鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus HN001，LR）是一种功能性极强的益生菌，具有抑制有害菌生长、抑制肿瘤和抗氧化等能力[1-2]。LR 在食品的生产、保存及消费环节中，容易因外界环境条件的改变而导致其生物活性下降。因此，如何保证靶向输送LR 的活性及存活率，一直是研究的重点[3]。当前，微胶囊包埋法是益生菌负载的主要手段，然而在实际应用中，往往需要多层包埋才能有效保护益生菌免受破坏[4]。水凝胶因其独特的三维网络结构、良好的生物相容性、可降解性以及结构可调控性，在活性物质的递送领域得到了广泛应用[5-6]。特别是物理交联水凝胶，其通过离子、蛋白质或氢键等非化学交联方式形成，制备过程中无需使用交联剂，具有较高的安全性，且交联网络具备可逆性[7]。这种水凝胶的三维网状结构及其溶胀特性，能够促进益生菌与外界营养物质的交换，从而有利于益生菌的存活和增殖[8]。因此，利用物理交联水凝胶的溶胀特性来负载益生菌，有望成为一种新的益生菌负载方法，并开辟新的研究方向。
多糖是物理交联水凝胶常见的基质成分之一[9]。壳聚糖（chitosan，CS）作为自然界中目前唯一天然存在的阳离子多糖，其分子结构中富含游离氨基，展现出优越的生物相容性、可降解性、抗菌活性以及成膜性能等独特优势，但因其不溶于水、碱以及一般有机溶剂，制作水凝胶时，常需将其改性应用[10]。透明质酸钠（sodium hyaluronate，SH）是一种天然存在的高分子聚合物，具备优异的生物相容性，并具有抗衰老、抗炎症以及保湿润滑等多种功能[11]。在酸性条件下，CS 分子链上的氨基易于电离，使其携带大量正电荷，而SH 表面含有羧基，能够与电离后的CS 通过氢键相互作用结合，从而形成物理交联的水凝胶结构[12]。并且SH 分子链上富含大量羟基，其表现出极强的亲水特性，因此是制作水凝胶的理想材料[13]。
为构建具有较高溶胀度、机械强度及良好荷载LR能力的CS-SH 交联水凝胶，本文研究CS 浓度、醋酸（acetic acid，HAc）浓度、SH 浓度对水凝胶硬度和溶胀度的影响，由单因素试验筛选出极显著因素区间，设计优化水凝胶制备工艺的响应面试验，通过评测凝胶质构特性、微观结构及载菌性能等，探究材料间互作机制及影响荷载性能的因素，以期为CS-SH 物理交联水凝胶的制备及其在荷载益生菌方面的应用提供一定的理论依据和实践指导。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
SH（97 kDa）：华熙生物科技股份有限公司；CS（脱乙酰度85%，分子质量100 kDa）：上海爱纯生物科技有限公司；HAc、氯化钠（均为分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；LR 菌粉：西安荣甄生物有限公司；MRS 肉汤培养基、MRS 琼脂培养基：青岛海博生物技术有限公司。
TMS 2000 型质构仪：北京微讯超技仪器技术有限公司；Miniflex 600 X 射线衍射（X-ray diffraction，XRD）仪：日本Rigaku 公司；Nicolet iS20 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）仪、Quanta 250 型扫描电子显微镜：美国赛默飞世尔科技公司。
1.2 试验方法
1.2.1 CS-SH 水凝胶的制备
参考Maiz-Fernández 等[14]的方法制备水凝胶并稍作修改。以浓度0.5% HAc 溶液和去离子水分别配制1.50、2.00 g/100 mL CS 溶液和 SH 溶液，冷藏过夜。将CS 溶液以体积比1∶1 加入SH 溶液中，混匀静置1 h，离心（2 000 r/min，15 min）后弃上清液，得到CS-SH 水凝胶。
1.2.2 水凝胶制备工艺优化
1.2.2.1 单因素试验
以水凝胶的硬度和溶胀度为指标，考察CS 溶液浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 mL，SH 溶液浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/100 mL，HAc 浓度分别为0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25% 时对水凝胶特性的影响，确定各因素最佳水平。
1.2.2.2 水凝胶构建响应面试验设计
根据Box-Behnken 试验设计原理，选取单因素试验极显著因素，以水凝胶的硬度和溶胀度为响应值，对CS浓度、SH 浓度、HAc 浓度进行三因素三水平的响应面试验，以确定水凝胶最佳构建条件。因素水平见表1。
表1 响应面因素水平
Table 1 Factors and levels of respond surface
水平-1 0 1 A CS 浓度/（g/100 mL）1.0 1.5 2.0 B SH 浓度/（g/100 mL）1.0 2.0 3.0 C HAc 浓度/%0.25 0.50 0.75
1.2.2.3 质构性能测定
参考冯传兴等[15]方法，将湿凝胶表面处理平滑，用质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）模式测定凝胶的硬度、弹性、内聚性、胶黏性以及回弹性。TPA测试条件：P/75 探头，测试速率及测后速率1 mm/s，压缩程度5 mm，停留时间5 s。
1.2.2.4 溶胀度测定
参考行云逸等[16]的方法并稍作修改，将冻干后水凝胶置于37 ℃蒸馏水中12 h 以上，使其溶胀至恒重，滤纸吸干水分后称质量，按下列公式计算水凝胶溶胀度（X，%）。
式中：M1 为冻干后水凝胶质量，g；M2 为溶胀平衡时水凝胶的质量，g。
1.2.3 水凝胶微观结构表征
1.2.3.1 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）分析
采用扫描电子显微镜观察样品纵截面形貌，加速电压5 kV。
1.2.3.2 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）扫描分析
将样品与溴化钾粉末以质量比1∶100 混合，研磨均匀，真空条件下压成透明薄片，装入压片夹，以溴化钾空白压片作对照在4 000～400 cm-1波长范围内扫描。
1.2.3.3 X 射线衍射（XRD）测试
参考陈炫宏[17]的方法，将样品置于15 mm×20 mm×1.5 mm 铝孔中压紧。XRD 测试条件：扫描范围20～80°；扫描速度5 °/min；测角精度（2θ）≤±0.01°；角分辨率（半峰全宽）≤±0.1；角度重现性±0.000 1°。
1.2.4 LR 荷载量及荷载率
参考Antich 等[18]的方法并稍作修改，将冻干水凝胶放入对数生长期LR 菌液中，以等量菌液为空白对照，振荡培养12 h，用平板涂布法测定菌液的菌落总数，荷载后的菌液菌落总数记为X1，空白对照组的菌液菌落总数记为X2，荷载量[P， lg（CFU/mL）]及荷载率（B，%）的公式如下。
1.3 数据处理
每个试验重复3 次，结果均表示为平均值±标准差，采用Design Expert 13 软件进行响应面试验设计，并用SPSS 19.0 进行方差和显著性分析，Origin 8.5 作图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 CS 浓度对水凝胶的影响
CS 浓度对水凝胶硬度和溶胀度的影响见图1。
图1 CS 浓度对水凝胶硬度和溶胀度的影响
Fig.1 Influence of CS concentration on hydrogel hardness and swelling degree
不同大写字母表示硬度差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示溶胀度差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，随CS 浓度增加，CS-SH 硬度整体先增加后减小，溶胀度先减小后增大，CS 浓度为1.0 g/100 mL时，溶胀度最小，为278.90%，硬度最大，为4 520.73 g，这是由于随CS 浓度增加，水凝胶内部交联度增大，分子之间交联结构紧密，导致水凝胶的三维网状结构孔隙度减少，可吸收的水分含量降低，从而导致硬度增大，溶胀度减小。但是随着交联度增加，导致凝胶脆性增大，水凝胶三维网状结构变薄，孔隙度增加，从而导致硬度减小，溶胀度增加，该结果与田晓康[19]的研究结果相似。综上，考虑材料及成本问题，选择CS 浓度为1.0、1.5、2.0 g/100 mL 进行后续响应面试验。
2.1.2 SH 浓度对水凝胶的影响
SH 浓度对水凝胶硬度和溶胀度的影响见图2。
图2 SH 浓度对水凝胶硬度和溶胀度的影响
Fig.2 Influence of SH concentration on hydrogel hardness and swelling degree
不同大写字母表示硬度差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示溶胀度差异显著（P＜0.05）。
由图2 可知，随着SH 浓度增加，CS-SH 水凝胶的硬度先增加后减小，溶胀度先减小后缓慢增加，在SH浓度为1.0 g/100 mL 时，硬度最小，为257.25 g，溶胀度最大，为1 358.53%，此时水凝胶极易破裂；在SH 浓度为3.0 g/100 mL 时，硬度最大，为4 100.05 g，溶胀度最小，为217.68%。这可能是由于聚合物浓度越高，溶液中水的含量越低，导致网络更紧密和封闭，从而导致孔隙大小和膨胀能力下降。综合考虑，选择SH 浓度为1.0、2.0、3.0 g/100 mL 进行后续响应面试验。
2.1.3 HAc 浓度对水凝胶的影响
HAc 浓度对水凝胶硬度和溶胀度的影响见图3。
图3 HAc 浓度对水凝胶硬度和溶胀度的影响
Fig.3 Influence of acetic acid concentration on hydrogel hardness and swelling degree
不同大写字母表示硬度差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示溶胀度差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，随着HAc 浓度的增加，CS-SH 水凝胶的硬度整体减小，溶胀度整体先增加后减少，在HAc浓度为0.25% 时，硬度最大，为8 881.34 g，溶胀度最小，为288.67%。这可能是由于随着HAc 浓度的增加，CS 的氨基电离程度增加，质子化的氨基数量增加，带正电荷的CS 数量增加，导致CS 与SH 之间的静电相互作用增强，从而水凝胶交联度增加，导致其脆性增加，硬度显著减少，溶胀度显著增加。随着HAc 浓度的增加，硬度的变化不明显，溶胀度稍降低后趋于平稳，表明HAc 浓度达到0.50%后，CS 的氨基电离程度已达到最大，氨基交联度已达到峰值。综合考虑，选择HAc 浓度为0.25%、0.50%、0.75%进行后续试验。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 试验设计及结果
根据单因素试验结果，采用Box-Behnken 响应面法设计试验，试验设计方案及结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface test design and results
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 A CS 浓度-1 1-1 1-1 1-1 1 0 B SH 浓度-1-1 1 1 0 0 0 0-1 C HAc 浓度0 0 0 0-1-1 1 1-1硬度/g 658.57 265.36 2 726.10 2 920.58 3 417.10 3 708.97 2 061.44 1 210.59 1 420.18溶胀度/%1 043.64 1 691.91 225.05 339.78 232.14 239.52 237.50 792.86 725.00
续表2 响应面试验设计及结果
Continue table 2 Response surface test design and results
试验号10 11 12 13 14 15 16 17 A CS 浓度0 0 0 0 0 0 0 0 B SH 浓度1-1 1 0 0 0 0 0 C HAc 浓度-1 1 1 0 0 0 0 0硬度/g 4130.50 220.15 2 295.84 2 248.57 2 380.68 2 418.72 2 218.53 2 535.57溶胀度/%277.33 1 746.43 233.57 377.63 340.05 314.00 305.77 406.73
对表2 数据进行二次多元回归拟合分析，得响应值与自变量方程：硬度（Y1）=-1 459.68+1 175.03A+3 666.38B-3 651.95C+293.85AB-2 285.44AC-634.63BC-269.81A2-650.31B2+4 905.01C2；溶胀度（Y2）=1 521.68-320.10A-1 276.33B+1 677.37C-266.77AB+1 065.19AC-1 065.19BC+212.36A2+423.17B2-422.75C2。方程的决定性R2 分别为0.991 7 和0.989 8，说明回归方程的拟合度较好，该模型能解释99.17%和98.98%的响应值变化，表明预测结果与实际结果有着较好的一致性。对实际试验结果方差分析结果见表3、表4。
表3 硬度二次回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of quadratic regression equation for hardness
注：**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源模型A CS 浓度B SH 浓度C HAc 浓度AB AC BC A²B²C²残差失拟项误差项总变异平方和2.00×107 71 764.01 1.13×107 5.93×106 86 346.36 3.27×105 1.01×105 19 157.48 1.78×106 3.96×105 23 967.22 33 546.49 16 782.77 71 764.01自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方2.22×106 71 764.01 1.13×107 5.93×106 86 346.36 3.27×105 1.01×105 19 157.48 1.78×106 3.96×105 23 967.22 33 546.49 16 782.77 F 值92.46 2.99 471.56 247.5 3.6 13.62 4.2 0.799 3 74.29 16.51 2 P 值＜0.000 1**0.127 2＜0.000 1**＜0.000 1**0.099 5 0.007 8**0.079 6 0.401 0＜0.000 1**0.004 8**0.256 5
表4 溶胀度二次回归方程方差分析
Table 4 Analysis of variance of quadratic regression equation for swelling degree
方差来源模型A CS 浓度B SH 浓度C HAc 浓度AB平方和6.86×106 3.91×105 3.79×106 5.25×105 1.27×105自由度9 1 1 1 1均方7.62×105 3.91×105 3.79×106 5.25×105 1.27×105 F 值75.35 38.64 375.17 51.89 12.52 P 值＜0.000 1**0.000 4**＜0.000 1**0.000 2**0.009 5**
续表4 溶胀度二次回归方程方差分析
Continue table 4 Analysis of variance of quadratic regression equation for swelling degree
注： **表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源AC BC A²B²C²残差失拟项误差项总变异平方和1.34×105 5.04×105 21 097.91 1.34×106 5 225.50 70 764.32 57 739.60 13 024.72 6.93×106自由度1 1 1 1 1 7 3 4 16均方1.34×105 5.04×105 21 097.91 1.34×106 5 225.50 10 109.19 19 246.53 3 256.18 F 值13.2 49.88 2.09 132.59 0.516 9 5.91 P 值0.008 4**0.000 2**0.191 8＜0.000 1**0.495 5 0.059 5
由表3、表4 可知，Y1 和Y2 方程回归模型达到极显著水平（P＜0.000 1）；模型复合相关系数R2Adj 为0.980 9和0.976 6，表明试验结果有98.09%和97.66%受试验因素影响；二者失拟项P＞0.05，说明试验无失拟因素存在，回归模型有效，可靠性高。响应值为硬度的模型，B、C 对Y1 影响极显著（P＜0.01），而A 的影响不显著（P＞0.05）；响应值为溶胀度的模型，各响应因素影响程度依次为B＞C＞A，各因素的影响均为极显著（P＜0.01），其中SH 浓度（B）对水凝胶溶胀度的影响最大。
2.2.2 各因素交互作用分析
利用Design Expert 13 软件绘制各因素与响应值之间的三维曲面图，结果见图4。曲面越陡峭、等高线越密集，则两因素之间的交互作用对响应值的影响越大。
图4 各因素交互作用对水凝胶硬度和溶胀度的影响
Fig.4 Influence of interaction of various factors on hardness and swelling degree of hydrogel
2.2.3 验证试验
根据所得到的响应面模型，通过Design Expert 13软件分析可得到水凝胶的最佳构建条件为CS 浓度1.645 g/100 mL、SH 浓度1.646 g/100 mL、HAc 浓度0.75%，此时预测的水凝胶硬度为1 228.72 g，溶胀度为1 267.35%。考虑到实际可操作性，上述工艺参数调整为CS 浓度1.60 g/100 mL、SH 浓度1.60 g/100 mL、HAc 浓度0.75%，在此条件下进行3 组平行试验验证，得到的水凝胶硬度为（1 160.28±82.16） g，溶胀度为（1 261.79±60.62）%，与该条件下理论预测值无显著性差异。
2.3 水凝胶的质构特性
测定响应面优化后水凝胶的质构性能，硬度为（1 160.28±82.16） g、弹性为0.63±0.01、内聚性为0.61±0.02、胶黏性为708.65±23.79、回弹性为0.21±0.03。
2.4 水凝胶的微观结构
2.4.1 SEM 观察结果
水凝胶体系微观结构结果如图5 所示。
图5 水凝胶的SEM 图
Fig.5 SEM images of hydrogels
A.未荷载LR 的水凝胶样品；B.荷载LR 的水凝胶样品。
由图5 可知，未荷载LR 水凝胶的三维网状结构均匀，孔洞较大，孔洞壁较薄，结构更脆，这可能与其高溶胀度，低硬度的特性有关。LR 在SEM 下呈杆状，水凝胶网状结构上存在LR，说明CS-SH 水凝胶成功荷载LR。并且LR 分布较散，均匀分布在水凝胶的各处网状结构上。
2.4.2 FT-IR 及XRD 扫描结果
水凝胶的FT-IR 及XRD 图见图6。
图6 水凝胶的FT-IR 及XRD 图
Fig.6 FT-IR and XRD spectra of hydrogels
A. FT-IR；B. XRD。
FT-IR 常用于分析物质化学键的变化[20]。由图6A可知，水凝胶在3 727.12 cm-1 处有O—H 伸缩振动引起的弱吸收峰；3 407.76 cm-1 吸收峰为N—H 键伸缩振动，这表明CS 聚阳离子和SH 聚阴离子之间离子键形成；2 926.56 cm-1 处吸收峰为醛基C—H 伸缩振动的相关峰；1 620.40 cm-1和1 409.55 cm-1处分别为双键
（酰胺Ⅰ谱带）的对称伸缩振动区峰和羧基—COOH 的特征峰，均是SH 特征峰值[21]；1 081.90 cm-1是C—O—C伸缩振动峰，为CS 的特征峰[22]。结果表明，CS 和SH之间是通过氢键作用形成水凝胶。
XRD 技术常用于分析晶体化学物质的物相组成。不同晶体物质因其元素组成、官能团或晶体结构的差异，会在衍射光谱中表现出独特的衍射峰数量、角度位置以及相对强度等特征[23]。从图6B 可以看出，水凝胶在26.73°处有较强的特征衍射峰，之后并未有明显的衍射峰出现。
2.5 水凝胶的荷载量及荷载率
水凝胶因其独特的三维网络结构，能够有效促进与外界物质的交换，是一种理想的益生菌负载材料[24]。此外，水凝胶的负载容量和负载效率是衡量其载菌能力的关键参数。通过荷载LR 可知，水凝胶的荷载量及荷载率分别为8.76 lg（CFU/mL）和76.91%，荷载能力和王少杨等[25]报道的相当。说明在荷载益生菌方面，CS-SH 具有较好的载菌性能。
3 结论
本研究发现SH 浓度和HAc 浓度是影响水凝胶硬度和溶胀度的关键因素（P＜0.01），CS 浓度对水凝胶的溶胀度有显著性影响（P＜0.01）。响应面优化法最佳工艺条件为HAc 溶液0.75%、CS 溶液1.60 g/100 mL、SH浓度1.60 g/100 mL。此条件下水凝胶硬度（1 160.28±82.16）g，溶胀度（1 261.79± 60.62）%。响应面优化后的水凝胶载菌性能较好，荷载量及荷载率分别为8.76 lg（CFU/mL）和76.91%。本研究为荷载益生菌的物理交联水凝胶制备工艺提供了数据支持，对物理交联水凝胶的应用提供了新的思路，为其功能性应用提供了理论依据和实践指导。
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