2 型糖尿病是导致肾脏疾病的原因之一，据统计，约有30%～40%的糖尿病患者最终会发展成肾脏并发症，后续则会发展为终末期肾脏疾病，引起严重的肾功能衰竭并威胁生命。长期高血糖状态会导致肾小球滤过膜的损伤，也会引起肾小动脉内皮细胞功能异常，导致血管内皮功能障碍，同时也将导致肾小管细胞受损，导致间质纤维化和肾小管萎缩。此外，肾脏组织的氧化损伤也会激活一系列炎症反应，加速肾脏组织的损伤和纤维化过程。鲨鱼皮的真皮层结构由丰富的胶原蛋白、多糖和氨基酸组成[1]。其中，多糖以糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）为主。研究发现，GAGs 具有抗氧化、抗病毒[2]、抗肿瘤[3]、抗炎症[4]、抗补体[5]、抗凝血[6]等作用，同时也可参与调控血管生成[7]、骨质生长[8]、神经发育[9]等生理过程。鲨鱼皮是鲨鱼养殖产业重要的副产品，具有高价值化利用的巨大潜力。前期对梅花鲨（Halaelurus burgeri）鱼皮所含多糖进行研究，结果显示梅花鲨鱼皮中含有两种GAGs，分别为硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CHS）[10]和梅花鲨鱼皮类肝素（heparinoid from Halaelurus burgeri，Hep-hb）。部分活性实验中发现，Hep-hb 可以明显改善胰岛素抵抗小鼠的糖代谢，故本实验进一步探究其对并发症引起的肾脏损伤的影响，探讨其对以高脂饮食诱导小鼠肾脏的保护作用，以期进一步开发鱼副产品，推动海洋资源综合化利用。
1 材料与方法
1.1 材料
鲨鱼皮干品:市售。
1.2 实验动物
C57BL/6J4 小鼠[雄性，4～6 周龄，体质量（20±2） g]:至善（北京）健康医学有限公司。实验已获浙江海洋大学动物伦理委员会批准（2023011）。
1.3 试剂
丙酮、氯化钠、无水乙醇（均为分析纯）:国药集团化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）:麦克林生物技术（上海）有限公司；氯代十六烷基吡啶水合物[（cetylpyridinium chloride，CPC）,分析纯]:上海阿拉丁生化科技有限公司；DEAE Sepharose Fast Flow 填料:美国Millipore Sigma 公司；Superdex-葡聚糖凝胶:美国通用电气公司；甲基化试剂盒:博睿糖生物技术有限公司；罗格列酮（rosiglitazon，RSG）:美国默克公司；肌酐（creatinine，Cre）试剂盒、尿素氮（urea nitrogen，UN）试剂盒、尿酸（uric acid，UA）试剂盒、β-N-乙酰葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-glucosaminidase，NAG）试剂盒、尿微量白蛋白（microalbuminuria，mAlb）试剂盒、尿总蛋白测定试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒、一氧化氮（NO）试剂盒:上海酶联生物科技有限公司；Masson 染色套装、天狼星红染液试剂盒、抗原修复液:武汉赛维尔生物科技有限公司。
1.4 仪器与设备
血糖仪及检测试纸（智航觅）:罗氏血糖健康医护公司；酶标仪（Model680）:美国Bio-Rad 公司；病理切片机（RM2016）:上海徕卡仪器有限公司；正置荧光显微镜（ECLIPSE C1）:日本尼康株式会社；示差折光检测器（RI-201H）:日本昭和电工株式会社；全自动凝胶纯化系统（BRT01）:博睿糖生物科技有限公司；高效液相色谱仪（LC-20A）、气相质谱联用仪（GCMS-QP2010 Plus）:日本岛津公司；傅里叶变换红外光谱仪（FTIR-650S）:天津港东科技有限公司。
1.5 方法
1.5.1 Hep-hb 的制备与纯化
本实验所用制备方法参照文献[11]。对鲨鱼皮进行前处理，清洗、烘干、粉碎去掉大颗粒，使用10 倍体积丙酮去除脂肪，抽滤晾干。完全晾干后的样品（1 g）经木瓜蛋白酶（100 mg）于60 ℃酶解24 h。酶解混合物离心（4 000 r/min，15 min）所得上清液中添加1.6 mL/g CPC 水溶液至溶液中CPC 多糖络合物浓度达10%。室温静置24 h 后，离心（4 000 r/min，15 min）收集沉淀物复溶于原干物质1.5 倍剂量的3 mol/L NaCl∶无水乙醇（100∶15，体积比）溶液中，溶解完全后再次加入无水乙醇至总液体体积的60%进行最终沉淀。4 ℃静置24 h 后，离心（4 000 r/min，15 min）收集所得沉淀。去离子水溶解沉淀物，流动去离子水作为透析液使用10 kDa 半透膜透析24 h。充分分离的溶液进行旋蒸浓缩后冻干，得到Hep-hb 粗品。
将Hep-hb 粗品置于去离子水中加热至完全溶解后离心（12 000 r/min，10 min），并取上清液进行DEAESephacel 上机分级。流速调节至15 mL/min 进行洗脱，共设置4 组溶剂:水、0.2 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl、1.0 mol/L NaCl。跟踪检测采用苯酚-硫酸法，在490 nm 处使用酶标仪检测3 次，然后根据散点图峰值收集和浓缩样品，使用3 500 Da 透析袋进行透析后冷冻干燥。获得由不同浓度NaCl 洗脱的系列组分。其中，1.0 mol/L NaCl 洗脱部分为主要活性组分，将其富集后进行下一步凝胶纯化。将适量的多糖溶解在流动相中后离心（12 000 r/min，10 min），收集上清液进入全自动凝胶纯化系统。通过示差折光检测器检测并收集对称峰。对收集溶液进行浓缩冻干，获得纯化Hep-hb。
1.5.2 动物分组及造模
全部小鼠分成5 组（n=10），在无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级实验室条件下饲养[温度（22±2） ℃、湿度（45±5）%、12 h 昼夜周期）]。正常组允许自由摄入标准颗粒饮料与饮用水，其余组允许自由摄入高脂颗粒饮料与饮用水。正常组:灌胃蒸馏水的健康小鼠；模型组:灌胃蒸馏水的高脂饮食诱导模型小鼠；阳性对照组:灌胃罗格列酮（rosiglitazone，RSG）治疗模型小鼠，3 mg/（kg·d）；低剂量Hep-hb 组:灌胃Hephb 治疗模型小鼠，20 mg/（kg·d）；高剂量Hep-hb 组:灌胃Hep-hb 治疗模型小鼠，80 mg/（kg·d）。
实验周期内，诱导和干预过程同时进行，以4 周时血糖仪数据组组间差异作为造模成功标准。在麻醉处死3 d 前采集尿液样本，将每组小鼠单独放入不同的代谢笼中，禁食不禁水取样5 h 以上，确保取样量充足且干扰较少。灌胃调控105 d 后，小鼠暂停整夜饮食后麻醉处死。收集肾脏并称重记录，部分使用专用固定液前处理并进行组织观察，其余样品于-80 ℃长期保存。
1.5.3 肾脏代谢指标测定
尿糖水平采用葡萄糖氧化酶法测定，尿液中UN水平采用脲酶法测定、Cr 水平采用苦味酸法测定、UA水平采用磷钨酸钠显色法测定。尿液中总蛋白水平采用双缩脲法测定，mAlb 水平的测定采用溴甲酚绿比色法，尿液中NAG 水平的测定采用对硝基苯酚法，肾脏NO 水平、ROS 水平等氧化应激指标采用可见分光光度法。
1.5.4 肾脏组织的微观结构观察
新鲜肾脏组织提前固定处理至少24 h 后，使用梯度酒精脱水。脱水后的组织浸蜡包埋3 次。包埋好的蜡块修整后进入-20 ℃冷却，切片机切分至4 μm，在40 ℃温水中展平，升温至60 ℃完全烘干以备染色。
1.5.4.1 天狼星红染色
石蜡切片在天狼星红染液中染色至完全，采用无水乙醇脱水至合适程度再进行二甲苯处理，最后使用中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集后通过FIJI 图像处理软件对切片进行组织学分析。
1.5.4.2 Masson 染色
石蜡切片顺序浸入Masson 套组染液，完全染色后用1%醋酸漂洗分化，无水乙醇脱水后二甲苯处理，最终中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集后通过FIJI图像处理软件对切片进行组织学分析。
1.6 统计学分析
实验中所有结果均以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 进行统计分析。组间单因素方差分析确定统计学显着性，以p＜0.05 为差异显著。
2 结果与分析
2.1 Hep-hb 对小鼠空腹血糖和尿糖水平的影响
尿糖也是糖尿病的症状之一，正常尿液中只含有极少量的糖[12]，高血糖是糖尿病的主要临床症状。健康肾脏的代谢过程中，糖和蛋白质经过重吸收作用后并不会进入尿液。Hep-hb 对小鼠空腹血糖和尿糖水平的影响见表1。
表1 Hep-hb 对小鼠空腹血糖和尿糖水平的影响
Table 1 Effect of Hep-hb on fasting blood glucose and urine glucose in mice
注:同列不同小写字母表示组间差异显著（p＜0.05）。
尿糖水平/（μmol/L）2.25±0.31e 20.75±0.41a 8.75±0.29b 4.75±0.34c 3.21±0.01d组别正常组模型组阳性对照组低剂量Hep-hb 组高剂量Hep-hb 组空腹血糖水平/（mmol/L）6.63±0.10c 12.03±0.84a 9.48±0.08b 10.15±0.54b 6.53±0.33c
由表1 可知，模型组小鼠与正常组小鼠相比，空腹血糖具有显著差异（p＜0.05），提示造模成功，与正常组相比，高、低剂量Hep-hb 组血糖水平分别降低45.74%和15.59%。灌胃Hep-hb 后，相较于模型组，高、低剂量组的血糖水平和尿糖水平均显著降低（p＜0.05），高剂量组小鼠的尿糖水平降低了84.53%，低剂量则降低了77.11%。以上结果表明Hep-hb 可以恢复小鼠异常血糖状态，显著改善其尿糖症状。
2.2 Hep-hb 对小鼠尿液蛋白水平的影响
糖尿病患者由于长期血糖控制不良，导致肾小球过滤功能异常，表现为尿蛋白水平增加。其中，尿微量白蛋白为尿液中白蛋白的含量超过正常值但并未到达临床蛋白尿的水平，通常作为一种早期的肾脏损伤标志[13]。而蛋白尿包括微量白蛋白和其他大分子蛋白，通常意味着肾脏已经出现了较为严重的损伤，尤其是肾小球过滤屏障功能受损[14]。Hep-hb 对小鼠尿液蛋白水平的影响见表2。
表2 Hep-hb 对小鼠蛋白尿的影响
Table 2 Effect of Hep-hb on proteinuria in mice mg/mL
注:同列不同小写字母表示组间差异显著（p＜0.05）。
组别正常组模型组阳性对照组低剂量Hep-hb 组高剂量Hep-hb 组尿mAlb 水平0.39±1.50×10-3e 1.03±1.12×10-3a 0.66±4.56×10-4c 0.77±7.61×10-4b 0.57±1.17×10-3d尿总蛋白水平9.04±0.24e 40.77±0.31a 25.31±0.35c 28.14±0.18b 16.99±0.11d
表2 数据显示，模型组小鼠与正常组小鼠相比，尿微量白蛋白和总蛋白水平均具有显著性差异（p＜0.05）。灌胃Hep-hb 后，相较于模型组，低剂量组的微量白蛋白和总蛋白水平分别降低了25.24% 和30.98%，高剂量组的微量白蛋白和总蛋白水平分别显著降低了44.66%和58.34%（p＜0.05）。
2.3 Hep-hb 对小鼠尿液中代谢产物的影响
Cr、UN 和UA 由体内肌酸、蛋白质和嘌呤代谢产生，这类代谢指标异常通常提示肾功能不全。其中，尿素氮水平升高往往伴随肾小球过滤能力下降[15]，Cr 水平升高一般出现在肾功能损伤后期阶段，往往暗示肾脏损伤较重、排毒功能下降[16]，尿酸水平升高也一定程度反映了肾脏功能损伤以及疾病程度的加重[17]。Hephb 对小鼠尿液中代谢产物的影响见表3。
表3 Hep-hb 对小鼠尿液中代谢产物的影响
Table 3 Effect of Hep-hb on metabolite of mice urine
注:同列不同小写字母表示组间差异显著（p＜0.05）。
组别正常组模型组阳性对照组低剂量Hep-hb 组高剂量Hep-hb 组Cr 水平/（mol/L）1.68±0.72c 4.11±0.35a 2.43±0.38b 2.51±0.36b 1.71±0.64bc UN 水平/（mmol/L）1.32±7.67×10-7d 11.03±6.48×10-7a 2.50±1.77×10-7c 4.50±7.00×10-9b 1.59±5.20×10-9e UA 水平/（g/L）5.58±0.02d 38.84±0.34a 13.08±0.33c 16.90±1.34b 5.84±0.03d
由表3 可知，与正常组小鼠相比，模型组小鼠Cr水平、UN 水平和UA 水平分别增长了144.64%、735.61% 和596.06%（p＜0.05）。在Hep-hb 调控后，小鼠肾脏代谢异常症状显著减轻，低剂量组与模型组相比各指标分别下降38.93%、59.20%、56.49%，高剂量组分别下降58.39%、85.58%和84.96%。
2.4 Hep-hb 对小鼠尿液NAG 水平的影响
NAG 是来自肾近端曲小管溶酶体水解酶，其异常增长往往作为肾小管损伤的标志。肾小管细胞受损时，尿NAG 水平通常伴随性地显著升高。Hep-hb 对小鼠尿液中NAG 水平的影响见表4。
表4 Hep-hb 对小鼠尿NAG 水平的影响
Table 4 Effect of Hep-hb on NAG of mice urine
注:同列不同小写字母表示组间差异显著（p＜0.05）。
组别正常组模型组阳性对照组低剂量Hep-hb 组高剂量Hep-hb 组NAG 水平/（U/L）0.17±3.63×10-5c 0.31±5.72×10-4a 0.24±3.39×10-5bc 0.29±4.45×10-4ab 0.20±1.64×10-3c
由表4 可知，模型组小鼠NAG 水平相较于正常组显著升高约83.23%，在Hep-hb 灌胃调控下，高剂量组小鼠的代谢异常症状明显减轻，NAG 水平显著下降约35.62%。
2.5 Hep-hb 对小鼠肾脏结构指标的影响
肾脏指数是反映肾脏功能和结构的重要指标，肾脏滤过功能下降会导致肾脏质量降低；肾脏指数可以反映肾脏的功能状态，如排泄、代谢、电解质调节等[18]。小鼠麻醉处死时的肾脏指数见表5。
表5 Hep-hb 对小鼠肾脏指数的影响
Table 5 Effect of Hep-hb on kidney-to-body weight ratio of mice
注:同列不同小写字母表示组间差异显著（p＜0.05）。
组别正常组模型组阳性对照组低剂量Hep-hb 组高剂量Hep-hb 组肾脏指数（肾重/体质量）0.012±2.136×10-6ab 0.011±1.306×10-7c 0.011±2.305×10-8c 0.012±8.996×10-8b 0.014±2.153×10-7a
由表5 可知，模型组的肾脏指数明显降低，这验证了模型组小鼠的肾脏损伤。糖尿病引起的肾脏损伤往往伴随着器官结构的病理性改变，从而对肾脏质量产生影响[19]。
进一步观察小鼠肾脏的具体细胞形态，Hep-hb 对小鼠肾脏微观结构的影响见图1 和图2。
图1 小鼠肾脏天狼星红染色切片（40×）
Fig.1 Sirius red stained sections of mouse kidney （40×）
图2 小鼠肾脏Masson 染色切片（40×）
Fig.2 Masson-stained sections of mouse kidney （40×）
如图1 所示，模型组中多数细胞呈现严重空泡化，且局部照片可见肾小球体积增大，基质沉积明显，而正常组肾脏细胞排列紧密且形态正常。结合肾脏指数结果，证明胰岛素抵抗状况严重影响了小鼠肾脏组织的正常结构。在Hep-hb 的调控下，肾脏细胞形态有非常明显的改善，低剂量Hep-hb 组虽未完全逆转肾细胞形态的病变，但是明显减少了空泡化面积。在高剂量Hep-hb 组中则观察到了肾脏细胞排列分布的好转，与正常组差异最小，基本恢复到正常肾脏形态。
如图2 所示，Masson 染色照片中的小鼠肾脏胶原纤维以蓝色表示。模型组细胞空泡情况严重，肾小球有不同程度的纤维束增粗。在Hep-hb 的调控下，肾小球形态有较明显的改善，其中高剂量Hep-hb 组可见肾脏细胞形态的恢复。
2.6 Hep-hb 对小鼠肾脏氧化应激的影响
肾脏中一氧化氮（NO）水平增加会造成组织的氧化应激，同时促进活性氧（ROS）过量生成[20]，过量的ROS 可以破坏细胞的正常生物活性，也可直接损伤肾脏、心脏、血管和神经系统，糖尿病并发症也会随之产生[21]。Hep-hb 对小鼠肾脏氧化应激的影响见表6。
表6 Hep-hb 对小鼠肾脏氧化应激的影响
Table 6 Effect of Hep-hb on oxidative stress of kidney in mice
注:同列不同小写字母表示组间差异显著（p＜0.05）。
ROS 水平/（ng/mL）38.95±1.51e 100.38±1.12a 66.28±4.56c 77.06±7.61b 56.94±1.17d组别正常组模型组阳性对照组低剂量Hep-hb 组高剂量Hep-hb 组NO 水平/（μmol/L）57.24±5.68d 137.99±3.16a 98.33±3.50b 80.24±0.68c 70.83±2.65c
由表6 可知，模型组的NO 及ROS 水平相较正常组均有显著性升高，表明模型组肾脏存在较为严重的氧化应激症状。两个Hep-hb 调控组均显著下调了NO及ROS 水平。其中，NO 水平在高、低剂量调控下分别下调48.67%和41.85%，ROS 水平分别下调43.27%和23.23%。
3 讨论与结论
本实验以高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠为模型，通过检测尿液及肾脏组织中葡萄糖、蛋白、Cr、UN、UA、NAG、NO、ROS 水平等指标，对胰岛素抵抗小鼠的肾脏病变程度进行表征。数据显示，模型组尿液全部指标水平均显著升高，血糖的显著性差异提示胰岛素抵抗模型造模成功。Hep-hb 灌胃治疗可显著降低尿液中葡萄糖、mAlb、总蛋白、UN、Cr、UA 和NAG 的水平，这说明了Hep-hb 对尿液中葡萄糖、蛋白、代谢产物和NAG 水平有显著抑制作用。肾脏指数和纤维观察结果显示，Hep-hb 对胰岛素抵抗引起的氧化应激和肾脏病变也具有一定的修复作用，肾脏细胞形态、肾小球体积异常、肾脏活性氧簇失衡的情况均有效改善。
研究中所涉及的鲨鱼皮类肝素属于糖胺聚糖家族，该类物质已被证实含有多种生物活性，如:抗氧化活性、抗炎活性、抗肿瘤活性、免疫调节活性等。综上结果表明，鲨鱼皮类肝素可有效修复2 型糖尿病引起的肾脏细胞损伤、恢复肾脏功能。具体分子机制与胰岛素抵抗引起的细胞内线粒体功能异常、激活炎症途径、影响细胞内抗氧化系统的功能等关键细胞因子的表达等有关，可通过进一步实验探讨验证。Hep-hb 作为一种优质天然聚合物，具备资源可持续性高、毒副作用低、生物相容性好等优点，其优越的生物特性有望提升鲨鱼副产品的再利用价值。本文为鱼副产物的高值化利用提供数据支撑，一定程度上拓展了天然聚合物在肾病预防和辅助治疗中的应用前景。
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