海马（Hippocampus）富含脂质、氨基酸、核苷及微量元素等营养物质，具有极高药用价值[1]。海马属中已知个体最大的种为膨腹海马（Hippocampus abdominalis），其作为规模化养殖的新品种[2]极具商业价值潜力。目前，针对膨腹海马的干制工艺缺乏统一标准，主要为传统的阴干及日晒风干等非标准干制技术，干制品品质较差且不均一，极大降低膨腹海马的应用价值[3]。因此，探究不同干燥方式对膨腹海马干燥特性与品质的影响至关重要。
本研究围绕热风干燥（hot air drying，HAD）、真空干燥（vacuum drying，VD）、-20 ℃冻结-真空冷冻干燥（-20 ℃ freezing- lyophilization，L-20）、-80 ℃冻结-真空冷冻干燥（-80 ℃ freezing- lyophilization，L-80）、液氮冻结-真空冷冻干燥（liquid nitrogen freezing- lyophilization，L-LN），探究其对膨腹海马干燥特性及品质的影响，以期为膨腹海马干制工艺提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
雌性膨腹海马:日照多宝海洋生物科技有限公司，个体长度（15±2） cm，全程低温运输且生理状况良好。溴化钾、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、硫酸、硼酸、乙醇、甲基红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、盐酸、氨水（均为分析纯）:国药集团化学试剂有限公司。
WSC-S 色差计:上海圣科仪器设备有限公司；Milli-Q 超纯水制造系统:美国默克密理博公司；AB135-S 精密电子天平:瑞士梅特勒-托利多公司；DHG-9070A 鼓风干燥箱:上海慧泰仪器制造有限公司；DZF-6050 真空干燥箱:上海生科设备有限公司；SCIENTZ-10YG/A真空冷冻干燥机:宁波新芝冻干设备有限公司；646L对开门冰箱:海信容声冰箱有限公司；MDF-U32V 超低温冰箱:日本三洋公司；LG-CY300 冷水机:深圳芯牛科技有限公司；MacroMR20-060H-I 低场核磁共振仪:苏州纽迈分析仪器有限公司；Tescan Mira 扫描电子显微镜（配置真空镀膜仪）:上海百贺仪器科技有限公司；Nicolet iS10 傅里叶变换红外光谱仪:赛默飞世尔科技公司；FlavourSpec 风味分析仪:德国GAS 公司。
1.2 测定方法
1.2.1 干燥条件与程序设定
将生理状态良好的膨腹海马洗净擦干，随机分为5 个处理组:热风干燥组（记为HAD）:干燥温度50 ℃，干燥时间12 h；真空干燥组（记为VD）:干燥温度50 ℃，干燥时间12 h；-20 ℃冻结-真空冷冻干燥组（记为L-20）:-20 ℃冻结，真空冷冻干燥96 h；-80 ℃冻结-真空冷冻干燥组（记为L-80）:-80 ℃冻结，真空冷冻干燥96 h；液氮冻结-真空冷冻干燥组（记为L-LN）:液氮冻结，真空冷冻干燥96 h。每组膨腹海马数量均为60 只，3 次重复，干燥过程中按要求取样，用于各指标测定。
1.2.2 色泽及收缩率测定
色差计利用标准板校准后，分别测定膨腹海马干燥前后的L*值、a*值、b*值，按公式（1）计算色差（ΔE）。
式中:L1*为干燥前膨腹海马L*值；L2*为干燥后膨腹海马L*值；a1*为干燥前膨腹海马a*值；a2*为干燥后膨腹海马a*值；b1*为干燥前膨腹海马b*值；b2*为干燥后膨腹海马b*值。
对干燥前后膨腹海马长度进行测量，按公式（2）计算收缩率（RS，%）。
式中:L0 为干燥前膨腹海马长度，cm；Lt 为干燥后膨腹海马长度，cm。
1.2.3 水分状态与迁移表征
利用低场核磁共振技术（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR），采用卡尔-珀塞尔-梅布姆-吉尔（Carr-Purcell-Meiboom-Gil，CPMG）序列测定不同干燥时间的膨腹海马水分横向豫驰时间（T2）。CPMG序列参数:谱宽200 kHz，系统频率21 MHz，偏置频率33 302.74 Hz，90°脉冲宽度13.52 μs，180°脉冲宽度25.52 μs，射频延迟0.002 ms，接收机增益20.0 db，数字接收机增益3，前置放大器增益2，回波时间0.15 ms，回波个数16 000，等待时间4 000 ms，扫描4 次；反演参数:同步迭代重建技术（simultaneous iterative reconstruction technique，SIRT）模型，滤波档位为3，反演数据点数为200，弛豫数据点数为200，横向弛豫时间最小值0.01 ms，横向弛豫时间最大值10 000 ms，迭代次数30 000。
利用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）对不同干燥阶段的膨腹海马样品进行分析，混合自旋回波（hybrid spin echo，HSE）序列参数汇总如下:读出方向视野150 mm，相位编码方向视野150 mm，接收机增益20.0 dB，前置放大器增益2，数字接收机增益3，重复时间2 500 ms，回波时间8 ms，平均次数4，读出方向矩阵大小256，相位编码方向矩阵大小192，相位编码梯度持续时间1 ms，回波采集位置30%，扫频宽度40 kHz，伪彩模式为JET 模式。
1.2.4 微观结构测定
利用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）对膨腹海马样品进行微观结构观察。干燥样品经真空镀膜仪喷金处理后，置于扫描电子显微镜下，在5.0 keV 的加速电压条件下，分别于2 000、5 000 放大倍数下对其横截面形貌进行观测。
1.2.5 蛋白质二级结构测定
参考Liu 等[4]的方法，采用溴化钾压片法制样并通过傅里叶变换红外光谱仪扫描检测，使用OMNIC 软件进行基线校正和平滑，波数范围为4 000～400 cm-1，扫描32 次，分辨率为4 cm-1。采用Peak Fit 4.12 软件对酰胺I 带（1 700～1 600 cm-1）光谱进行分峰拟合，所采用的高斯函数模型可解析出重叠的子峰，并通过积分计算各子峰面积，进而定量分析蛋白质二级结构的相对含量。
1.2.6 品质分析
膨腹海马总蛋白质含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[5]中凯氏定氮法测定；水溶性蛋白质含量参照Yu 等[6]的方法测定；总氨基酸含量参照Fan 等[7]的方法进行测定；游离脂肪酸含量参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》[8]中的方法测定；胆甾醇含量参照GB 5009.128—2016《食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定》[9]中的方法进行测定；挥发性风味物质参照Wang 等[10]的方法采用风味分析仪进行测定。
1.3 数据处理
试验进行3 次重复，数据处理分析及作图采用Prism 9.0 软件，结果以平均值±标准差表示，差异显著性分析以P＜0.05 为差异显著。
2 结果与分析
2.1 不同干燥方式对膨腹海马干燥特性的影响
不同干燥方式对膨腹海马干燥特性的影响如图1所示。
图1 不同干燥方式对膨腹海马干燥特性的影响
Fig.1 Effects of different drying methods on drying properties of H. abdominalis
A. 膨腹海马干燥前后外观对比；B. 不同干燥方式下膨腹海马的收缩率；C.不同干燥方式下膨腹海马的色差。不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图1A、图1B 可知，干燥方式显著影响膨腹海马的收缩率。真空冷冻干燥（L-20、L-80、L-LN）能较好地维持样品原有形态，收缩率均在2.0%以下，相较而言，热风干燥组（HAD）和真空干燥组（VD）则分别导致14.0%和17.0%的显著收缩（P＜0.05）。由图1C 可知，干燥方式显著影响膨腹海马的色泽，与真空冷冻干燥组（L-20、L-80、L-LN）相比，热风干燥组（HAD）和真空干燥组（VD）色差显著（P＜0.05），L-20、L-80、L-LN 色差无显著差异（P＞0.05），且L-20、L-80 和L-LN 的色差分别比HAD 低78.39%、74.89% 和78.59%，此结果与Zhang 等[11]在金鲳鱼片中的发现一致。
2.2 不同干燥方式对膨腹海马水分状态及迁移的影响
不同干燥方式对膨腹海马水分状态与迁移的影响如图2 所示。
图2 不同干燥方式对膨腹海马水分状态与迁移的影响
Fig.2 Effects of different drying methods on water states and migrations in H. abdominalis
a～e 分别为不同干燥方式对HAD、VD、L-20、L-80、L-LN 膨腹海马水分相对含量的影响；f 为不同干燥方式对膨腹海马水分迁移的影响。
由图2 可知，干燥后不同处理组的结合水相对含量均增大，结合水的能量状态较低，结合较牢固，较难被去除[4]；干燥后不同处理组的不易流动水相对含量均减小，且VD 的不易流动水相对含量减小趋势小于其他处理组；干燥前后VD、L-LN 的自由水相对含量差异不明显，而HAD、L-20、L-80 自由水相对含量增大，LLN 在干燥第Ⅳ阶段氢质子信号强度分别比HAD、VD、L-20 和L-80 低35.26%、74.97%、68.77%和69.67%。
2.3 不同干燥方式对膨腹海马微观结构的影响
不同干燥方式下膨腹海马微观结构如图3 所示。
图3 不同干燥方式下膨腹海马微观结构
Fig.3 Microstructures of H. abdominalis under different drying methods
由图3 可知，HAD 与VD 膨腹海马肌原纤维断裂，蛋白质变性聚集，形成致密少孔结构，而L-20、L-80、L-LN 则形成较为规则的蜂窝状多孔结构，且视野下L-LN 形成的孔最规则，数量最多，L-80 次之。非冷冻干燥（HAD 和VD）导致水分蒸发，进而导致表面硬化；对于真空冷冻干燥而言，不同温度的冻结预处理导致冻结速率不同，冻结速率对冰晶大小及分布存在影响，进而导致膨腹海马组织结构所受机械作用存在差异。
2.4 不同干燥方式对膨腹海马蛋白质二级结构的影响
不同干燥方式对膨腹海马蛋白质二级结构相对含量的影响如图4 所示。
图4 不同干燥方式对膨腹海马蛋白质二级结构相对含量的影响
Fig.4 Effects of drying methods on relative content of protein secondary structures in H. abdominalis
a.不同干燥方式下膨腹海马的傅里叶变换红外光谱图；b.不同干燥方式的膨腹海马蛋白质二级结构相对含量。
由图4 可知，不同干燥方式下膨腹海马的傅里叶变换红外光谱呈现出相似的峰，但峰的位置略有移位（图4a），酰胺带A （3 300～3 200 cm-1）代表O—H 键和N—H 键的伸缩振动与H 键的伸缩耦合；L-20、L-80、LLN 在1 687.408～1 637.268 cm-1 处的吸收波段比HAD和VD 更强，3 种冻结方式的吸收波段强度中L-LN 强度最高，其次是L-20 与L-80，表明L-LN 过程可能更好地保留了水溶性化合物（如特定氨基酸和核苷酸）的相对含量。蛋白质红外光谱由酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带、酰胺Ⅳ、酰胺Ⅴ、酰胺Ⅵ、酰胺Ⅶ、酰胺A 带及酰胺B 带组成，在9 个特征吸收带中酰胺Ⅰ带（1 700～1 600 cm-1 ）对蛋白质二级结构的研究最有意义。利用Peak Fit 软件对1 700～1 600 cm-1 的光谱进行高斯分布拟合，并根据各子峰的面积计算蛋白质二级结构的含量（图4b）。
5 个处理组（HAD、VD、L-20、L-80 和L-LN）中的α-螺旋相对含量分别为20.05%、16.80%、17.88%、21.61%和35.08%，α-螺旋是典型的蛋白质二级结构构象[12]，在改善样品的机械强度方面具有重要作用[13]。无规则卷曲相对含量分别为31.25%、19.04%、19.46%、24.26%和19.67%。真空冷冻干燥处理组（L-20、L-80、L-LN）β-折叠与β-转角的总相对含量较低，且L-LN 的β-转角相对含量比L-20 和L-80 低15.02% 和5.12%。在干燥过程中，α-螺旋会部分变成β-折叠或β-转角，真空冷冻干燥可以在一定程度上抑制膨腹海马蛋白质α-螺旋向β-折叠或β-转角转化[6]，且该抑制效果与预冻处理表现出一定的相关性。
2.5 不同干燥方式对膨腹海马品质的影响
2.5.1 总蛋白质与水溶性蛋白质
总蛋白质及水溶性蛋白质含量如图5 所示。
图5 总蛋白质及水溶性蛋白质含量
Fig.5 Content of total protein and water-soluble protein
不同大写字母表示不同组别水溶性蛋白质含量差异显著，P＜0.05；不同小写字母表示不同组别总蛋白质含量差异显著，P＜0.05。
由图5 可知，干燥导致膨腹海马质量下降，使总蛋白质和水溶性蛋白质含量上升，但热诱导蛋白质结构变化、水溶性蛋白质损失、胶原蛋白转化为明胶流失，HAD 和VD 因热效应较强，蛋白质损耗较大，其含量显著低于真空冷冻干燥组（P＜0.05），且L-LN 总蛋白质含量比HAD 高12.90%。
2.5.2 总氨基酸与游离脂肪酸
总氨基酸与游离脂肪酸富集分析如图6 所示。
图6 总氨基酸与游离脂肪酸富集分析
Fig.6 Enrichment analysis of total amino acids and free fatty acids
a.不同干燥方式的膨腹海马总氨基酸富集分析；b.不同干燥方式的膨腹海马游离脂肪酸富集分析。C14:0 为十四烷酸（肉豆蔻酸）、C15:0 为十五烷酸，C16:0 为十六烷酸（棕榈酸）、C16:1n7 为顺-9-十六碳烯酸（棕榈油酸）、C17:0 为十七烷酸（珠光脂酸），C18:0 为十八烷酸（硬脂酸）、C18:1n9c 为顺-9-十八碳烯酸（油酸）、C18:2n6c 为顺，顺-9，12-十八碳烯酸（亚油酸）、C18:3n3 为全顺-9，12，15-十八碳三烯酸（α-亚麻酸）、C20:1 为顺-11-二十碳烯酸（花生油酸）、C20:4n6 为全顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）、C20:5n3 为全顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（二十碳五烯酸）、C24:0 为二十四烷酸（木焦油酸）、C24:1n9 为顺-15-二十四碳烯酸（神经酸）、C22:6n3 为全顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（二十二碳六烯酸）。
由图6a 可知，5 种处理组均为甘氨酸含量最高，5 组样品中8 种必需氨基酸，相对含量由高到低依次为赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸，L-20 的样品必需氨基酸含量最高，为47.41 mg/100 g，占总氨基酸含量的33.96%，必需氨基酸成分保留较好。HAD 的总氨基酸含量和必需氨基酸含量均最低，可能是由于HAD 氨基酸发生降解反应，此外，氨基酸和还原糖发生美拉德反应的速度可能大于氨基酸的生成速度，导致氨基酸损失[15-16]。L-LN总氨基酸含量最高，为146.54 mg/100 g，相较于L-20和L-80 分别高出4.74%和5.99%。
由图6b 可知，干燥样品中共检出21 种游离脂肪酸，其中L-LN 的油酸、亚油酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）及二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量均较高，不饱和脂肪酸占比也较高（L-20、L-80、L-LN 分别为62.38%、69.14%、68.14%），L-LN 不饱和脂肪酸含量比HAD 高49.93%，表明真空冷冻干燥结合液氮预冻有效抑制了脂质氧化与水解。
2.5.3 胆甾醇
胆甾醇含量如图7 所示。
图7 胆甾醇含量
Fig.7 Cholesterol content
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
膨腹海马胆甾醇含量与其作为药材的质量密切相关，因此可将其作为药材质量标准的参考依据。由图7 可知，在所有5 种处理的样品中，L-20、L-80、L-LN 的胆甾醇含量高于HAD，其中L-LN 的含量较高，为3.88 mg/g，比HAD 高11.07%，而VD 含量较低，为3.18 mg/g，各处理组胆甾醇含量有显著差异（P＜0.05）。由此推断，高温促进脂质氧化，生成过氧化物从而加速胆甾醇的氧化，此外水分蒸发可能会带走部分的游离胆甾醇，冷冻干燥可以抑制膨腹海马因温度导致的胆固醇降解，对于细胞的完整性保持较好，减缓脂质在干燥过程中的流失[17]。L-20 和L-80 相较于L-LN 胆甾醇含量分别减少了5.19% 和2.89%，慢速冻结时细胞内外的冰晶生长可能会造成水分流失，细胞受到损伤增加脂质氧化的风险，快速冷冻可以快速形成玻璃态冰，具有极高的稳定性，低温抑制酶的活性，降低脂质氧化速率，减少脂质渗出，最大限度地保持胆甾醇的含量[18]。
2.5.4 不同干燥方式对膨腹海马风味品质的影响
不同干燥方式的膨腹海马样品挥发性风味物质图谱如图8 所示。
图8 风味物质图谱
Fig.8 Flavor compounds map
由图8 可知，共检测出50 种挥发性风味物质，在热干燥过程中，脂质氧化形成醛和酮化合物，如2-己酮、2，3-丁二酮，而真空冷冻干燥此类物质的信号强度降低；热干燥过程中，过氧化物分解产物（如醛类、自由基）与干燥过程中腐败产生的低分子氮物质通过氧化等反应生成挥发性化合物，同时微生物代谢芳香族氨基酸的路径被激活或改变，导致鱼腥味物质的进一步释放[19]。真空冷冻干燥产生的乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯具有芳香水果气味，有效改善了膨腹海马干制品的风味，L-LN 对挥发性风味的抑制作用最强，也减少了部分挥发性风味物质的形成。膨腹海马经液氮预处理后的真空冷冻干燥相较于热风干燥组，能更好地抑制油脂及药草气味的生成，且对挥发性风味物质的抑制作用明显强于其他处理组，有效减少了2-乙基呋喃、2-壬酮、2-庚醇、α-蒎烯、2-辛酮等物质的含量。
3 结论
本研究通过对比热风干燥、真空干燥、-20 ℃冻结-真空冷冻干燥、-80 ℃冻结-真空冷冻干燥、液氮冻结-真空冷冻干燥5 种干燥方式对膨腹海马干燥特性及品质的影响，发现不同干燥方式对膨腹海马干燥特性及品质的影响不同，相较于热风干燥及真空干燥，冻结-真空冷冻干燥的膨腹海马具有较好的干燥特性，且干制品品质较好，主要体现为较好的外观品质、干燥过程中水分迁移与分布的优势、微观结构的特性、蛋白质二级结构的分布优势、各营养成分的种类及含量丰富等方面。其中，液氮冻结-真空冷冻干燥在膨腹海马微观结构、蛋白质二级结构分布、水分分布及迁移、风味品质等方面具有突出优势。
综上，本研究通过对膨腹海马干燥特性及品质多方面研究分析，发现真空冷冻干燥在膨腹海马特性及品质方面具备优势，且相较于-20 ℃冻结-真空冷冻干燥、-80 ℃冻结-真空冷冻干燥，液氮冻结-真空冷冻干燥在膨腹海马特性及品质方面优势更为突出，该研究为膨腹海马干燥工艺提供参考。
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