氧化是机体衰老和多种慢性疾病的重要因素之一，氧化反应所产生的过量自由基可诱导DNA 突变、加速蛋白质降解及促进细胞凋亡等[1]。在正常情况下，机体依靠超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等内源性抗氧化酶，清除体内生成的有害自由基，以保持内环境稳态。但有害自由基过多时，机体可通过主动摄入含抗氧化剂的物质来增强对自由基的清除能力[2]。免疫力低下可导致机体产生一系列疾病，机体的正常活动离不开免疫系统多方面的协调运行，其作用机制主要是通过调节免疫细胞的功能和细胞因子的分泌来实现[3]。近年来，随着社会的发展，人们的工作方式和生活习惯发生了剧烈变化。长期接触快餐食品或睡眠不足等，使得机体内自由基的产生过于活跃，容易造成免疫力低下[4-5]。因此，人们密切关注具有抗氧化及提高免疫力等功效的产品，而多糖因兼具上述生物活性成为科研人员的研究焦点。
多糖广泛存在于植物、大型真菌、细菌等生物体中，是一类由单糖通过糖苷键聚合连接而成的大分子化合物[6]。已有大量研究表明，食药用菌多糖的免疫调节[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]、抗炎[10]、抗糖尿病[11]、降血脂[12]等药用功效突出。目前，部分食药用菌多糖已经被用于健康食品、保健品和医药等领域。虫草作为食药用菌中重要的一类，其虫草多糖在抗氧化和增强免疫方面作用显著。王兰英等[13]研究表明冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）多糖能显著促进巨噬细胞增殖和提高体外抗氧化活性；Jing 等[14]研究发现蛹虫草（Cordyceps militaris）多糖能显著促进小鼠脾细胞增殖和提高体外抗氧化活性；孙寒雪等[15]证实了蝉花（Cordyceps cicadae）多糖能显著提高乳鸽体内抗氧化酶活性和免疫能力。
广东虫草（Cordyceps guangdongensis）是我国特有的一种虫草类食药用菌，其人工培养的子实体于2013年获批新资源食品，产业化应用前景广阔。国家卫生部批准的4 种食药用虫草种类中，广东虫草与冬虫夏草均隶属于线虫草科（Ophiocordycipitaceae），两者营养活性成分与药理功效相似。现有研究表明，广东虫草子实体富含虫草酸、腺苷、多糖、粗蛋白、脂肪酸等多种活性成分[16-19]，在抗禽流感[20]、抗疲劳[21]、抗炎[22]、改善慢性代谢紊乱[23]、降血脂[24]等方面有显著的功效。目前，国内广东虫草已实现工厂化大规模栽培[25]，一系列广东虫草相关产品正在被陆续开发。
本团队前期研究证实了广东虫草子实体多糖具有降血脂和护肝的药用功效[23-24]，但广东虫草子实体多糖在免疫调节与抗氧化方面的作用尚未进行系统报道。因此，本研究以广东虫草子实体为研究对象，采用热水浸提醇沉法获得广东虫草子实体粗多糖（记作CGFCP），再经DEAE-52 纤维素凝胶纯化出中性广东虫草子实体多糖（记作CGFPP-W）和酸性广东虫草子实体多糖（记作CGFPP-S），通过测定3 种多糖的单糖组分，比较抗氧化活性差异，系统分析不同浓度CGFCP 免疫调节作用，以期为将广东虫草开发成为保健品、功能性食品或生物医药提供科学理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性BALB/c 小鼠100 只（体质量18～22 g）、SPF 级雄性Hartley 豚鼠6 只（体质量350～450 g）:广东省医学实验动物中心。广东虫草子实体:广东省科学院微生物研究所人工栽培获得；D-葡萄糖标准品、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、三氯甲烷、醋酸酐、硼酸、硫酸钾、二叔丁基对甲酚、维生素C（均为分析纯）:广州硕恒生物科技有限公司；无菌脱纤维绵羊血（sterile defibrinated sheep blood，SRCB）:广州鸿泉生物科技有限公司；氯化钾（分析纯）:广东光华科技股份有限公司；巴比妥酸（分析纯）:上海科丰化学试剂有限公司；巴比妥钠（分析纯）:阿拉丁试剂（上海）有限公司；Hank's 平衡盐溶液（分析纯）:中国Genview 公司；2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，6-二叔丁基对甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、FeCl2、菲洛、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）:上海麦克林生化科技有限公司。
SA 缓冲液:1.438 g 巴比妥酸、0.255 g 氯化镁，0.042 g 氯化钙、21.25 g 氯化钠、0.938 g 巴比妥钠，加入480 mL 双蒸水中，冷却后用双蒸水定容至500 mL，得到贮存液。临用前取一定贮存液加4 倍体积的双蒸水混匀，0.22 μm 滤膜过滤除菌，供当天使用。
1.2 仪器与设备
DFY-250 高速万能粉碎机:温岭市林大机械有限公司；水浴锅:广州市荔湾托普仪器有限公司；MuLtiskan GO 酶标仪:赛默飞世尔科技公司；N1200B 旋转蒸发仪:日本东京理化器械株式会社；YP3001N 电子天平:上海精密科学仪器有限公司；JY92-IIDN 超声波细胞粉碎机:宁波新芝生物科技股份有限公司；BS-100N 自动部分收集器:上海沪西分析仪器厂有限公司；HP6890/5973 气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪、HD-9707 电脑紫外检测仪:上海精科实业有限公司；KDC2046 冷冻离心机:科大创新股份有限公司中佳分公司；CCL170B8 CO2 培养箱:新加坡艺思高科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 广东虫草子实体多糖的提取
1.3.1.1 热水浸提法
广东虫草子实体高速搅拌粉碎后过60 目筛，取10 g 粉末，按料液比1∶5 （g/mL）加入石油醚脱脂至溶液呈无色，待石油醚挥发后，按料液比1∶20 （g/mL）添加100 mL 蒸馏水，得到广东虫草水溶液。然后置于90 ℃水浴锅中浸提2 h，间隔30 min 搅拌。5 500 r/min离心15 min 取上清液，然后浓缩至20 mL，加3 倍体积无水乙醇4 ℃静置16 h，5 500 r/min 离心15 min 取沉淀，经无水乙醇脱水2 次，60 ℃干燥得粗多糖[18]。
1.3.1.2 超声波辅助热水浸提法
采用超声波处理广东虫草水溶液13 min（功率250 W，温度45 ℃）后，再采用热水浸提法（1.3.1.1 方法）获得粗多糖[26]。
1.3.1.3 酶浸提法
采用2% 纤维素酶预处理广东虫草水溶液，于pH5.0、55 ℃处理80 min，置于100 ℃水浴灭活30 min，再采用热水浸提法（1.3.1.1 方法）获得粗多糖[26]。
1.3.1.4 超声波协同酶辅助热水浸提法
先采用2%纤维素酶处理（1.3.1.3 方法）再进行超声波处理（1.3.1.2 方法），然后利用热水浸提法（1.3.1.1方法）获得粗多糖。
1.3.1.5 广东虫草子实体多糖提取率的测定
采用苯酚硫酸法[18]测定广东虫草子实体多糖的含量，平行重复3 次。多糖提取率（R，%）计算公式如下。
式中:m1 为葡萄糖标准曲线上对应的待测样品多糖的含量，μg；v1 为样品定容体积，mL；m2 为样品质量，μg；v2 为测定时样品体积，mL；0.9 为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。
1.3.2 除蛋白和纯化虫草多糖的制备
1.3.2.1 粗多糖的除蛋白
参照郑必胜等[27]的方法并进行部分修改，即将减压浓缩后的广东虫草子实体多糖水提物，用3 倍体积无水乙醇于4 ℃醇沉24 h，获得多糖样液。接着采用Sevag 法进行纯化去除粗蛋白，共3 次。具体方法如下:取100 mL 多糖样液，加入20 mL Sevag 试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1，体积比），混合后振摇20 min，4 000 r/min离心10 min，弃去下层有机相以及中间层蛋白质与Sevag 试剂生成的凝聚物，收集多糖上清液，真空干燥即得到CGFCP。
1.3.2.2 纯化虫草多糖的制备
参照朱培欣[28]的方法并稍作修改，精密称取500 g二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）纤维素DE-52凝胶，经蒸馏水加热除气并膨胀后，湿法装柱。以30 mL/h 流速用去离子水平衡24 h。取100 mg CGFCP配制成30 mg/mL 溶液，取3 mL 上样。先以3 倍柱体积去离子水洗脱，流速2 mL/min，紫外检测220 nm 洗脱曲线，并用自动收集器收集中性多糖组分（每管8 mL）。随后利用0.1 mol/L NaCl 溶液采用相同的方法洗脱酸性多糖。收集得到的中性多糖CGFPP-W 与酸性多糖CGFPP-S，经55 ℃减压浓缩并真空干燥，获得纯化虫草多糖。
1.3.3 广东虫草子实体多糖的单糖组成测定
参照陈艳蕊等[29]的方法并稍作修改。取10 mg 多糖样品（CGFCP、CGFPP-S、CGFPP-W）于密封的玻璃管中，加入5 mL 2 mol/L H2SO4 在100 ℃下水解8 h，水解液用BaCO₃进行中和后，收集悬浮液，旋转蒸发浓缩至干。残渣与10 mg 盐酸羟胺和0.5 mL 吡啶于90 ℃反应30 min，随后加入0.5 mL 醋酸酐于90 ℃继续反应30 min，生成乙酰化衍生物。使用配备火焰离子化检测器的GC-MS 仪进行分析。色谱条件:初始柱温130 ℃，先保持5 min，接着以4 ℃/min 升至240 ℃；进样口和检测器温度分别为280 ℃和300 ℃；载气为N₂（50 mL/min）。单糖标准品同法处理。
1.3.4 抗氧化活性测定
1.3.4.1 羟基自由基清除能力测定
参照Winterbourn 等[30]的方法，将1 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.15 mol/L、pH7.4）、1 mL 番红溶液（40 μg/mL）、1 mL 乙二胺四乙酸亚铁二钠溶液（0.945 mmol/L）和1 mL 3% H2O2 溶液，分别与0.5 mL 不同浓度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的多糖样品（CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S）溶液以及VC（作为阳性对照）混合后于37 ℃反应30 min，反应结束后在560 nm 处测定吸光度（A 样品）。空白对照组以双蒸水替代相应试剂（A 空白），每组设置3 个平行。羟基自由基清除率（Q，%）计算公式如下。
1.3.4.2 ABTS 阳离子自由基清除能力测定
参照Thi 等[31]的方法，将7 mmol/L ABTS 水溶液与2.45 mmol/L K2S2O8 按体积比2∶1 在黑暗中混合反应24 h，用94% 乙醇稀释至734 nm 处吸光度为0.17±0.03 时，得ABTS 工作液（现用现配）。取950 μL ABTS 工作液与50 μL 不同浓度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的多糖样品溶液、VC（作为阳性对照）混合，在黑暗处室温反应10 min，测定734 nm 处吸光度（A 样品）。空白对照组以双蒸水替代相应试剂（A 空白），每组设置3 个平行。ABTS+自由基清除率（B，%）计算公式如下。
1.3.4.3 DPPH 自由基清除能力测定
参照Thi 等[31]的方法，先用95% 乙醇将DPPH 配制成50 μmol/L DPPH 溶液，避光保存。再将多糖样品CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S 以及阳性对照（VC 和BHT）用双蒸水分别配制成0、2、4、6、8、10 mg/mL 溶液。接着将192 μL 的DPPH 溶液与48 μL 不同浓度的多糖样品、VC 和BHT 混合，在黑暗处室温反应30 min，测定517 nm 处吸光度（A 样品）。空白对照组以双蒸水替代相应试剂（A 空白），每组设置3 个平行。DPPH 自由基清除率（D，%）计算公式如下。
1.3.4.4 亚铁离子螯合能力测定
参照Dong 等[32]的方法，将1 mL 梯度浓度的多糖样品CGFCP、CGFPP-S、CGFPP-W（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的溶液分别与3.7 mL 去离子水混合，然后加入0.1 mL FeCl2（2 mmol/L）和0.2 mL 菲洛（5 mmol/L）反应20 min，于562 nm 处测定吸光度（A 样品），VC 和EDTA为阳性对照。空白对照组以双蒸水替代相应试剂（A 空白），每组设置3 个平行。亚铁离子螯合能力（F，%）计算公式如下。
1.3.4.5 总还原力测定
参照Thi 等[31]的方法，将0.25 mL 梯度浓度的多糖样品CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S 以及阳性对照VC的（0、2、4、6、8、10 mg/mL）溶液分别与0.25 mL PBS（0.2 mol/L，pH6.6）和0.25 mL K3Fe（CN）6 溶液混合，于50 ℃水浴20 min。再加入0.25 mL 10% 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，1 500×g 离心10 min。取0.5 mL 上清液与0.5 mL 双蒸水和0.1 mL FeCl3 溶液混合反应10 min，测定700 nm 处吸光度。空白对照组以双蒸水替代相应试剂，每组设置3 个平行。总还原力（Z）计算公式如下。
式中:Abs 为样品组吸光度；As 为用水代替铁氰化钾溶液的吸光度；Ab 为空白对照组吸光度。
1.3.5 体液免疫活性测定
动物实验在广东省医学实验动物中心进行，使用许可证号为SYXK（粤）2013-0002，动物伦理审查号为B201802-2 和B201802-3。动物房温度为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%，采用12 h 昼夜交替照明。参考钟媛媛等[33]的方法，将动物分为抗体生成细胞检测组和血清溶血素检测组，共100 只。每个检测组将小鼠随机分成5 组，每组10 只动物，共50 只，分别为CGFCP 低、中、高剂量组[25、50、100 mg/（kg·d）]、阴性对照组（纯净水）和阳性对照组（1 mg/mL 转移因子口服液）。每天灌胃1 次，连续30 d，灌胃体积为20 mL/kg体质量。实验分组时称量初始体质量，给药期间每周称量一次体质量。
1.3.5.1 CGFCP 对小鼠抗体生成细胞的影响
1）补体的制备:取1 mL 压积SRCB（SRCB 经3 000 r/min 离心15 min 去除大部分血浆）于5 mL 豚鼠血清，4 ℃冰箱放置30 min，充分振荡混匀，3 000 r/min离心15 min，取上清液，-70 ℃保存备用。
2% SRCB 混悬液的制备:300 μL 压积SRCB 用氯化钠溶液定容至15 mL，充分混匀，即得2% SRCB 混悬液。
豚鼠血清的制备:实验结束前，将腹主动脉穿刺采集6 只豚鼠全血，将血液样本于室温条件下静置约40 min，随后以3 000 r/min 离心15 min，分离取上层血清。
2）免疫动物:每只实验小鼠（给药第26 天）腹腔注射200 μL 2% SRCB 混悬液。
3）脾细胞悬液制备:末次给药24 h 后，处死小鼠并无菌摘取脾脏，置于Hank's 平衡盐溶液中，轻轻磨碎后经200 目筛网过滤，1 000 r/min 离心10 min，弃上清液；加入等体积红细胞裂解液，充分裂解后，1 000 r/min 离心10 min，弃上清液；所得脾细胞悬浮于3 mL 完全培养液中，台盼蓝染色检测细胞活力，并调整细胞浓度为5×10⁶ 个/mL。
4）抗体生成细胞检测:融化的1% 琼脂糖培养基（45～50 ℃）与等体积的2×Hank's 平衡盐溶液（pH7.2～7.4）混匀，以0.5 mL/管分装至离心管，依次加入50 μL 10% SRCB（SA 缓冲液配制）和25 μL 脾细胞悬液，充分混匀后迅速倾注于预制的琼脂糖包被玻片上，形成均匀薄层；待凝胶凝固后，将玻片水平放置在片架上，放入CO2 培养箱中孵育1.5 h，随后加入补体稀释液（8 倍体积SA 缓冲液配制）于玻片架槽内，继续培育1.5 h 后，在显微镜下计数溶血空斑数（空斑数与全脾细胞的比值）。
1.3.5.2 CGFCP 对小鼠血清溶血素的影响
1） 免疫动物:给药第26 天，每只实验小鼠腹腔注射200 μL 2% SRCB 混液。
0.5% SRCB 混悬液的制备:与2% SRCB 混悬液制备步骤相同，但最后取250 μL 洗涤后的压积SRCB，用50 mL 氯化钠配成0.5% SRCB 混悬液。
2） 取样:给药第31 天，通过眼球采血法获取外周血液样本并收集血清。
3） 凝集反应测定:使用生理盐水对血清样本进行倍比稀释，将100 μL 不同稀释度（1∶2、1∶4、1∶8……）的血清加入微量血凝实验板小孔内，随后加入等体积的0.5% SRCB 混悬液，充分混匀，装入湿润的平盘内并加盖，置于37 ℃恒温培养箱中孵育3 h，观察并记录红细胞凝集状态，血清稀释时要充分混匀，最后一个稀释度应不出现凝集现象。评估抗原、抗体反应的特异性结合能力以及强度水平。抗体体积数（K）计算公式如下。
式中:1～n 为对倍稀释的指数；S 为凝集程度的级别。其中，依据凝集程度S 分为0 级～Ⅳ级（S 对应取值为0～4）:0 级表示红细胞完全沉降，于孔底部形成致密圆点状沉积，周围上清液透明无凝集现象；Ⅰ级表示红细胞主要聚集于孔底呈圆点状，周围可见少量游离凝集红细胞；Ⅱ级表示红细胞在孔底形成薄层凝集，中心区域可见明显疏松红点；Ⅲ级表示红细胞均匀分布于孔底形成薄层，中心隐约可见微小致密红点；Ⅳ级表示红细胞均匀铺展于孔底形成完整薄层，部分凝集物可呈现卷曲或折叠形态。
1.4 数据处理
采用SPSS 22.0 软件进行数据显著性分析，采用Graphpad 10.0 进行作图。
2 结果与分析
2.1 广东虫草子实体多糖提取方法的比较
以D-葡萄糖为标准品，采用苯酚硫酸法分别测定其浓度为0、20、40、60、80、100 μg/mL 时的吸光度，葡萄糖标准曲线见图1。
图1 葡萄糖标准曲线
Fig.1 Glucose standard curve
由图1 可知，葡萄糖标准曲线为Y=0.009 81X+0.007 9（R2=0.996 9）。4 种提取方法的提取率比较结果如图2 所示。
图2 4 种提取方法的提取率比较
Fig.2 Extraction yield comparison among the four methods
WH 为热水浸提法；UWH 为超声波辅助热水浸提法；EWH 为酶浸提法；UEWH 为超声波协同酶辅助热水浸提法。不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图2 可知，多糖的提取率大小顺序为超声波协同酶辅助热水浸提法[（4.587±0.012）%]＞酶浸提法[（4.320±0.069）%]＞超声波辅助热水浸提法[（4.303±0.067）%]＞热水浸提法[（4.103±0.032）%]，且超声波辅助热水浸提法与酶浸提法之间无显著差异。综上，超声波协同酶辅助热水浸提法为广东虫草子实体多糖的最佳提取方法。
2.2 广东虫草子实体多糖的组成成分分析
采用GC-MS 法测定广东虫草子实体多糖的组成成分，结果见表1。
表1 广东虫草子实体多糖的组成成分分析
Table 1 Composition analysis of C. guangdongensis fruiting body polysaccharides
单糖组分核糖鼠李糖阿拉伯糖木聚糖甘露糖葡萄糖半乳糖含量/%CGFCP 3.718 4.107 37.878 1.801 26.517 17.623 8.356 CGFPP-W 0.079 0.158 0.635 0.229 59.924 7.325 31.651 CGFPP-S 1.392 4.147 0.365 0.264 52.878 14.355 26.598
由表1 可知，CGFCP 主要由阿拉伯糖（37.878%）、甘露糖（26.517%）和葡萄糖（17.623%）组成，而CGFPPW 和 CGFPP-S 主要由甘露糖（59.924% 和52.878%）、半乳糖（31.651% 和26.598%）和葡萄糖（7.325% 和14.355%）组成。CGFPP-W 和CGFPP-S 的单糖含量基本相同，但CGFPP-W 中的甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖略高于CGFPP-S，葡萄糖、鼠李糖和核糖明显低于GGFPP-S。粗多糖（CGFCP）和两种纯化多糖（CGFPPW 和CGFPP-S）的单糖组成主要差异之处在于，CGFCP 含量最高的单糖为阿拉伯糖，但CGFPP-W 和CGFPP-S 含量最高的单糖为甘露糖。该研究结果与Wan等[34]研究蝉花多糖和Gong 等[35]研究冬虫夏草多糖的单糖组成成分的结果相似，但主要单糖组成存在差异。
2.3 广东虫草子实体多糖的体外抗氧化能力分析
2.3.1 CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S 对羟基自由基的清除能力
广东虫草子实体多糖的羟基自由基清除能力见图3。
图3 广东虫草子实体多糖的羟基自由基清除能力
Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging ability of C. guangdongensis fruiting body polysaccharides
如图3 所示，在2～10 mg/mL 范围内，随着浓度的增加，3 种多糖和阳性对照VC 均表现出较好的羟基自由基清除能力。在低浓度2 mg/mL 条件下，各组羟基自由基清除率无明显差异。在4～8 mg/mL 浓度区间，CGFPP-W 表现出相对较高的羟基自由基清除活性，清除率大于CGFCP 和CGFPP-S。当浓度达到10 mg/mL时，3 种多糖的羟基自由基清除率趋于一致，分别为48.58%（CGFCP）、46.71%（CGFPP-W）和45.21%（CGFPP-S），其中粗多糖（CGFCP）对羟基自由基的清除能力强于两种纯化多糖（CGFPP-W 和CGFPP-S），此外，VC 的羟基自由基清除率（65.45%）明显高于3 种多糖。
2.3.2 CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S 对ABTS+自由基的清除能力
广东虫草子实体多糖的ABTS+自由基清除能力见图4。
图4 广东虫草子实体多糖的ABTS+自由基清除能力
Fig.4 ABTS+ free radical scavenging ability of C. guangdongensis fruiting body polysaccharides
如图4 所示，在2～10 mg/mL 范围内，随着浓度的增加，3 种多糖和阳性对照VC 均表现出较好的ABTS+自由基清除能力。当在2～4 mg/mL 浓度区间时，CGFCP、CGFPP-S 和VC 展现出相近的ABTS+自由基清除率，而CGFPP-W 的ABTS+自由基清除率明显低于其他3 个处理组。当浓度在6～10 mg/mL 之间时，3 种多糖和VC 对ABTS+自由基清除率相近。综上，随着浓度的上升，粗多糖（CGFCP）和两种纯化多糖（CGFPP-W 和CGFPP-S）对ABTS+自由基的清除能力逐渐趋于相近。
2.3.3 CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S 对DPPH 自由基的清除能力
广东虫草子实体多糖的DPPH 自由基清除能力见图5。
图5 广东虫草子实体多糖的DPPH 自由基清除能力
Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of C. guangdongensis fruiting body polysaccharides
如图5 所示，在2～10 mg/mL 范围内，随着浓度的增加，3 种多糖及2 个阳性对照（VC 和BHT）均表现出较好的DPPH 自由基清除能力。在浓度为2 mg/mL时，2 种阳性对照和CGFCP 对DPPH 自由基清除率明显高于2 种纯化多糖。当浓度超过2 mg/mL 后，随着浓度的增加，阳性对照（VC 和BHT）与CGFCP 对DPPH自由基的清除活性趋于稳定，但CGFPP-W 和CGFPPS 两种纯化多糖呈现小幅度增加趋势。在浓度为10 mg/mL 时，各样品DPPH 自由基清除率排序依次为BHT（77.08%）＞VC（49.17%）＞CGFCP（43.26%）＞CGFPPW（41.79%）＞CGFPP-S（41.62%）。综上，广东虫草子实体多糖的DPPH 自由基清除能力相对于脂溶性BHT，更接近水溶性维生素C，且粗多糖（CGFCP）对DPPH自由基的清除能力总体强于两种纯化多糖（CGFPP-W和CGFPP-S）。
2.3.4 CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S 对亚铁离子的螯合能力
广东虫草子实体多糖的亚铁离子螯合能力见图6。
图6 广东虫草子实体多糖的亚铁离子螯合能力
Fig.6 Ferrous ion chelating ability of C. guangdongensis fruiting body polysaccharides
如图6 所示，在2～10 mg/mL 范围内，随着浓度的增加，3 种多糖和2 个阳性对照（VC 和EDTA）均表现出较高的亚铁离子螯合能力。EDTA 作为强效螯合剂在2 mg/mL 时即达完全结合（100%），明显优于其他样品。在2～8 mg/mL 浓度区间，CGFPP-S 的亚铁离子螯合能力优于CGFPP-W，但随着浓度提升至10 mg/mL时，CGFPP-W 超过CGFPP-S。3 种多糖中，CGFPP-W在10 mg/mL 时展现出最高的亚铁离子螯合能力（78.49%），其次为CGFPP - S（68.92%）和CGFCP（39.69%），均明显高于VC（18.62%）。综上，在4～10 mg/mL 浓度内，两种纯化多糖（CGFPP-W 和CGFPP-S）对亚铁离子的螯合能力强于粗多糖（CGFCP）。
2.3.5 CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S 的总还原力
广东虫草子实体多糖的总还原力见图7。
图7 广东虫草子实体多糖的总还原力
Fig.7 Total reducing ability of C. guangdongensis fruiting body polysaccharides
如图7 所示，在2～10 mg/mL 范围内，随着浓度增加，3 种多糖和VC 阳性对照均表现出较好的总还原力，阳性对照VC 总还原力增幅趋缓，3 种多糖总还原力与浓度趋于正比关系。在浓度为2～10 mg/mL 时，随着浓度增加，3 种多糖总还原力明显增加。各样品总还原力强弱依此为VC＞CGFCP＞CGFPP-S＞CGFPP-W，粗多糖（CGFCP）的总还原力增幅明显强于两种纯化多糖（CGFPP-W 和CGFPP-S）。
体外抗氧化试验结果表明，广东虫草子实体多糖CGFCP、CGFPP-W 和CGFPP-S 具有较好的抗氧化活性。多糖的抗氧化活性不仅与多糖的单糖组成[36]、分子量[37]和官能团修饰[38]等有关，还与其共存的物质成分相关。元向东[39]研究发现，香菇菌丝体多糖LMPS-1的主要组成成分为阿拉伯糖（37%）和葡萄糖（33.4%），抗氧化能力随着多糖浓度的增加呈现上升的趋势。叶文姣等[40]研究表明，蛹虫草胞外粗多糖的体外抗氧化活性显著强于纯化多糖EPS-1，其原因可能是粗多糖中还含有多酚、类黄酮和类胡萝卜素等成分，这些物质成分具有清除自由基的能力，从而对粗多糖的抗氧化性产生协同增效作用。在浓度为10 mg/mL 时，广东虫草子实体粗多糖对清除羟基自由基和DPPH 自由基及总还原力方面的体外抗氧化活性强于两种纯多糖，可能是粗多糖中的阿拉伯糖本身具有抗氧化活性，同时粗多糖中其他抗氧化物质与单糖产生了协同效应。
2.4 广东虫草子实体粗多糖CGFCP 对正常小鼠体液免疫功能的影响
2.4.1 CGFCP 对正常小鼠抗体生成细胞的影响
CGFCP 对小鼠体质量和溶血空斑数的影响如表2所示。
表2 CGFCP 对小鼠体质量和溶血空斑数的影响
Table 2 Effects of CGFCP on body weight and hemolytic plaque number in mice
注:与阴性对照组相比，*表示差异显著（P＜0.05）。
组别阴性对照组阳性对照组CGFCP 低剂量组CGFCP 中剂量组CGFCP 高剂量组数量10 10 10 10 10体质量/g 0 d 19.0±0.8 18.8±0.7 19.1±0.9 19.0±0.7 19.2±0.8 7 d 20.8±1.4 20.8±1.3 20.8±0.8 20.3±1.1 20.7±1.5 14 d 22.7±1.9 22.6±1.4 22.6±0.8 22.5±0.8 22.1±1.9 21 d 23.7±2.1 23.1±1.4 23.6±1.2 23.2±1.0 23.6±2.1 28 d 24.9±2.5 24.0±1.8 24.5±1.0 24.2±1.0 24.5±2.0 30 d 25.4±2.4 24.6±1.6 25.1±1.1 24.8±1.0 25.0±2.0溶血空斑数/（个/全脾细胞）115±30 141±24*126±28 133±28 141±31*
由表2 可知，各组动物的平均体质量在实验观察周期内未表现出显著性差异（P＞0.05），表明CGFCP 对实验动物体质量的增长没有显著影响。CGFCP 低、中和高剂量组的溶血空斑数呈现剂量相关的免疫增强效应，且均高于阴性对照组，其中CGFCP 高剂量组溶血空斑数量较阴性对照组显著上升（P＜0.05），并达到与阳性药物组程度相近的免疫激活水平。这与Yu 等[41]的研究结果相似，他们发现蛹虫草胞外多糖能够显著增强脾脏B 淋巴细胞的增殖能力，且呈现剂量依赖性，表明高剂量组CGFCP 更能有效提升抗体生成细胞活性。
2.4.2 CGFCP 对正常小鼠血清溶血素的影响
血清溶血素是一种特异性抗体，能特异性结合并溶解红细胞，进而释放出血红蛋白。CGFCP 对小鼠体质量和抗体体积数的影响如表3 所示。
表3 CGFCP 对小鼠体质量和抗体体积数的影响
Table 3 Effects of CGFCP on body weight and titer number in mice
注:与阴性对照组相比，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
组别阴性对照组阳性对照组CGFCP 低剂量组CGFCP 中剂量组CGFCP 高剂量组数量10 10 10 10 10体质量/g 0 d 19.1±0.7 19.1±0.7 19.0±0.7 19.1±0.6 19.1±0.7 7 d 21.6±1.8 21.5±1.2 21.0±1.3 21.9±1.4 21.3±1.8 14 d 23.2±2.2 23.1±1.4 22.9±1.4 24.0±2.0 23.2±2.0 21 d 24.6±2.4 25.1±1.7 24.9±1.6 25.8±2.3 25.5±1.7 28 d 26.1±2.5 26.4±1.7 25.7±1.5 26.5±2.1 26.1±1.8 30 d 27.2±2.5 27.2±1.5 26.7±1.5 27.2±2.1 25.9±1.9抗体体积数/个70.8±11.6 91.4±16.1**78.8±14.1 80.7±9.3 85.5±15.5*
由表3 可知，各组平均体质量未表现出显著性差异（P＞0.05）。CGFCP 低、中和高剂量组抗体体积数随剂量增加而增强，且均高于阴性对照组，其中高剂量组与阴性对照组间存在显著差异（P＜0.05）。这与宋佳敏等[42]的研究结果相似，他们发现金蝉花多糖能够显著增加小鼠血清溶血素含量，且呈现剂量依赖性，表明高剂量组CGFCP 更能促进血清溶血素这一特异性抗体合成，来增强体液免疫应答。
3 结论
广东虫草子实体粗多糖（CGFCP）和两种纯化多糖（CGFPP-W 和CGFPP-S）的单糖组成成分相似，但主要单糖成分存在差异。广东虫草子实体3 种多糖对羟基自由基、ABTS+自由基、DPPH 自由基清除能力、亚铁离子螯合能力和总还原力整体均随着浓度的升高而增强，且在浓度为10 mg/mL 时粗多糖对清除羟基自由基、DPPH 自由基及总还原力方面的抗氧化活性强于两种纯化多糖。低、中和高剂量广东虫草子实体粗多糖均呈现剂量依赖性地显著增强正常哺乳动物的抗体细胞生成和血清溶血素。综上，本研究拓宽了广东虫草在抗氧化活性和体液免疫方面的认识，为功能性食品、保健品与药物研发提供新思路。
[1] KAMMEYER A,LUITEN R M. Oxidation events and skin aging[J].Ageing Research Reviews,2015,21: 16-29.
[2] AJIATI D,SUMIARSA D,AMIN M F,et al. Potential antioxidant and antiradical agents from Allium ascalonicum: Superoxide dismutase and density functional theory in silico studies[J]. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology ＆ Research,2024,15(3):171-176.
[3] KHIEOKHAJONKHET A,SUWANNALERS P,AEKSIRI N,et al.Effects of dietary Hericium erinaceus extract on growth,nutrient utilization,hematology,expression of genes related immunity response,and disease resistance of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus)[J]. Fish Physiology and Biochemistry,2024,50(6): 2519-2534.
[4] KAKADE S S,BOTE H K,et al. Effects of common food additives on HepG2 cells: Accumulation of reactive oxygen species and induction of cell damage and death[J]. ES Food and Agroforestry,2024,17: 1142.
[5] TIAN Y J,LIU X Y,LIU D Q. Physiological roles of reactive oxygen species in sleep homeostasis[J]. Free Radical Biology and Medicine,2026,242: 220-236.
[6] 郭向阳,王璐璐,马景可,等. 超声波降解多糖的作用表现、影响因素及机理研究进展[J]. 轻工学报,2025,40(4): 41-51.GUO Xiangyang,WANG Lulu,MA Jingke,et al. Research progress on ultrasonic degradation of polysaccharides: Effects,influencing factors,and mechanisms[J]. Journal of Light Industry,2025,40(4):41-51.
[7] WU Z W,LIU X C,QUAN C X,et al. Novel galactose-rich polysaccharide from Ganoderma lucidum: Structural characterization and immunomodulatory activities[J]. Carbohydrate Polymers,2025,362: 123695.
[8] ZHANG Y L,LEI Y,QI S R,et al. Ultrasonic-microwave-assisted extraction for enhancing antioxidant activity of Dictyophora indusiata polysaccharides: The difference mechanisms between single and combined assisted extraction[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2023,95: 106356.
[9] 曾露芝,吴春晨,向蒙,等. 羧甲基茯苓多糖对肠道病毒71 型的抗病毒活性及其机制研究[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版),2024,50(5): 104-111.ZENG Luzhi,WU Chunchen,XIANG Meng,et al. Study on the antiviral activity of carboxymethyl Poria polysaccharide against enterovirus 71 and its mechanism[J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences),2024,50(5): 104-111.
[10] CHEN S P,WANG J Q,DONG N,et al. Polysaccharides from natural Cordyceps sinensis attenuated dextran sodium sulfate-induced colitis in C57BL/6J mice[J]. Food ＆ Function,2023,14(2): 720-733.
[11] FENG X B,WANG P,LU Y X,et al. A novel polysaccharide from Heimioporus retisporus displays hypoglycemic activity in a diabetic mouse model[J]. Frontiers in Nutrition,2022,9: 964948.
[12] 杨新,白利琴,李研东,等. 黑木耳银耳山楂复配对高脂血症大鼠血脂代谢的影响[J]. 食品研究与开发,2021,42(2): 44-52.YANG Xin,BAI Liqin,LI Yandong,et al. Effect on blood lipid efficacy of Auricularia auricular,Tremella fuciformis and hawthorn in hyperlipidemic rat[J]. Food Research and Development,2021,42(2): 44-52.
[13] 王兰英,姜玲,赵静,等. 发酵虫草多糖提取工艺优化及其体外抗氧化、免疫活性研究[J]. 河南工业大学学报(自然科学版),2021,42(6): 80-88.WANG Lanying,JIANG Ling,ZHAO Jing,et al. Optimization of extraction and study on antioxidant and immune activity of polysaccharides from fermented Cordyceps sinensis in vitro[J]. Journal of Henan University of Technology (Natural Science Edition),2021,42(6): 80-88.
[14] JING Y S,CUI X L,CHEN Z Y,et al. Elucidation and biological activities of a new polysaccharide from cultured Cordyceps militaris[J]. Carbohydrate Polymers,2014,102: 288-296.
[15] 孙寒雪,刘雅丽,曾涛,等. 包被丁酸钠或蝉花多糖对乳鸽生长性能、屠宰性能及血清抗氧化和免疫指标的影响[J]. 动物营养学报,2021,33(10): 5645-5652.SUN Hanxue,LIU Yali,ZENG Tao,et al. Effects of coated sodium butyrate or Cordyceps cicadae polysaccharide on growth performance,slaughter performance and serum antioxidant and immune indexes of squabs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition,2021,33(10): 5645-5652.
[16] 林群英,李泰辉,宋斌,等. 广东虫草与冬虫夏草及蛹虫草的成分比较[J]. 食用菌学报,2009,16(4): 54-57.LIN Qunying,LI Taihui,SONG Bin,et al. Comparison of selected chemical component levels in Cordyceps guangdongensis,C. sinensis and C. militaris[J]. Acta Edulis Fungi,2009,16(4): 54-57.
[17] 林群英,李挺,宋斌,等. 广东虫草深层发酵及菌丝体成分分析[J]. 食品研究与开发,2014,35(3): 85-87.LIN Qunying,LI Ting,SONG Bin,et al. Studies on submerged culture and chemical components of Cordyceps guangdongensis mycelial[J]. Food Research and Development,2014,35(3): 85-87.
[18] 闫文娟,李泰辉,唐芳勇,等. 广东虫草多糖的提取及含量测定[J]. 华南农业大学学报,2009,30(4): 53-56.YAN Wenjuan,LI Taihui,TANG Fangyong,et al. Extraction and contents determination of polysaccharide in Cordyceps guangdongensis[J]. Journal of South China Agricultural University,2009,30(4): 53-56.
[19] 崔红燕,李泰辉,宋斌,等. 广东虫草脂肪酸的GC-MS 分析[J].食用菌学报,2010,17(2): 89-92.CUI Hongyan,LI Taihui,SONG Bin,et al. GC-MS analysis of fatty acids from Cordyceps guangdongensis[J]. Acta Edulis Fungi,2010,17(2): 89-92.
[20] 闫文娟,李泰辉,姜子德. 广东虫草抗禽流感病毒的初步研究[J]. 食用菌学报,2010,17(3): 64-66.YAN Wenjuan,LI Taihui,JIANG Zide. Antiviral activity of Cordyceps guangdongensis against influenza virus infections in mice[J].Acta Edulis Fungi,2010,17(3): 64-66.
[21] YAN W J,LI T H,LAO J H,et al. Anti-fatigue property of Cordyceps guangdongensis and the underlying mechanisms[J]. Pharmaceutical Biology,2013,51(5): 614-620.
[22] YAN W J,LI T H,ZHONG Z Y. Anti-inflammatory effect of a novel food Cordyceps guangdongensis on experimental rats with chronic bronchitis induced by tobacco smoking[J]. Food ＆ Function,2014,5(10): 2552-2557.
[23] WANG G Z,SUN C Y,HUANG Q J,et al. Effect and correlation of Cordyceps guangdongensis ethanolic extract on obesity,dyslipidemia and gut microbiota dysbiosis in high-fat diet mice[J]. Journal of Functional Foods,2023,107: 105663.
[24] WANG G Z,XIE B J,YANG X Y,et al. The “crosstalk” between gut microbiota,metabolites and genes in diet-induced hepatic steatosis mice intervened with Cordyceps guangdongensis polysaccharides[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2024,277: 134607.
[25] 林群英,李泰辉,黄浩,等. 广东虫草人工栽培的光温条件研究[J]. 华南农业大学学报,2009,30(1): 42-45.LIN Qunying,LI Taihui,HUANG Hao,et al. Studies on light and temperature conditions for cultivation of Cordyceps guangdongensis[J]. Journal of South China Agricultural University,2009,30(1): 42-45.
[26] ZHU Z Y,DONG F Y,LIU X C,et al. Effects of extraction methods on the yield,chemical structure and anti-tumor activity of polysaccharides from Cordyceps gunnii mycelia[J]. Carbohydrate Polymers,2016,140: 461-471.
[27] 郑必胜,何禄英. 广东虫草多糖脱蛋白及凝胶渗透色谱法表征其分子量分布的研究[J]. 现代食品科技,2009,25(6): 707-710.ZHENG Bisheng,HE Luying. Study on deproteinization of Cordyceps guangdongensis polysaccharide and its molecular weight distribution by GPC[J]. Modern Food Science and Technology,2009,25(6): 707-710.
[28] 朱培欣. 虫草多糖的分离纯化及其生理活性的研究[D]. 武汉:华中农业大学,2013.ZHU Peixin. Study on the purification and physiological activity of Cordyceps sinensis polysaccharide[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University,2013.
[29] 陈艳蕊,毛欣月,金文闻,等. 黄芪多糖结构及其单糖组成的气相色谱-质谱研究[J]. 现代生物医学进展,2011,11(S1): 4632-4635.CHEN Yanrui,MAO Xinyue,JIN Wenwen,et al. Study on Astragalus polysaccharide structure and monosaccharide constituents by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Progress in Modern Biomedicine,2011,11(S1): 4632-4635.
[30] WINTERBOURN C C,BUTTON H C. Hydroxyl radical production from hydrogen peroxide and enzymatically generated paraquat radicals: Catalytic requirements and oxygen dependence[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,1984,235(1): 116-126.
[31] THI N D,HWANG E S. Effects of different cooking methods on bioactive compound content and antioxidant activity of water spinach (Ipomoea aquatica)[J]. Food Science and Biotechnology,2015,24(3): 799-806.
[32] DONG C H,YAO Y J. In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis[J]. LWT-Food Science and Technology,2008,41(4): 669-677.
[33] 钟媛媛,杨晓涵,张要武,等. 三七多糖对小鼠免疫功能的影响[J]. 华西药学杂志,2016,31(6): 573-576.ZHONG Yuanyuan,YANG Xiaohan,ZHANG Yaowu,et al. Impact of Panax polysaccharides on immune function in mice[J]. West China Journal of Pharmaceutical Sciences,2016,31(6): 573-576.
[34] WAN J Q,ZHU Y L,JIANG X,et al. Immunomodulation of RAW264.7 cells by CP80-1,a polysaccharide of Cordyceps cicadae,via Dectin-1/Syk/NF-κB signaling pathway[J]. Food and Agricultural Immunology,2023,34(1): 2231172.
[35] GONG P,KE Y Y,WANG X J,et al. Structural characterization and hypoglycemic activity of Cordyceps sinensis polysaccharide(CSP-3)[J]. Food Bioscience,2024,61: 104999.
[36] YAO L M,ZHU L L,CHEN C L,et al. A systematic review on polysaccharides from fermented Cordyceps sinensis: Advances in the preparation,structural characterization,bioactivities,structure-activity relationships[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2024,282: 137275.
[37] HENG B L,WU F Y,LIU J H,et al. Antioxidant activity of Auricularia auricula polysaccharides with different molecular weights and cytotoxicity difference of polysaccharides regulated CaOx to HK-2 cells[J]. Bioinorganic Chemistry and Applications,2023,2023(1):9968886.
[38] PENG Y Y,ZHANG J H,YANG H L,et al. Acetylation modification and antioxidant activity of polysaccharides from Agrocybe cylindracea[J]. Journal of Food Measurement and Characterization,2022,16(3): 1911-1919.
[39] 元向东. 香菇菌丝体多糖的化学结构与抗氧化活性分析[J]. 食品与发酵工业,2016,42(8): 203-207.YUAN Xiangdong. Characteristic and antioxidant activities of polysaccharides by Lentinus edodes mycelium[J]. Food and Fermentation Industries,2016,42(8): 203-207.
[40] 叶文姣,冯武,黄文,等. 蛹虫草胞外多糖的体外抗氧化活性分析[J]. 华中农业大学学报,2014,33(5): 105-110.YE Wenjiao,FENG Wu,HUANG Wen,et al. Antioxidant activity of extracellular polysaccharides of Cordyceps militaris[J]. Journal of Huazhong Agricultural University,2014,33(5): 105-110.
[41] YU Y,WEN Q,SONG A,et al. Isolation and immune activity of a new acidic Cordyceps militaris exopolysaccharide[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2022,194: 706-714.
[42] 宋佳敏,王鸿飞,罗洁,等. 金蝉花多糖对小鼠免疫功能的影响[J]. 核农学报,2018,32(10): 1977-1983.SONG Jiamin,WANG Hongfei,LUO Jie,et al. Effect of Cordyceps cicadae polysaccharides on immunologic function of mice[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2018,32(10): 1977-1983.