小麦是全球产量第三大的作物,占全球谷物产量的30%。我国是世界上最早种植小麦的国家之一,也是小麦生产大国[1]。小麦面筋蛋白是小麦的主要成分,约占籽粒总氮的80%,是一种质优价廉、营养丰富、来源广泛的植物蛋白[2]。
小麦面筋蛋白主要包括麦谷蛋白和醇溶蛋白,其中醇溶蛋白为单聚体,麦谷蛋白为多亚基的大分子聚集体[3]。由于小麦面筋蛋白的特殊组成,使其在水中的溶解度极差,这严重限制了它在食品工业中的进一步应用[4]。为解决这一问题,目前,已经有大量研究通过物理、化学和酶改性方法提高小麦面筋蛋白的溶解度[5],拓宽其应用领域。其中酶改性法相较于物理改性如加热[6]、超声[7]、高压[8]、微波[9]等方法改性效果好且无需大型仪器设备。与化学改性方法如酰化[10]、糖基化[11]、磷酸化[12]和脱酰胺[13]相比产物更易控制且安全环保[14]。因此,酶法改性在蛋白改性领域十分具有前景,酶解植物源蛋白开发具有明确化学和营养特性的水解肽成为近年来的热点[15-16]。由于工业技术的发展,单酶酶解工艺已逐渐不能满足生产的要求,双酶分步酶解法可以通过不同酶酶切位点的特异互补作用,进一步有效提高蛋白质的溶解度及功能特性[17]。
为提高小麦面筋蛋白的进一步利用,本研究以水溶性蛋白质得率(溶解度)为考察指标,采用4 种蛋白酶进行酶解试验,筛选得出两种作用效果较好的酶,进行双酶酶解小麦面筋蛋白的工艺优化。以期为小麦面筋蛋白的高值化利用提供理论依据和技术支持。
谷朊粉[水分含量为(9.26±0.30)%,灰分为(0.72±0.03)%,粗蛋白含量为(80.5±0.7)%,脂肪含量为(1.4±0.2)%]:封丘县华丰粉业有限公司;S10154 碱性蛋白酶(20 万U/g):上海源叶生物科技有限公司;NP-100a中性蛋白酶(10 万 U/g)、PA-2 木瓜蛋白酶(60 万U/g)、GLU100 谷氨酰胺酶(≥100 U/g):安琪酵母股份有限公司;硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、盐酸、硼酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼酸钠(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司。
SHJ-6A 磁力搅拌水浴锅:常州金坛良友仪器有限公司;TGL-20bR 高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂;JK9870 全自动凯氏定氮仪、JRX-20S/L 曲线升温消化炉:济南精锐分析仪器有限公司;ME104E/02 电子分析天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.3.1 单一蛋白酶酶解试验
参照张锐昌[18]的方法,并稍作修改,在室温下称取谷朊粉和去离子水置于250 mL 烧杯中,在磁力搅拌水浴锅内匀浆配制成相应浓度的悬浮液,待悬浮液中心温度升至蛋白酶所需最适温度后,用1 mol/L NaOH 调节谷朊粉悬浮液至蛋白酶所需最适pH 值,加入碱性蛋白酶或中性蛋白酶,开始计时。酶解过程以1 mol/L NaOH 标准溶液维持反应体系pH 值恒定,酶解至对应酶解时间后结束酶解反应。所得酶解产物立即在100 ℃水浴中灭酶10 min,然后待样品冷却,加入6 mol/L HCl 调节溶液pH 值至7.0,将酶解产物在0~4 ℃、10 000 r/min 条件下离心20 min,收集上清液,4 ℃下备用待测。
1.3.2 碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白单因素试验
考察不同底物浓度对蛋白质得率的影响时,固定碱性蛋白酶添加量为8 000 U/g、酶解pH 值为8.0、酶解温度为55 ℃、酶解时间为3 h,设置底物浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%和14%。考察碱性蛋白酶添加量对蛋白质得率的影响时,固定底物浓度为10%、酶解pH 值为8.0、酶解温度为55 ℃、酶解时间为3 h,设置碱性蛋白酶添加量分别为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g。考察酶解温度对蛋白质得率的影响时,固定底物浓度为10%、碱性蛋白酶添加量为8 000 U/g、酶解pH 值为8.0、酶解时间为3 h,设置酶解温度分别为40、45、50、55、60、65 ℃。考察pH 值对蛋白质得率的影响时,固定底物浓度为10%、碱性蛋白酶添加量为8 000 U/g、酶解温度为55 ℃,设置酶解pH值分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。
1.3.3 碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白正交试验
根据单因素试验结果确定正交试验参数范围,选取酶添加量(A)、酶解温度(B)、底物浓度(C)、酶解pH值(D)作为考察因素,以蛋白质得率为考察指标,采用四因素三水平正交试验进行优化设计以获得最佳碱性蛋白酶酶解工艺,因素水平见表1。
表1 碱性蛋白酶酶解正交试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of orthogonal design of alkaline protease hydrolysis
水平1 2 3因素A 酶添加量/(U/g)6 000 8 000 10 000 B 酶解温度/℃50 55 60 C 底物浓度/%6 8 10 D 酶解pH 值7.0 7.5 8.0
1.3.4 中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白单因素试验
考察不同底物浓度对蛋白质得率的影响时,固定中性蛋白酶添加量为8 000 U/g、酶解pH 值为7.0、酶解温度为50 ℃、酶解时间为3 h,设置底物浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%、14%。考察中性蛋白酶添加量对蛋白质得率的影响时,固定底物浓度为8%、酶解pH 值为7.0、酶解温度为50 ℃、酶解时间为3 h,设置中性蛋白酶添加量分别为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g。考察酶解温度对蛋白质得率的影响时,固定底物浓度为8%、中性蛋白酶添加量为8 000 U/g、酶解pH 值为7.0、酶解时间为3 h,设置酶解温度分别为40、45、50、55、60、65 ℃。考察pH 值对蛋白质得率的影响时,固定底物浓度为8%、中性蛋白酶添加量为8 000 U/g、酶解温度为50 ℃,设置酶解pH 值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。
1.3.5 中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白正交试验
根据单因素试验结果确定正交试验参数范围,选取酶添加量(A')、酶解温度(B')、底物浓度(C')、酶解pH 值(D')作为考察因素,以蛋白质得率为考察指标,采用四因素三水平正交试验进行优化设计,从而获得最佳中性蛋白酶酶解工艺,因素水平见表2。
表2 中性蛋白酶酶解正交试验因素水平设计
Table 2 Factors and levels of orthogonal design of neutral protease hydrolysis
水平1 2 3因素A'酶添加量/(U/g)6 000 8 000 10 000 B'酶解温度/℃45 50 55 C'底物浓度/%8 10 12 D'酶解pH 值6.5 7.0 7.5
1.3.6 双酶分步酶解试验
第一步酶解反应结束后,沸水浴灭酶10 min,冷却后调至一定的pH 值,进行第二步酶解。酶解结束后,再次沸水浴灭酶,待样品冷却,加入6 mol/L HCl 调节溶液pH 值至7.0,将酶解产物在10 000 r/min 下0~4 ℃离心20 min,收集上清液,4 ℃下备用待测。
1.3.7 双酶分步酶解顺序的确定
根据预试验结果,两种蛋白酶在开始酶解反应后的1 h 内,表现出最高的酶解效率。因此,在确定双酶分步酶解的顺序时,两步酶解过程的时间均设定为1 h。采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行组合,由于双酶同步水解无法保证体系中两种酶都处于最适条件,因此本研究以双酶分步酶解为主,未设置双酶同步酶解试验。酶解条件如表3 所示,组合顺序如表4 所示。
表3 不同蛋白酶酶解工艺参数
Table 3 Hydrolysis conditions with different proteases
酶种类碱性蛋白酶中性蛋白酶底物浓度/%10 10酶添加量/(U/g)8 000 8 000酶解温度/℃60 55酶解pH 值8.0 7.0酶解时间/h 1 1
表4 双酶分步酶解试验设计
Table 4 Design of the two-step enzymatic hydrolysis test
序号1 2第一步酶解碱性蛋白酶中性蛋白酶第二步酶解中性蛋白酶碱性蛋白酶
1.3.8 双酶分步酶解正交试验
按表5 进行双酶分步酶解正交试验[17],测定酶解液的蛋白质得率,得到最佳的双酶分步酶解试验顺序。根据蛋白酶水解曲线结果,拟设计正交分步酶解时间为1~2 h,在保证酶解效率的同时,最大限度地缩短总酶解时间,优化酶解过程。
表5 双酶分步酶解正交试验设计
Table 5 Orthogonal design for two-step enzymatic hydrolysis
水平1 2 3因素A″第一步酶添加量/(U/g)6 000 8 000 10 000 B″第一步酶解时间/h 1.0 1.5 2.0 C″第二步酶添加量/(U/g)6 000 8 000 10 000 D″第二步酶解时间/h 1.0 1.5 2.0
1.3.9 蛋白质得率测定
参照An 等[19]的方法并适当调整,蛋白质得率为酶解液上清液中总氮量占底物中总氮量的百分比,上清液和底物中的总氮量均采用GB/T 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》进行测定,计算公式如下。
式中:N 为氮含量,g/100 g;V1 为试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,mL;V2 为空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,mL;V3 为吸取消化液的体积,mL;c 为标准滴定液的浓度,mol/L;m 为试样的质量,g;0.014 0为与1.0 mL 标准滴定液溶液相当的氮的质量,g。
蛋白质得率(X,%)按以下公式计算。
式中:N1 为酶解底物中蛋白质固体总氮,g/100 g;N2 为酶解上清液的含氮量,g/100 g。
1.3.10 蛋白质水解度测定
采用pH-stat 法,参考文献[20-21]的方法进行试验,水解度(D,%)的计算公式如下。
式中:B 为碱液的体积,mL;Mb 为碱液的浓度,mol/mL;α 为α-氨基的解离度;MP 为底物中蛋白质的总质量,g;htot 为原料蛋白中肽键数,mmol/g,小麦面筋蛋白htot=8.38 mmol/g[22]。
试验均重复3 次,数据以平均值的形式展示;使用Origin 9.0 软件绘制图形,SPSS 26.0 软件进行数据分析。
不同蛋白酶对蛋白质得率的影响见图1。
图1 不同蛋白酶对蛋白质得率的影响
Fig.1 Effects of different proteases on the protein yield
由图1 可知,在酶活条件一致的情况下,碱性蛋白酶的蛋白质得率为最高,达59.05%;中性蛋白酶的蛋白质得率次之,为56.18%;谷氨酰胺酶和木瓜蛋白酶的蛋白质得率相对较低,分别为53.32% 和51.38%。谷氨酰胺酶因其酶活力相对较低,所以酶添加量较高,而蛋白酶本身也是由蛋白质组成,较大的酶添加量可能会对蛋白质得率造成一定的干扰,导致蛋白质得率偏高。另外,谷氨酰胺酶价格较其他酶也更为昂贵。而木瓜蛋白酶酶解小麦面筋蛋白得率较低[23]。综合考虑蛋白质得率和成本因素,选择碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行后续单因素试验。
2.2.1 底物浓度对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
不同底物浓度对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响见图2。
图2 不同底物浓度对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
Fig.2 Effects of substrate concentration on alkaline protease hydrolysis of wheat gluten
由图2 可知,蛋白质得率在底物浓度4%~10%时随着底物浓度的增大而增大,而在底物浓度10%~14%时趋于平缓。这可能是由于在低底物浓度条件下,反应体系中的酶分子和底物分子数量较少,在溶液中相互碰撞并形成酶-底物复合物的几率小,导致酶解效率低,蛋白质得率较低[24]。而当底物浓度较高时,溶液的流动性会变差,且由于体系内酶解的中间产物过多,限制了蛋白质的水解[25]。因此选择底物浓度为6%、8%、10%进行正交试验。
2.2.2 酶添加量对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
酶添加量对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响见图3。
图3 不同酶添加量对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
Fig.3 Effects of enzyme addition on alkaline protease hydrolysis of wheat gluten
由图3 可以看出,在酶添加量2 000~8 000 U/g时,酶的水解作用逐步随着酶添加量的增大而增大,蛋白质得率上升,但当酶添加量大于8 000 U/g 后无明显上升趋势,这说明在当前底物浓度下,酶解反应在酶添加量8 000 U/g 时已达到饱和状态[26]。因此选择酶添加量为6 000、8 000、10 000 U/g 进行正交试验。
2.2.3 酶解温度对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
酶解温度对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响见图4。
图4 不同酶解温度对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
Fig.4 Effect of temperature on alkaline protease hydrolysis of wheat gluten
如图4 可知,酶解温度在40~60 ℃范围内,温度升高蛋白质得率也随之增大,且在60 ℃达到最高点,随后呈现下降趋势。这是由于温度一方面会提高酶促反应速度,但是温度过高会引起蛋白酶次级键的解离,使蛋白酶活性丧失或催化活性部分丧失,使得蛋白质得率下降[27]。因此选择酶解温度为50、55、60 ℃进行正交试验。
2.2.4 酶解pH 值对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
酶解pH 值对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响见图5。
图5 不同酶解pH 值对碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
Fig.5 Effect of pH on alkaline protease hydrolysis of wheat gluten
pH 值会影响蛋白质的稳定性,蛋白酶的最适pH值与底物种类和酶的等电点有关,过酸或过碱的环境都会导致酶结构的变化,从而影响酶解效率[28]。如图5 所示,当pH 值在6.5~8.0 时,随着pH 值逐渐增大,碱性蛋白酶的酶解效果越来越好,蛋白质得率也逐渐增大。当pH 值继续增加至8.0 后,蛋白质得率下降,这说明碱性蛋白酶相对于小麦面筋蛋白的最适pH 值为8.0。因此选择pH 值为7.0、7.5、8.0 进行正交试验。
2.3.1 底物浓度对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
不同底物浓度对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响见图6。
图6 不同底物浓度对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
Fig.6 Effect of substrate concentration on neutral protease hydrolysis of wheat gluten
如图6 所示,蛋白质得率随底物浓度的增加呈现先增大后下降的趋势。蛋白质得率在底物浓度为10%条件下达到峰值62.12%。由此可见,底物浓度过大会导致小麦面筋蛋白结团,不利于酶解反应的进行[29]。因此选择底物浓度为8%、10%、12%进行正交试验。
2.3.2 酶添加量对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
酶添加量对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响见图7。
图7 不同酶添加量对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
Fig.7 Effect of enzyme addition on neutral protease hydrolysis of wheat gluten
由图7 可以看出,在酶添加量2 000~8 000 U/g时,酶的水解作用逐步随着酶添加量的增大而增大,蛋白质得率上升,在8 000 U/g 后蛋白质得率呈下降趋势,该现象说明酶解反应已经到达峰值,因此选择酶添加量为6 000、8 000、10 000 U/g 进行正交试验。
2.3.3 酶解温度对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
酶解温度对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响见图8。
图8 不同酶解温度对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
Fig.8 Effect of temperature on neutral protease hydrolysis of wheat gluten
如图8 所示,在酶解温度为40~55 ℃时,随着温度的升高,蛋白质得率也随之增大,在55 ℃达到最高点,随后呈现明显的下降趋势。这种现象可能是由于酶对温度较为敏感,高温会抑制酶的活性[30],因此选择酶解温度为45、50、55 ℃进行正交试验。
2.3.4 酶解pH 值对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
酶解pH 值对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响见图9。
图9 不同酶解pH 值对中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的影响
Fig.9 Effect of pH on neutral protease hydrolysis of wheat gluten
如图9 所示,当pH 值为6.0~7.0 时,随着pH 值逐渐增大,中性蛋白酶的酶解效果越来越好,蛋白质得率也逐渐增大,当pH 值为6.5~7.5 时,蛋白质得率较高,之后随着pH 值继续增加,蛋白质得率减小,这可能是较高的pH 值会抑制酶的活性[31]。因此选择pH 值为6.5、7.0、7.5 进行正交试验。
2.4.1 碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白正交试验结果分析
根据碱性蛋白酶单因素试验结果,以蛋白质得率为指标,对酶添加量、酶解温度、底物浓度、酶解pH 值4 个因素进行正交试验,正交试验结果见表6。
表6 碱性蛋白酶L9(34)正交试验结果
Table 6 L9(34) orthogonal test results of alkaline protease hydrolysis
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 A 酶添加量1 1 1 2 2 2 3 3 3 B 酶解温度1 2 3 1 2 3 1 2 3 C 底物浓度1 2 3 2 3 1 3 1 2 D 酶解pH 值1 2 3 3 1 2 2 3 1蛋白质得率/%57.85 67.62 72.34 72.77 74.16 70.63 68.66 73.12 73.39
续表6 碱性蛋白酶L9(34)正交试验结果
Continue table 6 L9(34) orthogonal test results of alkaline protease hydrolysis
试验号k1 k2 k3 R A 酶添加量65.94 72.52 71.72 6.58 B 酶解温度66.43 71.63 72.12 5.69 C 底物浓度67.20 71.26 71.72 4.52 D 酶解pH 值68.47 68.97 72.74 4.28蛋白质得率/%
由表6 可知,在选定的试验范围内,影响碱性蛋白酶制备小麦肽的因素主次顺序为A>B>C>D,即酶添加量>酶解温度>底物浓度>酶解pH 值,酶添加量影响最明显。优化的最佳条件为A2B3C3D3,即最佳酶添加量8 000 U/g、酶解温度60 ℃、底物浓度10%、酶解pH 值为8.0,经过验证按此条件得到的蛋白质得率较高,为76.87%。
2.4.2 中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白正交试验结果分析
根据中性蛋白酶单因素试验结果,以蛋白质得率为评价指标,对酶添加量、酶解温度、底物浓度、酶解pH 值4 个因素进行正交试验,正交试验结果见表7。
表7 中性蛋白酶L9(34)正交试验结果
Table 7 L9(34) orthogonal analysis of neutral protease hydrolysis
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R A'酶添加量1 1 1 2 2 2 3 3 3 59.34 66.26 64.32 6.92 B'酶解温度1 2 3 1 2 3 1 2 3 63.20 62.45 64.27 1.83 C'底物浓度1 2 3 2 3 1 3 1 2 62.55 64.42 62.95 1.88 D'酶解pH 值1 2 3 3 1 2 2 3 1 61.63 64.31 63.98 2.67蛋白质得率/%56.80 60.60 60.62 67.94 63.37 67.47 64.85 63.37 64.73
由表7 可知,在选定的试验范围内,影响中性蛋白酶制备小麦肽的因素主次顺序为A'>D'>C'>B',即酶添加量>酶解pH 值>底物浓度>酶解温度,酶添加量影响最显著。优化的最佳条件为A2'B3'C2'D2',即酶添加量8 000 U/g、酶解温度55 ℃、底物浓度10%、酶解pH 值为7.0,按此条件得到的蛋白质得率为70.20%。
2.4.3 分步酶解时间的确定
为确定双酶分步酶解过程中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的最佳酶解时间,考察两种蛋白酶在0~5 h 内的水解曲线,结果见图10 和图11。
图10 碱性蛋白酶水解度曲线
Fig.10 Hydrolysis degree curve of alkaline protease
图11 中性蛋白酶水解度曲线
Fig.11 Hydrolysis degree curve of neutral protease
如图10 所示,前1 h 碱性蛋白酶水解度逐渐增大且反应速度较快,酶解开始后2 h 水解进程逐渐放缓但反应继续进行,3 h 后反应逐渐减缓。
如图11 所示,中性蛋白酶的水解度在前1 h 内,呈明显上升趋势,1~2 h 水解度缓慢上升,3 h 以后水解度变化不明显。这可能是由于反应后期,与酶作用的位点逐渐减少[32]。因此后续碱性蛋白酶和中性蛋白酶的分步酶解时间设置为1~2 h。
2.4.4 分步酶解顺序对蛋白质得率的影响
不同酶解顺序对蛋白质得率的影响如图12 所示。
图12 不同酶解顺序对蛋白质得率的影响
Fig.12 Effects of different enzymatic hydrolysis sequences on the protein yield
1 表示第一步添加碱性蛋白酶酶解,第二步添加中性蛋白酶酶解;2 表示第一步添加中性蛋白酶酶解,第二步添加碱性蛋白酶酶解。
由图12 可知,酶解顺序对蛋白质得率存在一定的影响,在分步酶解过程中,先添加中性蛋白酶的试验组比先添加碱性蛋白酶的试验组蛋白质得率更高,这可能是由于酶的酶切位点不同。因此后续选择2 号试验顺序进行正交试验,即第一步添加中性蛋白酶酶解,第二步添加碱性蛋白酶酶解。
2.4.5 双酶分步酶解正交试验结果分析
在底物浓度为10%、酶解pH 值为7.0、酶解温度为55 ℃的条件下加入中性蛋白酶酶解,酶解结束后灭酶10 min,冷却至室温后调整溶液pH 值为8.0,酶解温度为60 ℃的条件下加入碱性蛋白酶酶解,测定酶解液的蛋白质得率,结果如表8 所示。
表8 双酶分步酶解L9(34)正交试验结果
Table 8 L9(34) orthogonal test results of two-step enzymatic hydrolysis
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R A″第一步酶添加量1 1 1 2 2 2 3 3 3 85.08 85.74 83.83 1.91 B″第一步酶解时间1 2 3 1 2 3 1 2 3 85.85 86.08 82.72 3.37 C″第二步酶添加量1 2 3 2 3 1 3 1 2 83.09 86.30 85.25 3.21 D″第二步酶解时间1 2 3 3 1 2 2 3 1 84.89 85.96 83.80 2.16蛋白质得率/%84.26 88.77 82.20 87.04 87.32 82.86 86.24 82.16 83.09
由表8 可知,通过正交试验的极差分析可以看出各因素对蛋白质得率影响的主次为B″(第一步酶解时间)>C″(第二步酶添加量)>D″(第二步酶解时间)>A″(第一步酶添加量),即中性蛋白酶酶解作用时间对结果影响最为显著。在正交试验中,实际优方案为A1″B2″C2″D2″,在该条件下蛋白质得率为88.77%。然而,根据正交结果分析得出的计算优方案为A2″B2″C2″D2″,未在正交表中。为了进一步得到最优酶解工艺,需要进行计算优方案的验证试验。
根据正交试验结果,得到理论最优酶解条件:以底物浓度为10%,在pH 值为7.0、55 ℃的条件下加入8 000 U/g 中性蛋白酶酶解1.5 h,灭酶10 min,待酶解液冷却至室温后调整pH 值为8.0,在60 ℃的温度下,加入8 000 U/g 碱性蛋白酶继续酶解1.5 h。在该条件下进行3 次验证试验,所得酶解液的蛋白质得率分别为90.61%、90.49%、90.85%,平均蛋白质得率为90.65%,表明该工艺能够进一步提升酶解效果,且具有较高的稳定性。
本研究以蛋白质得率为指标,主要对比了不同蛋白酶对小麦面筋蛋白的影响,其中碱性蛋白酶和中性蛋白酶蛋白质得率较高,为进一步提升蛋白质的溶解度,选择碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行分步酶解试验。首先以蛋白质得率为指标,分别研究底物浓度、酶添加量、酶解温度、酶解pH 值对两种酶酶解效果的影响,从而针对双酶酶解顺序、酶添加量和酶解时间进行了工艺优化。综合结果,得到分步酶解小麦面筋蛋白的优化工艺方案:第一步为中性蛋白酶酶解,pH 值为7.0、酶添加量8 000 U/g、底物浓度10%、酶解温度55 ℃、酶解时间1.5 h;在第一步的基础上进而用碱性蛋白酶酶解,调节pH 值至8.0、酶添加量8 000 U/g、酶解温度60 ℃、酶解时间1.5 h。在此条件得到酶解液的蛋白质得率均在90%以上,较单酶酶解工艺有明显提高。
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