普鲁兰酶（pullulanase，EC 3.2.1.41）属于α-淀粉酶家族，可分为Ⅰ型和Ⅱ型普鲁兰酶[1]。Ⅰ型普鲁兰酶水解α-1，6 糖苷键，Ⅱ型普鲁兰酶可以水解α-1，6 糖苷键和直链的α-1，4 糖苷键。该酶可以缩短糖化时间、提高产量和转化率[2]，应用于葡萄糖浆、变性淀粉、乙醇燃料、啤酒和许多其他应用[1-3]。
Ⅰ型普鲁兰酶研究较多[4-6]，而Ⅱ型普鲁兰酶的研究较少[7]。Ⅱ型普鲁兰酶主要来源于超嗜热古菌和海洋细菌[8]，例如解淀粉脱硫球菌（Desulfurococcus amylolyticus） JCM 9188[9]、海洋葡萄热菌（Staphylothermus marinus）、西西里热球菌（Thermococcus siculi）[10]、嗜热食油地芽孢杆菌（Geobacillus thermoleovorans） NP33等[11]。Deng 等[12]研究发现来源于长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）的Ⅱ型普鲁兰酶PulA 可以使糖化酶的用量减少40%，缩短淀粉转化反应时间。Mesbah等[13]报道嗜碱湖泊菌（Alkalilimnicola sp.）NM-DCM-1的Ⅱ型普鲁兰酶具有嗜盐、亲碱和嗜热的特性，可在高温条件下制备多孔淀粉；Mathupala 等[14]分析了来自于嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）39E 的Ⅱ型普鲁兰酶，该酶的活性中心是由Asp597-Glu626-Asp703 构成的催化三联体。
多孔淀粉主要应用于食品、医药、材料和生物技术等领域[15-16]，制备方法主要有化学、生物酶法和物理法等[17-18]。生物酶法具有绿色、高效的特点，可保留淀粉颗粒的晶体结构，生成均匀、稳定的多孔淀粉[19]。目前，报道的多为双酶法制备多孔淀粉[20]，单独采用Ⅱ型普鲁兰酶制备多孔淀粉的研究相对较少，单酶制备多孔淀粉可以降低成本和简化步骤。
本文从青岛大沙湾的海泥样品中筛选到一株产Ⅱ型普鲁兰酶的微生物，进行形态特征、生理生化和16S rDNA 的鉴定，并对其产酶条件与酶学性质进行研究，研究该酶在多孔淀粉制备中的应用潜力，以期为提升海洋生物技术在食品加工、生物材料等领域的影响力提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
海泥:采集于青岛大沙湾海岸落潮时潮间带；陈海水:采集于连云港连岛海域。
红色普鲁兰多糖:爱尔兰Megazyme 公司；普鲁兰多糖、酵母粉、琼脂、鱼粉蛋白胨、LB 液体培养基、LB固体培养基:国药集团化学试剂有限公司；细菌基因组提取试剂盒:天根生化科技（北京）有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂、MgCl2、双蒸水（dd H2O）、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、盐酸-三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]缓冲液:生工生物工程（上海）股份有限公司；红薯淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、荞麦淀粉、玉米淀粉、百合粉、蚕豆粉、大麦粉、葛根粉、绿豆粉、木薯淀粉、粘米粉、山药粉、水磨糯米粉:河南巨龙淀粉实业有限公司；花生油:益海嘉里金龙鱼食品集团股份有限公司。除特殊标记外，以上试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
SPX-150C 型生化培养箱、HVE-50 型压力蒸汽灭菌锅、DZF-6050 型真空干燥箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DK-BD 型电热恒温水槽:上海一恒科学仪器有限公司；全波长酶标仪:美国Thermo Fisher公司；ZQZY-AR8 型全温振荡培养箱:上海欣蕊自动化设备有限公司；高速冷冻离心机:美国Beskman Coulter公司；FreeZone 冻干机:中国LABCONCO 股份有限公司；JSM-6390LA 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）:日本电子株式会社；SZ-100 粒度分析仪:日本HORIBA 股份有限公司。
1.1.3 主要培养基的制备
筛选培养基:红色普鲁兰多糖0.2%，鱼粉蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，陈海水，pH8.0。
发酵培养基:普鲁兰多糖1%，酵母粉0.5%，陈海水，pH8.0。
1.2 方法
1.2.1 产普鲁兰酶菌株的筛选与鉴定
1.2.1.1 菌株的筛选
海泥与无菌水混合并梯度稀释10-1～10-6，取50 μL涂布于筛选培养基，30 ℃倒置培养24 h，挑取有透明圈的菌落分离纯化。将纯化菌株接种于LB 液体培养基，30 ℃振荡培养12 h，甘油管冻存，用于后续试验。
1.2.1.2 菌株的鉴定
菌株的形态观察:将菌株接种到LB 固体培养基上，30 ℃培养24 h 后观察菌落的形状、大小、颜色、边缘以及表面凹凸度等特征，并进行革兰氏染色。
菌株的16S rDNA 鉴定:利用细菌基因组提取试剂盒提取菌株的基因，选用原核微生物通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'）、1492R（5'-GGTTACCTTACGACTT-3'）进行PCR 扩增。PCR 扩增体系为50 μL（模板1 μL、PCR 预混液25 μL、27F 2 μL、1492R 2 μL、MgCl2 2 μL、dd H2O 18 μL），扩增条件:94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保藏。PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果提交美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）数据库比对，用MEGA7.0 软件通过邻接法（neighbor-joining，N-J）构建系统发育树[21]。
1.2.2 产酶曲线的绘制
将菌株A1 以2% 接种于50 mL 发酵培养基，40 ℃、180 r/min 摇床培养80 h，每 4 h 取样，10 000×g离心10 min，测定上清液的相对酶活。以时间为横坐标，相对酶活为纵坐标绘制产酶曲线。
1.2.3 酶学性质测定
反应温度对酶活力的影响:以3% 普鲁兰多糖为底物，加入pH5 的200 mmol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，将反应物分别置于反应温度20、30、40、50、60 ℃下反应20 min，测定相对酶活。
酶的热稳定性:酶液分别在45、50、55 ℃条件下保温3 h，每1 h 取样，测定相对酶活。
pH 值对酶活的影响:检测酶在pH4～9 条件下的相对酶活。
酶的pH 值稳定性:酶液分别在200 mmol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4～6）、PBS（pH6～8）和盐酸-Tris 缓冲液（pH8～9）中45 ℃保温1 h，测定相对酶活。
金属离子对酶活的影响:将底物分别与不同浓度的金属离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Ba2+）氯化物混合，金属离子终浓度分别为 1、5、10 mmol/L，45 ℃下保温1 h 后测定相对酶活。
酶的底物特异性:分别以普鲁兰多糖、可溶性淀粉、荞麦淀粉、玉米淀粉和壳聚糖为底物，测定比酶活，并计算相对酶活。
1.2.4 比酶活及相对酶活的测定
取5 mL 发酵液10 000×g 离心10 min，用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定上清液的酶活力。在试管中分别加入3%普鲁兰多糖溶液和200 mmol/L、pH5 的乙酸-乙酸钠缓冲液75 μL，加入50 μL 酶液反应20 min，加入200 μL 的DNS 终止反应，将试管置于沸水中10 min，加入3 mL 去离子水并混匀。吸取200 μL 反应物在540 nm 测定吸光度。比酶活定义:在单位时间（1 min）内，普鲁兰酶水解底物时产生1 μmol 麦芽糖所需要的普鲁兰酶的量为一个酶活力单位（U）。
以最高比酶活为100%，比酶活除以最高比酶活的百分比为相对酶活。
1.2.5 普鲁兰酶制备多孔淀粉的制备
1.2.5.1 多孔淀粉的制备
取红薯淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、荞麦淀粉、玉米淀粉、百合粉、蚕豆粉、大麦粉、葛根粉、绿豆粉、木薯淀粉、粘米粉、山药粉和水磨糯米粉各4 g 与乙酸-乙酸钠缓冲液按质量比1∶5 混合搅拌20 min，然后于室温超声（频率40 kHz、功率500 W）处理30 min，加入200 mL 0.5 U/mL 的酶液（发酵培养基菌液10 000×g 离心10 min），然后4 000 r/min 离心20 min，在40 ℃下分别恒温振荡反应（20～24 h）。反应结束后向混合物中加入5 mL 95% 乙醇使酶失活。悬浮液在4 000×g、4 ℃条件下离心5 min。用50 mL 蒸馏水冲洗3 次。冲洗后的沉淀物在50 ℃的真空干燥箱中干燥24 h[22-23]。研磨后4 ℃保存备用。
1.2.5.2 扫描电子显微镜观察
在样品台涂上导电胶，在导电胶表面均匀地加入干燥的多孔淀粉，用氮气吹掉多余的样品，采用扫描电子显微镜观察。
1.2.5.3 溶解度和膨胀力测定
将干燥的离心管和培养皿称重，分别记为A1（g）和B1（g），分别加入0.4 g 样品和20 mL 蒸馏水，混合均匀，60 ℃恒温水浴振荡30 min，5 000×g 离心15 min。取上清液倒入培养皿中，称量离心管与沉淀物的质量，记为A2（g），将装有上清液的培养皿105 ℃干燥至恒重[24]，记为B2（g）。淀粉样品的溶解度（S，%）和膨胀力（P，g/g）分别按式（1）、式（2）计算。
1.2.5.4 吸水率和吸油率测定
称取500 mg 酶处理不同时间（20、24 h）的荞麦、玉米和红薯多孔淀粉和天然淀粉，分别置于15 mL 预称重离心管中，各加入5 mL 纯水或花生油，混合并搅拌20 min，以4 000×g 离心10 min，倒出上清液，并用移液枪吸出残留液体[25]，称离心后离心管吸水（油）后的淀粉质量并按公式（3）计算吸水率和吸油率（X，%）。
式中:W0 为离心管质量，g；W1 为多孔淀粉干质量，g；W2 为离心后离心管吸水（油）后的淀粉质量，g。
1.3 数据处理与分析
所有试验均设3 组平行，结果用平均值±标准差表示，采用 GraphPad Prism 8 和SPSS 26.0 对试验结果进行统计分析，p＜0.05 为差异显著。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选与鉴定
菌株A1 菌落形态和细胞形态见图1。
图1 菌株A1 菌落形态和细胞形态
Fig.1 Colony morphology of strain A1 and cell morphology
（a）菌落形态；（b）细胞形态（×20 000）。
由图1 可知，菌株A1 的菌落淡黄色，黏稠，边缘整齐，表面平整中央微凸起，在筛选培养基上形成透明圈。该菌为革兰氏阳性杆菌，有芽孢，菌体大小为（1.5～1.8） μm×（2.5～4.0） μm，长杆状，末端圆，两个或多个呈链状排列。
菌株A1 的16S rDNA 碱基长度为1 459 bp，采用MEGA7.0 软件的N-J 法构建系统发育树，结果见图2。
图2 基于菌株 A1 16S rDNA 序列构建的系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain A1
由图2 可知，菌株A1 与Bacillus velezensis 的同源性为100%；综合形态特征，鉴定其为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。
2.2 菌株A1 的产酶曲线
菌株A1 的产酶曲线见图3。
图3 产酶曲线
Fig.3 Enzyme production curve
由图3 可知，菌株A1 在16 h 时开始产酶，生长至40 h 时，相对酶活达到最高；培养到72 h 的培养液中几乎检测不到酶活，发酵产酶时间以40 h 为宜[26]。
2.3 酶学性质
2.3.1 反应温度和pH 值对相对酶活的影响
反应温度对相对酶活的影响见图4，酶的热稳定性见图5。
图4 反应温度对相对酶活的影响
Fig.4 Effect of reaction temperature on relative enzyme activity
图5 酶的热稳定性
Fig.5 Thermal stability of enzyme
由图4、图5 可知，随着反应温度的升高，相对酶活先急剧升高后缓慢降低。当反应温度为40 ℃时，相对酶活达到最大，因此，菌株A1 产普鲁兰酶的最适作用温度为40 ℃，且在45 ℃和50 ℃保温2 h 后相对酶活仍可以保持在70%以上。
pH 值对相对酶活的影响见图6，酶的pH 值稳定性见图7。
图6 pH 值对相对酶活的影响
Fig.6 Effect of pH on relative enzyme activity
图7 酶的pH 值稳定性
Fig.7 pH stability of enzyme
由图6 可知，该酶在pH4～9 的条件下均可检测到相对酶活，当pH 值为5 时，相对酶活达到最大值，因此最适pH 值为5.0。由图7 可知，在pH5～7 缓冲液中保存1 h 后，相对酶活较高且较稳定。说明该酶具有良好的pH 值稳定性。
2.3.2 金属离子对相对酶活的影响
金属离子对相对酶活的影响见表1。
表1 金属离子对普鲁兰酶相对酶活的影响
Table 1 Effect of metal ions on relative activity of pullulanase
金属离子对照Na+K+Fe3+Zn2+Ca2+Mg2+Cu2+Co2+NH4+Ba2+相对酶活/%1 mmol/L 100.00±1.81 107.28±1.33 103.64±3.18 87.66±1.69 9.10±1.78 104.09±4.13 103.95±1.43 0 104.06±1.85 91.47±2.69 101.94±1.46 5 mmol/L 100.00±1.81 96.04±3.58 96.60±1.66 3.04±1.41 6.80±1.45 96.72±1.87 52.21±2.78 0 49.22±1.91 102.87±2.96 88.87±1.86 10 mmol/L 100.00±1.81 89.95±2.26 81.15±2.17 1.05±0.86 0 62.37±4.88 48.26±1.55 0 9.22±0.39 85.13±1.38 47.47±0.83
由表1 可知，浓度为1 mmol/L 时，Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Ba2+的相对酶活较高。除了Fe3+，5 mmol/L的金属离子对相对酶活的影响较小；然而，10 mmol/L Zn2+可完全抑制该酶。该酶对Cu2+特别敏感，从低浓度到高浓度都可使酶失活。因此，在用该酶水解时，金属离子应控制在较低浓度[27]。
2.3.3 酶的底物特异性
菌株A1 是在以红色普鲁兰多糖为唯一碳源的培养基上筛选的，然而，该普鲁兰酶对多种底物具有水解作用。不同底物对普鲁兰酶比酶活、相对酶活的影响见表2。
表2 不同底物对普鲁兰酶比酶活、相对酶活的影响
Table 2 Effect of different substrates on specific activity and relative activity of pullulanase
底物普鲁兰多糖可溶性淀粉荞麦淀粉玉米淀粉壳聚糖比酶活/（U/mg）0.94 1.70 0.62 0.81 1.54相对酶活/%55.29 100.00 36.47 47.65 90.59
由表2 可知，可溶性淀粉为底物时比酶活、相对酶活最高；普鲁兰多糖为底物时，只有55.29%的相对酶活。这也表明其为Ⅱ型普鲁兰酶，对玉米淀粉和荞麦淀粉均具有水解作用。同时，该酶还可以水解含有β-1，4 糖苷键的壳聚糖，这拓展了该酶的用途。
2.4 普鲁兰酶在制备多孔淀粉中的应用分析
2.4.1 多孔淀粉的扫描电子显微镜观察
天然淀粉与多孔淀粉的SEM 图见图8。
图8 天然淀粉与多孔淀粉的SEM 图
Fig.8 SEM images of natural starches and porous starches
由图8 可知，经酶解后，淀粉颗粒表面的形貌均发生了改变。在红薯、小麦、大麦、粘米、水磨糯米淀粉颗粒表面形成了较浅的小孔。在百合、蚕豆、葛根、绿豆、山药淀粉中形成了较大的孔，有的形成空腔，其中，荞麦淀粉和玉米淀粉颗粒表面布满了蜂窝状小孔，并深入到淀粉内部，形成均匀的多孔形态，增大了比表面积[28]。而红薯淀粉虽然表面形成的小孔较浅，但仅次于荞麦淀粉和玉米淀粉。因此，依据表面形态，选择荞麦淀粉、玉米淀粉和红薯淀粉3 种淀粉进行后续研究。
2.4.2 淀粉的溶解度和膨胀力分析
不同淀粉样品的溶解度和膨胀力见表3。
表3 不同淀粉样品的溶解度和膨胀力
Table 3 Solubility and swelling power of different starch samples
注:不同小写字母表示同种淀粉间存在显著性差异，p＜0.05。
淀粉种类荞麦天然淀粉荞麦多孔淀粉玉米天然淀粉玉米多孔淀粉红薯天然淀粉红薯多孔淀粉溶解度/%5.23±0.64b 6.55±0.38a 3.27±0.05b 5.88±0.22a 2.44±0.35b 4.83±0.37a膨胀力/（g/g）7.79±0.46b 10.49±0.55a 4.83±0.17b 6.72±0.25a 3.76±0.21b 5.91±0.40a
由表3 可知，多孔淀粉的溶解度和膨胀力相较于天然淀粉平均显著增加约2.11% 和2.25%，其中荞麦多孔淀粉的溶解度与膨胀力分别增加1.32% 与2.70%，玉米多孔淀粉的溶解度和膨胀力增加2.61%和1.89%，红薯多孔淀粉也增加2.39% 和2.15%。这可能是因为酶水解后，在非结晶区的直链淀粉会散出，从而提高淀粉的溶解度；在淀粉颗粒中形成的孔洞降低了其结构强度，水分子进入淀粉孔洞中，从而提高淀粉的膨胀力[29]。
2.4.3 吸水率和吸油率的分析
不同淀粉样品的吸水率和吸油率见表4。
表4 不同淀粉样品的吸水率和吸油率
Table 4 Water and oil absorption capacities of different starch samples
注:不同小写字母表示同种淀粉间存在显著性差异，p＜0.05。
淀粉种类荞麦天然淀粉荞麦多孔淀粉（20 h）荞麦多孔淀粉（24 h）玉米天然淀粉玉米多孔淀粉（20 h）玉米多孔淀粉（24 h）红薯天然淀粉红薯多孔淀粉（20 h）红薯多孔淀粉（24 h）吸水率/%71.19±1.24c 102.57±2.05b 123.46±2.28a 48.27±1.04c 78.76±1.73b 81.64±0.58a 62.99±0.68c 88.12±2.04b 111.76±3.12a吸油率/%53.79±0.53c 79.38±1.55b 92.70±2.34a 43.33±2.16c 67.19±0.56b 72.82±0.10a 62.79±0.72c 69.37±1.55b 84.73±2.31a
由表4 可知，在酶解24 h 的条件下，荞麦、玉米和红薯多孔淀粉的吸水率和吸油率均平均显著增加约44.80% 和30.11%。其中，荞麦多孔淀粉的吸水率和吸油率分别增加52.27% 和38.91%；玉米多孔淀粉分别增加33.37%和29.49%；红薯多孔淀粉增加48.77%和21.94%。与酶解20 h 多孔淀粉相比，延长酶解时间可以显著提高多孔淀粉的吸水率和吸油率。这可能是由于淀粉颗粒的孔隙和表面积增加，使水和油充分进入淀粉内部，进而提高淀粉的吸水率和吸油率[30]，也进一步提高了多孔淀粉的负载能力。
3 结论
从青岛大沙湾海域的海泥中筛选得到产Ⅱ型普鲁兰酶的菌株Bacillus sp. A1。普鲁兰酶的最适反应温度和pH 值分别为40 ℃和5.0，在45 ℃和50 ℃具有良好的热稳定性。在pH5～7 具有良好的pH 值稳定性。低浓度（1 mmol/L）Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Ba2+可以提高相对酶活，该酶对多种底物具有水解活性，可以水解可溶性淀粉、普鲁兰多糖、玉米淀粉、荞麦淀粉和壳聚糖。对12 个不同来源（荞麦、玉米、红薯、小麦、大麦、粘米、水磨糯米、百合、蚕豆、葛根、绿豆、山药）淀粉（天然淀粉、多孔淀粉）都具有水解作用，其中，在荞麦淀粉、玉米淀粉表面可形成深入内部、均匀的孔隙，而红薯淀粉仅次于荞麦淀粉和玉米淀粉。此外，多孔淀粉的溶解度和膨胀力相较于天然淀粉平均增加约2.11%和2.25%，酶解24 h 的多孔淀粉的吸水率和吸油率相较于天然淀粉平均增加约44.80% 和30.11%。综上，菌株A1 产的Ⅱ型普鲁兰酶在荞麦、玉米和红薯多孔淀粉制备中具有应用前景。与使用多种复合酶相比，使用单酶可以简化操作步骤、易于控制酶水解条件、降低生产成本。然而，不同品种的淀粉中直链和支链淀粉的比例不同，因此，未来制备不同种类的多孔淀粉需要进一步探索其适宜的酶种类。
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