊精合成海藻糖。第三条为海藻糖合酶（trehalose synthase，TreS）途径，TreS 能够以麦芽糖为底物合成海藻糖，同时也能催化海藻糖合成麦芽糖，催化麦芽糖和海藻糖之间的可逆转化反应[6-8]。在C. glutamicum 菌株中同时阻断3 条海藻糖合成途径，能够获得无海藻糖合成突变菌株，突变菌株不能合成含有海藻糖的糖脂分子，细胞壁脂质中不再含有海藻糖分枝菌酸酯。同时，无海藻糖合成功能的C. glutamicum 菌株对抗生素更加敏感，细胞膜的通透性增加[7-8]，而且L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-异亮氨酸等氨基酸的产量能够明显增加[6-9]。
研究表明，海藻糖具有优异的持水性，能够保护细胞的DNA、蛋白质和生物膜等。由于独特的生化特性和生理功能，海藻糖在食品、医药和化妆品领域应用广泛[10-11]。TreS 可应用于海藻糖的生产[12]。目前，已有不同微生物来源的TreS 编码基因被克隆并在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中进行表达，重组TreS 蛋白或全细胞可利用麦芽糖为底物合成海藻糖，但TreS 催化麦芽糖和海藻糖之间的可逆转化反应，当海藻糖积累到一定浓度之后反应达到平衡[11，13-19]。本课题组前期通过去除C. glutamicum 表达质粒pXMJ19 中的阻遏蛋白编码基因lacIq 获得pXMJ19（-lacIq）质粒，利用该质粒可在C. glutamicum ATCC13032 中组成型过表达同源TreS 编码基因Cgtrs，重组菌株细胞透性化处理后得到的透性化细胞可将麦芽糖高效转化为海藻糖[10]。
本研究在产L-谷氨酸C. glutamicum CICC20935菌株中组成型过表达C. glutamicum ATCC13032 TreS编码基因Cgtrs，研究TreS 过表达对CICC20935 菌株L-谷氨酸合成和细胞壁的影响，并进行L-谷氨酸发酵后菌体转化合成海藻糖研究，以期为L-谷氨酸发酵和菌体重复利用研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与质粒
产L-谷氨酸C. glutamicum CICC20935（简称20935）菌株:中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；TreS 编码基因Cgtrs 组成型过表达质粒pXMJ19（-lacIq）-Cgtrs 由常州大学应用微生物与酶工程课题组构建并保藏[10]。
1.1.2 试剂与培养基
质粒提取试剂盒、核酸电泳试剂盒、氯霉素:生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母粉、蛋白胨（均为试剂级）:安琪酵母股份有限公司；玉米浆（试剂级）:阿拉丁生化科技股份有限公司；麦芽糖、葡萄糖、琼脂、曲拉通X-100、（NH4）2SO4、KH2PO4、KCl、NaCl、MgSO4·7H2O（均为分析纯）:国药集团化学试剂有限公司；轻质碳酸钙（食品级）:河南万邦化工科技有限公司；消泡剂（试剂级）:烟台恒鑫化工科技有限公司。
卢里亚-贝尔塔尼（Luria-Bertani，LB）培养基:酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，固体培养基加入琼脂20 g/L，重组菌加入氯霉素5 mg/L。
LB 葡萄糖培养基:LB 培养基添加葡萄糖5 g/L。LB 麦芽糖培养基:LB 培养基添加麦芽糖5 g/L。
L-谷氨酸发酵培养基:葡萄糖130 g/L，玉米浆10 g/L，（NH4）2SO4 40 g/L，KH2PO4 1 g/L，KCl 1.5 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，轻质碳酸钙 50 g/L，消泡剂0.3 g/L，重组菌加入氯霉素5 mg/L。固体培养基加入琼脂20 g/L。
1.2 仪器与设备
恒温培养箱（StabS2 型）:上海润度生物科技有限公司；超薄切片透射电子显微镜（JEM-1400 型）:日本电子株式会社；分光光度计（UV-1200 型）:上海美谱达仪器有限公司；离心机（1-14 型）:德国Sigma 公司；电转仪（MicroPulser 型）:美国Bio-Rad 公司；生物传感分析仪（S-10 型）:深圳市西尔曼科技有限公司；高效液相色谱仪（LC-20A 型）:日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株20935T 构建
利用电转化方法[10，20]将pXMJ19（-lacIq）-Cgtrs 质粒转入20935 菌株，构建组成型过表达TreS 菌株20935T。取2 μL pXMJ19（-lacIq）-Cgtrs 质粒加入100 μL 20935 感受态，1 800 V、5 ms 电击。电击后涂布于添加氯霉素的LB 葡萄糖培养基平板，30 ℃培养。生成的转化子菌落即为含有pXMJ19（-lacIq）-Cgtrs 质粒的重组菌株20935T。将重组菌株20935T 菌落划线至添加氯霉素的LB 葡萄糖培养基平板进行30 ℃培养，培养好的平板可直接用于后续试验或者置于冰箱冷藏保存。
1.3.2 L-谷氨酸发酵
菌株20935 和20935T 利用LB 葡萄糖培养基平板划线30 ℃活化培养36 h。然后，挑取菌落接入20 mL LB 葡萄糖培养基中，于30 ℃、180 r/min 条件下振荡培养20 h，获得种子培养液。取2 mL 种子培养液接入50 mL 发酵培养基中，于30 ℃、180 r/min 条件下振荡培养。
1.3.3 超薄切片透射电子显微镜分析
利用超薄切片透射电子显微镜分析细胞形态和细胞壁结构，菌株20935 和20935T 利用固体L-谷氨酸发酵培养基斜面30 ℃静置培养20 h。刮取菌体放入离心管中，利用含有0.5% 戊二醛的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.0）洗涤菌体一次，离心（4 000×g，4 ℃，5 min）沉淀菌体弃上清液后添加3%戊二醛溶液以固定细胞。对细胞样品进行超薄切片透射电子显微镜分析。
1.3.4 细胞透性化处理
菌株20935T 进行L-谷氨酸发酵之后离心（4 000×g，4 ℃，5 min）收集菌体，菌体利用PBS（pH7.0）重悬并调整菌体浓度OD600 至50（去离子水稀释100 倍测定OD600 为0.5）。菌悬液添加5 g/L 曲拉通X-100，置于恒温培养箱中于30 ℃、120 r/min 条件下进行透性化处理3 h，离心（4 000×g，4 ℃，5 min）收集菌体。透性化处理后的菌体重新利用PBS（pH7.0）重悬并调整菌体浓度OD600 至50（去离子水稀释100 倍测定OD600 为0.5），添加麦芽糖200 g/L 和轻质碳酸钙 10 g/L，于30 ℃、180 r/min 下进行全细胞转化。
1.3.5 分析方法
发酵过程取样检测菌体浓度、葡萄糖和谷氨酸浓度。发酵样品利用0.1 mol/L 的盐酸溶液稀释100 倍，然后利用分光光度计测定OD600 值得出菌体浓度。发酵样品离心（8 000×g，4 ℃，5 min），取上清液并利用纯净水稀释100 倍，然后利用生物传感分析仪检测葡萄糖和谷氨酸浓度。海藻糖利用高效液相色谱仪进行检测[18]。20935T 菌株L-谷氨酸发酵结束后收集菌体进行海藻糖合酶酶活测定，菌体破碎和酶活测定方法参考本课题组前期研究内容[10]。
1.4 数据处理
相关试验均进行3 次重复试验，相关数据以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 组成型过表达TreS 提高L-谷氨酸产量
利用LB 葡萄糖培养基培养菌株20935 和20935T，可以发现20935T 在培养过程中出现明显的絮凝现象。20935 和20935T 菌株L-谷氨酸发酵过程见图1。
图1 20935 和20935T 菌株L-谷氨酸发酵过程
Fig.1 L-Glutamate production by fermentation of strains 20935 and 20935T
a. 20935 菌株；b. 20935T 菌株。
由图1 可知，发酵60 h 后，20935T 菌株的L-谷氨酸产量为44.1 g/L，原始菌株20935 的L-谷氨酸产量为26.0 g/L，过表达TreS 可将L-谷氨酸产量提高70%。对于大肠杆菌或者酿酒酵母而言，细胞絮凝与细胞壁完整性有密切关系，具有絮凝表型的突变体细胞壁一般都有缺陷[21-22]。利用C. glutamicum 发酵生产L-谷氨酸，细胞壁结构能够影响L-谷氨酸的分泌和积累。抑制C. glutamicum 细胞壁肽聚糖的合成能够提高L-谷氨酸产量[4]。C. glutamicum 细胞壁外层的分枝菌酸酯膜层同样对细胞功能有重要影响，阻断海藻糖合成可抑制海藻糖分枝菌酸酯层的形成，能够增加细胞的通透性和L-谷氨酸产量[1，5，9]。与原始菌株20935 相比，20935T 菌株具有絮凝表型和明显提高的L-谷氨酸产量，因此推测组成型过表达TreS 可导致细胞壁结构发生变化。
2.2 菌株20935 和20935T 细胞形态和细胞壁结构比较分析
利用超薄切片透射电子显微镜分析菌株20935 和20935T 细胞形态和细胞壁结构，结果见图2。
图2 菌株20935 和20935T 超薄切片透射电子显微镜分析
Fig.2 Ultrathin section transmission electron microscopy of strains 20935 and 20935T
由图2 可知，与原始菌株20935 相比，20935T 菌株细胞形态没有明显差异，但是20935T 菌株细胞壁外侧分枝菌酸酯膜层明显变得更薄。因此，组成型过表达TreS 可抑制分枝菌酸酯膜层的形成和完整性。已有研究指出，失活C. glutamicum 中包括TreS 途径在内的所有海藻糖合成途径可获得无海藻糖合成功能的突变菌株，突变菌株细胞壁成分发生改变，细胞壁脂质中不再含有海藻糖分枝菌酸酯，细胞膜的通透性增加，而且L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-异亮氨酸等氨基酸的产量能够明显增加[6-9]。本研究在C. glutamicum 中组成型过表达TreS 同样能够抑制细胞壁分枝菌酸酯膜层的形成并且提高L-谷氨酸产量。已有研究表明，C.glutamicum 能够代谢利用麦芽糖，并且葡萄糖的存在不会抑制麦芽糖的分解代谢 [23-25]。同时，TreS 能够催化麦芽糖和海藻糖的可逆转化[7，10]。当利用仅含有葡萄糖作为碳源的培养基进行培养时，C. glutamicum 细胞能够通过OtsA-OtsB 途径合成海藻糖并参与细胞壁海藻糖分枝菌酸酯的形成 [7，9]。因此，当C. glutamicum细胞内组成型过表达TreS 并且利用仅含有葡萄糖作为碳源的培养基进行培养时，细胞内通过OtsA-OtsB途径合成的海藻糖能够被TreS 转化为麦芽糖，麦芽糖则继续被细胞分解代谢，这一过程将持续消耗细胞内的海藻糖，导致用于合成海藻糖分枝菌酸酯的海藻糖供应不足，影响细胞壁分枝菌酸酯膜层的形成和完整性。细胞壁表面没有被海藻糖分枝菌酸酯完整覆盖，暴露出较多的分枝菌酸层疏水性部位，因此20935T 菌株细胞由于疏水相互作用而抱团凝结并呈现出絮凝现象。同时，由于细胞壁不完整性增加，细胞透性增强，20935T 菌株的L-谷氨酸产量得到提高。
2.3 培养基添加麦芽糖研究
利用添加麦芽糖的LB 麦芽糖培养基培养20935T菌株，不会出现菌体絮凝现象。将L-谷氨酸发酵培养基中的葡萄糖碳源替换为麦芽糖（麦芽糖130 g/L）和混合碳源（麦芽糖65 g/L 和葡萄糖65 g/L）并进行L-谷氨酸发酵，结果见图3。
图3 20935 和20935T 菌株利用麦芽糖碳源和混合碳源进行L-谷氨酸发酵
Fig.3 L-Glutamate production by fermentation of strains 20935 and 20935T with maltose as the carbon source and mixed carbon source
A. 20935 菌株利用麦芽糖碳源（麦芽糖130 g/L）进行L-谷氨酸发酵；B. 20935 菌株利用混合碳源（麦芽糖65 g/L 和葡萄糖65 g/L）进行L-谷氨酸发酵；C. 20935T 菌株利用麦芽糖碳源（麦芽糖130 g/L）进行L-谷氨酸发酵；D. 20935T 菌株利用混合碳源（麦芽糖65 g/L 和葡萄糖65 g/L）进行L-谷氨酸发酵。
由图3 可知，原始菌株20935 利用麦芽糖和混合碳源的发酵过程与利用葡萄糖的发酵过程非常相似，发酵60 h 后，L-谷氨酸产量分别为27.3 g/L 和29.1 g/L。20935T 菌株利用麦芽糖和混合碳源进行L-谷氨酸发酵，发酵60 h 后，L-谷氨酸产量分别为23.0 g/L 和28.8 g/L，相比葡萄糖碳源分别下降48% 和35%。当培养基中添加麦芽糖，菌株细胞会将麦芽糖转运进细胞，细胞内存在一定量的麦芽糖，TreS 转化海藻糖合成麦芽糖反应会被抑制。因此，对20935T 菌株而言，培养过程中添加麦芽糖能够保证细胞内有充足的海藻糖供应，能够维持海藻糖分枝菌酸酯的正常合成进而维持细胞壁的完整性。因此，20935T 菌体细胞不会出现絮凝现象，L-谷氨酸产量也随细胞壁完整性的增加而降低。
2.4 利用L-谷氨酸发酵后的20935T 菌体细胞合成海藻糖
对L-谷氨酸发酵后的20935T 菌体细胞转化麦芽糖合成海藻糖能力进行研究，结果见图4。
图4 利用L-谷氨酸发酵后的20935T 菌体细胞合成海藻糖
Fig.4 Trehalose production by 20935T cells after L-glutamate production
由图4 可知，L-谷氨酸发酵后的20935T 菌体细胞具有一定的转化麦芽糖合成海藻糖的能力，在24 h 内能够转化200 g/L 的麦芽糖合成97 g/L 的海藻糖。C.glutamicum 能够作为表达宿主合成特定蛋白[26]，并且可以利用重组C. glutamicum 菌体进行全细胞转化。在本课题组前期工作中，利用C. glutamicum ATCC13032表达TreS 并利用透性化细胞催化麦芽糖合成海藻糖，当底物麦芽糖浓度为200 g/L 时，海藻糖产量为118 g/L，生产强度为11.8 g/（L·h）[10]。 相比C. glutamicum ATCC13032 重组菌[10]，20935T 菌体细胞转化效率较低。酶活分析表明，L-谷氨酸发酵后的20935T 菌体细胞TreS 酶活为43 U/mg 蛋白，明显低于C. glutamicum ATCC13032 重组菌的TreS 酶活（258 U/mg 蛋白）[10]。这可能是由于经过60 h 的L-谷氨酸发酵TreS 部分失活，同时，20935T 菌株的代谢相对集中于L-谷氨酸的合成导致TreS 酶蛋白的表达量较少。尽管L-谷氨酸发酵后的20935T 菌体细胞转化合成海藻糖的效率较低，但是该菌体重复利用方式能够为相关研究提供参考。
3 结论
本研究在产L-谷氨酸C. glutamicum CICC20935中组成型过表达TreS 获得重组菌株20935T。利用仅含有葡萄糖作为碳源的培养基培养20935T 菌株并进行L-谷氨酸发酵，结果显示，菌株呈现絮凝表型并且L-谷氨酸产量由原始菌株的26.0 g/L 增加至44.1 g/L。超薄切片透射电子显微镜分析结果显示菌株20935T细胞壁外侧含有海藻糖的分枝菌酸酯膜层完整性降低。在菌株20935T 培养过程中添加麦芽糖作为碳源，菌体不会出现絮凝表型，同时L-谷氨酸产量降低35%～48%。TreS 催化麦芽糖和海藻糖之间的可逆转化反应，C. glutamicum 过表达TreS 对细胞内海藻糖转化代谢和细胞壁完整性有重要影响，并且这种影响与麦芽糖供应有密切关系。
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