刺梨（Rosa roxburghii Tratt）又名缫丝花、茨梨、送春归,为刺梨属蔷薇科多年生落叶小灌木,主要分布在中国西南部和中南部地区[1]。贵州省是第一个开发和利用刺梨资源的省份,也是中国刺梨分布最广、产量最高的省份,刺梨是全省重点发展的特色农产品之一。
据《本草纲目》记载,刺梨的花、果、叶、籽作为中药应用已有悠久的历史。刺梨营养价值高,鲜果中含丰富的多糖、维生素C、维生素P、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚、刺梨黄酮、刺梨三萜、多种氨基酸以及微量元素等物质[2-3],对于人体抗氧化反应、清除自由基、调节免疫功能、降血糖、降血脂和抗肿瘤等过程发挥重要作用[4-7]。
刺梨多糖（Rosa roxburghii Tratt polysaccharides,RRTP）是从刺梨果实中提取的多糖类化合物,作为大分子物质难以在胃和小肠被人体消化吸收,进入结肠后被微生物发酵利用,并产生大量的短链脂肪酸（shortchain fatty acids,SCFAs）,如乙酸、丙酸和正丁酸等[8]。目前国内外主要是针对RRTP 的功效进行研究。研究发现,RRTP 具有抗氧化活性、神经营养活性、抗疲劳活性、提高免疫力、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤活性、降血糖活性和影响肠道菌群等功效,具有极大的开发和应用潜力[9-15]。但RRTP 经胃肠道消化后产物功能方面的研究鲜见报道。因此,本研究旨在挖掘RRTP 经体外模拟胃、小肠消化和结肠厌氧发酵后产物中总糖和还原糖含量的变化,以及结肠发酵后产生的SCFAs 种类和含量,并探索各消化阶段产物的抗氧化功能,以期为刺梨多糖的推广应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
刺梨果实：中国贵州省六盘水市；SCFAs 标准品（色谱纯）、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）,ABTS]：上海麦克林生化科技股份有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid,DNS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）：北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、水杨酸、硫酸亚铁：天津市科密欧化学试剂有限公司。以上化学试剂除特别注明外均为分析纯。
低速冷冻多管离心机（TDL-5000bR）：上海安亭科学仪器厂；旋转蒸发仪（RE-52）：上海亚荣生化仪器厂；高压灭菌锅（GR85DA）：致微（厦门）仪器有限公司；磁力搅拌水浴锅（HCJ-4E）：常州朗越仪器制造有限公司；气相色谱仪（Q7890B）、DB-FATWAX UI 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司；恒温振荡摇床（TS-111B）：上海天呈试验仪器制造有限公司；笔式PH 计（PH-10）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；酶标仪（Multiskan）：上海蒲春计量仪器有限公司。
1.2 RRTP 的提取
参考文献[16]中的超声辅助酶法提取RRTP。
1.3 体外模拟胃液和小肠液的配制
参考文献[17-18]的方法配制模拟胃液和小肠液。
1.4 体外模拟RRTP 在胃液中的消化
胃液和RRTP 液（10 mg/mL）按照体积比1∶1 混匀,置于恒温振荡摇床中（37 ℃,120 r/min）进行体外模拟胃的消化。分别在消化0、2、4、6 h 时,从反应体系中取4 mL 消化液,沸水浴灭活6 min,4 000 r/min 离心10 min 后收集上清液,用于检测总糖、还原糖的含量以及产物的抗氧化功能。
1.5 体外模拟RRTP 在小肠液中的消化
将上述体外模拟胃消化6 h 后的RRTP 液用1 mol/L NaHCO3 调节pH 值至7.0,然后将小肠液和RRTP 胃消化液按照体积比10∶3 置于恒温振荡摇床中（37 ℃,120 r/min）进行体外模拟小肠消化。分别在消化时间0、2、4、6 h 时,从反应体系中取4 mL RRTP消化液沸水浴灭活6 min,4 000 r/min 离心10 min 后收集上清液,用于检测总糖、还原糖的含量以及产物的抗氧化功能。
1.6 体外模拟RRTP 在结肠的厌氧发酵
参照文献[19-20]的方法配制结肠发酵培养基。取3 名健康志愿者的粪便,要求没有任何胃肠道疾病,在过去6 个月内未服用过抗生素、益生菌或益生元。在超净台内将3 名志愿者的新鲜粪便样品混合,并按照1∶10（g/mL）的比例添加0.1 mol/L pH 值为6.8 的磷酸缓冲液稀释粪便,4 000 r/min 离心10 min 后得到粪便悬液。最终体外厌氧发酵液组成为40%结肠发酵培养基、20% RRTP 液和40%粪便液,利用密封箱和厌氧产气包自制发酵装置,于恒温振荡摇床（37 ℃,200 r/min）厌氧发酵48 h。在0、6、12、24、48 h 分别收集4 mL 发酵液放入沸水浴中6 min 灭活微生物,再次离心（4 000 r/min,10 min）,收集上清液用于检测总糖、还原糖的含量、SCFAs 种类和含量以及产物的抗氧化功能。
1.7 总糖含量的测定
采用苯酚硫酸法测定总糖含量,具体步骤参考文献[21]的方法,绘制标准曲线方程为y=0.523 1x+0.066 1（R2=0.999 5）。
1.8 还原糖含量的测定
采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid,DNS）测定还原糖含量,具体步骤参考文献[22]的方法,绘制标准曲线方程为y=0.737 6x+0.046（R2=0.999 6）。
1.9 SCFAs 种类和含量的测定
采用气相色谱法测定RRTP 结肠发酵产物中的SCFAs,色谱条件参考文献[23]方法,如表1 所示。
表1 色谱工作参数
Table 1 Chromatographic parameters
条件色谱柱检测器类型及温度色谱柱温度,进样口温度载气及流速进样量分流比升温程序工作参数DB-FATWAX UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm）氢火焰离子化检测器,250 ℃90 ℃,200 ℃氮气,17.6 mL/min 1 μL 8∶1初始温度90 ℃,持续1 min；60 ℃/min升温到170 ℃,15 ℃/min 升温到200 ℃,20 ℃/min 升温至220 ℃
标准曲线的绘制：用去离子水配制不同浓度的SCFAs 混标溶液,经0.22 μm 滤膜过滤后,按表1 条件上机测试,记录其保留时间和峰面积。以各SCFAs 的浓度（mg/mL）为横坐标,以对应峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
发酵液中SCFAs 的测定：离心（4 000 r/min,10 min）后的发酵液用0.22 μm 水相滤膜过滤,按表1条件上机检测,记录各峰保留时间和峰面积,对照SCFAs的标准曲线,计算发酵液中各SCFAs 的含量。
加标回收率的测定：在待测RRTP 发酵液中加入标准品,采用上述色谱条件进行检测,按照公式（1）计算回收率（M1,%）,按照公式（2）计算相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）。
式中：A1 为加标值峰面积；A2 为试样值峰面积；A3为标准品峰面积；R 为相对标准偏差,%；S 为标准偏差；
为平均值。
1.10 RRTP 消化产物抗氧化功能的检测
1.10.1 ·OH 清除率的检测
参考文献[24]的方法并稍作修改,在试管中加入等量的9 mmol/L H2O2、9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液及待测样品,混匀,37 ℃水浴30 min,在510 nm 下测量吸光度。按照公式（3）计算·OH 清除率（Y1,%）。
式中：Ax 为样品组的吸光度；Ao 为空白组的吸光度（以蒸馏水代替样品）；Axo 为对照组的吸光度（以蒸馏水代替H2O2）。
1.10.2 DPPH 自由基清除率的检测
参考文献[25]的方法并稍作修改,取100 μL 样品溶液和100 μL 75 μmol/L 的DPPH 溶液混合后,加入96 孔板中暗室静置30 min,用酶标仪在517 nm 处测定吸光度,记为Ax,同一操作下获得Ao 和Axo。按照公式（4）计算DPPH 自由基清除率（Y2,%）。
式中：Ax 为样品组的吸光度；Ao 为空白组的吸光度（以无水乙醇代替样品）；Axo 为对照组的吸光度（以无水乙醇代替DPPH）。
1.10.3 ABTS+自由基清除率的检测
参考文献[26]的方法并稍作修改,将等量的7 mmol/L 的ABTS 溶液与2.45 mmol/L 的过硫酸钾溶液混合后,避光静置12～16 h 作为工作液。于96 孔板中加入20 μL 样品溶液和150 μL ABTS 工作液,混匀后静置6 min,测定734 nm 处吸光度。按照公式（5）计算ABTS+自由基清除率（Y3,%）。
式中：A1 为样品溶液的吸光度；A2 为空白组的吸光度。
1.11 数据处理
所有试验数据重复3 次,结果表示为平均值±标准差,使用 SPSS 28.0 软件进行单因素方差分析,Graph-Pad Prism 10.1 软件进行作图。满足方差齐性时,两两比较采用 Student-Newman-Keuls 检验；不满足方差齐性时,两两比较采用 Dunnett’s T3 法,P<0.05 时差异显著。
2 结果与分析
2.1 RRTP 经胃和小肠消化产物中总糖和还原糖的含量
RRTP 经胃和小肠消化后总糖和还原糖的含量见表2 和表3。
表2 RRTP 经胃消化后总糖和还原糖的含量
Table 2 Total sugar and reducing sugar content of RRTP after digestion by stomach
注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05）。
消化时间/h 02 4 6总糖含量/（mg/mL）1.693±0.008a 1.559±0.006b 1.689±0.003a 1.700±0.006a还原糖含量/（mg/mL）0.845±0.041a 0.739±0.054b 0.833±0.031a 0.891±0.033a
表3 RRTP 经小肠消化后总糖和还原糖的含量
Table 3 Total sugar and reducing sugar content of RRTP after digestion by small intestine
注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05）。
消化时间/h 02 4 6总糖含量/（mg/mL）1.775±0.002a 1.635±0.005b 1.489±0.002d 1.603±0.003c还原糖含量/（mg/mL）0.786±0.049b 1.024±0.012a 1.042±0.038a 1.090±0.040a
由表2 可知,在体外模拟胃消化阶段,与0 h 相比,消化2 h 时产物中总糖和还原糖含量显著下降（P<0.05）,之后4、6 h 又上升至与0 h 无差异。由表3 可知,在体外模拟小肠消化阶段,与0 h 相比,2、4、6 h 时总糖含量显著下降（P<0.05）,还原糖含量在消化2 h时显著升高（P<0.05）,之后趋于平稳。
2.2 RRTP 经厌氧发酵产物中总糖和还原糖含量变化
RRTP 经体外模拟厌氧发酵产物中总糖和还原糖含量的变化见表4。
表4 RRTP 厌氧发酵产物中总糖和还原糖含量
Table 4 Content of total sugar and reducing sugar in anaerobic fermentation products of RRTP
注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05）。
发酵时间/h 061 2 24 48总糖含量/（mg/mL）0.908±0.006a 0.351±0.001b 0.257±0.006c 0.243±0.009d 0.210±0.008e还原糖含量/（mg/mL）0.512±0.022a 0.211±0.014b 0.121±0.008c 0.122±0.012c 0.102±0.002c
由表4 可知,与0 h 相比,RRTP 经体外模拟厌氧发酵6～48 h 时,产物中总糖含量呈显著下降的趋势（P<0.05）；还原糖含量也在发酵6、12 h 时显著下降（P<0.05）,之后趋于平稳。综上,RRTP 可以在结肠被发酵分解,被肠道微生物所利用。
2.3 气相色谱法检测RRTP 结肠厌氧发酵产物的SCFAs 种类
SCFAs 标准品和RRTP 结肠厌氧发酵产物不同发酵时间的气相色谱图见图1。
图1 SCFAs 标准品和RRTP 结肠厌氧发酵产物不同发酵时间的气相色谱图
Fig.1 Gas chromatograms of SCFAs standards and colonic anaerobic fermentation products of RRTP
A 为SCFAs 标准品气相色谱图；B～F 分别为RRTP 厌氧发酵0、6、12、24 h 和48 h 气相色谱图。1.乙酸；2.丙酸；3.异丁酸；4.正丁酸；5.异戊酸；6.正戊酸。
由图1 可知,RRTP 在体外厌氧发酵0 h 和6 h 时可以分离出乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸6 个SCFAs,其中乙酸的峰面积最大；发酵12、24 h和48 h 可以分离出乙酸、丙酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸5 个SCFAs,其中乙酸和丙酸的峰面积较大。
2.4 各SCFAs 的标准曲线
RRTP 厌氧发酵产物中分离出的6 个SCFAs 的标准曲线见表5。
表5 各SCFAs 的标准曲线
Table 5 Standard curves of SCFAs
短链脂肪酸乙酸丙酸正丁酸异丁酸正戊酸异戊酸保留时间/min 3.085±0.008 3.294±0.004 3.542±0.006 3.361±0.002 3.884±0.006 3.657±0.011标准曲线y=781.9x-3.51 y=1 412.1x+25.59 y=1 181.5x-140.04 y=1 797.7x+29.45 y=1 344.5x-184.66 y=1 376.8x-170.09相关系数（R2）0.994 1 0.993 4 0.986 5 0.993 7 0.990 4 0.976 1
由表5 可知,各SCFAs 标准曲线的R2 值均在0.9以上,故所采用的气相色谱法能较为准确地测定出RRTP 发酵产物中SCFAs 的含量。
2.5 RRTP 不同厌氧发酵时间的SCFAs 含量
由表5 中的标准曲线计算出的RRTP 组和对照组经厌氧发酵后SCFAs 的生成量见图2。其中RRTP 组的组成为40% 结肠发酵培养基+20% 多糖液+40% 粪便液；对照组的组成为40% 结肠发酵培养基+20% 蒸馏水+40%粪便液。
图2 RRTP 不同厌氧发酵时间的SCFAs 含量变化
Fig.2 Changes of SCFAs content at different time of anaerobic fermentation of RRTP
不同大写字母表示组间差异显著（P<0.05）；不同小写字母表示组内差异显著（P<0.05）。
由图2 可知,在发酵开始（0 h）时,RRTP 组和对照组中5 种SCFAs 和总SCFAs 含量均无显著变化,发酵6 h 时,RRTP 组产物中乙酸含量有所升高,至12 h 升至最高,之后下降,且在发酵6～48 h,RRTP 组的乙酸含量均显著高于对照组（P<0.05）。RRTP 组产物中丙酸含量在发酵0～12 h 逐渐升高（P<0.05）,之后趋于平稳,且在发酵6～48 h,RRTP 组的丙酸含量也均显著高于对照组（P<0.05）。发酵48 h 时,RRTP 组中正丁酸和异戊酸含量高于对照组。从产物中总SCFAs 含量来看,从发酵6 h 开始,RRTP 组总SCFAs 含量高于对照组。结果表明,与对照组相比,RRTP 经厌氧发酵后产生了乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸和异戊酸,与气相色谱的结果一致,且总SCFAs 的含量有所增加。
2.6 RRTP 厌氧发酵不同时间SCFAs 的相对含量变化
RRTP 厌氧发酵不同时间SCFAs 的相对含量见表6。
表6 RRTP 厌氧发酵不同时间的SCFAs 相对含量
Table 6 Relative content of SCFAs at different time of anaerobic fermentation of RRTP
时间/h 各SCFAs 的相对含量/%061 2 24 48乙酸39.46 49.45 44.83 31.78 28.13丙酸21.50 29.88 38.75 47.89 46.41正丁酸21.13 12.81 10.05 12.37 13.96正戊酸6.63 2.60 2.12 2.51 4.78异戊酸11.28 5.26 4.25 5.46 6.72
由表6 可知,RRTP 经厌氧发酵产生的SCFAs 中,乙酸、丙酸和正丁酸的相对含量较高；其中乙酸的相对含量随着发酵时间的延长先升高后下降,丙酸的相对含量整体上逐渐升高,而正丁酸的相对含量整体呈下降趋势。
2.7 加标回收率
各SCFAs 的加标回收率见表7。
表7 SCFAs 的加标回收率
Table 7 Spike recovery of SCFAs
短链脂肪酸乙酸丙酸正丁酸回收率/%89.42 91.38 89.44 RSD/%0.61 1.89 0.29短链脂肪酸异丁酸正戊酸异戊酸回收率/%86.63 87.73 99.15 RSD/%1.67 1.98 1.85
由表7 可知,各SCFAs 的加标回收率在86%～100%之间,R 值均低于2.0%,说明本方法测定SCFAs含量回收率较好,准确度较高。
2.8 RRTP 消化产物的抗氧化功能
RRTP 经胃、小肠消化和结肠厌氧发酵产物的自由基清除率见图3。
图3 不同消化阶段RRTP 产物的自由基清除率
Fig.3 Free radical scavenging rate of RRTP digestion products in different digestion stages
A.胃消化阶段；B.小肠消化阶段；C.结肠厌氧发酵阶段；D.各消化阶段。同一指标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图3A 可知,RRTP 产物对·OH 清除率影响最明显,消化4 h 的RRTP 产物对·OH 清除率显著高于0 h（P<0.05）,至6 h 略有下降,但仍显著高于0 h（P<0.05）；由图3B 可知,RRTP 产物对·OH 和ABTS+自由基的清除率在0～4 h 无显著变化,至6 h 时显著高于0 h（P<0.05）；由图3C 可知,RRTP 产物对DPPH 自由基清除率的影响最明显,呈现先升高又下降的趋势,12 h最高。由图3D 可知,与消化前相比,对·OH 的清除率在胃和小肠阶段显著增加（P<0.05）,至厌氧发酵阶段有所降低（P<0.05）；对DPPH 自由基的清除率在厌氧发酵阶段显著降低（P<0.05）；对ABTS+自由基的清除率在消化前、胃和小肠阶段逐渐下降（P<0.05）,但进入厌氧发酵阶段又增高（P<0.05）。
3 讨论
本研究发现,RRTP 在体外模拟胃的消化有限,主要是进入结肠进行发酵分解,符合植物多糖的特征。在体外模拟小肠消化过程中,总糖的含量整体略有下降,原因可能是模拟小肠对RRTP 进行了一定程度上的消化分解,致使总糖含量发生变化；而还原糖的含量整体上升,这与Wang 等[15]报道的RTFP-3 多糖经胃和小肠消化后还原糖含量显著增加的研究结果一致；也有研究表明,喇叭菌多糖由于糖苷键的破坏可被胃肠液降解成更小的片段[27],与本研究结果一致。Ding 等[28]和Wang 等[29]研究发现多糖经体外模拟胃液和小肠液消化后,还原糖含量无显著变化；Zhou 等[30]和Zhu 等[31]则发现他们所分离得到的多糖经体外模拟胃肠液消化后,还原糖含量显著增加。以上研究结果表明,多糖在不同消化液中的消化特征可能受多糖来源和种类的影响。
肠道微生物可以通过戊糖途径和己糖途径,将可溶性多糖分解为不同碳链长度的SCFAs[32]。SCFAs 是指碳链上碳原子数在1～6 之间的一类饱和脂肪酸,易挥发,主要是由厌氧细菌或酵母菌发酵产生的,是肠道菌群的分解产物也是其能源物质。乙酸、丙酸和正丁酸是多糖体外厌氧发酵形成的典型SCFAs。本研究发现,RRTP 经结肠厌氧发酵,产物中检测到了乙酸、丙酸和正丁酸3 种主要的SCFAs,还检测到了少量的正戊酸和异戊酸。SCFAs 能调节肠道微生物群,改变肠道微生态的多样性,发挥益生元的作用,促进益生菌的增殖,抑制有害细菌的增殖,从而起到调节肠道微生物群的平衡的作用[33]。故本部分研究结果提示了RRTP可能具有一定的益生元作用。
研究结果还发现,RRTP 经体外模拟胃、小肠消化和结肠厌氧发酵后,抗氧化能力会发生改变。在胃消化阶段,RRTP 产物对·OH 的清除率呈现先升高后下降的趋势；在小肠消化阶段,RRTP 产物对·OH 和ABTS+自由基的清除率在6 h 时升高；在结肠厌氧发酵阶段,RRTP 产物对DPPH 自由基的清除率也呈现先升高又下降的趋势。有研究结果显示,多糖在经过模拟胃肠消化后仍然具有清除DPPH 自由基的能力[34]；还有研究显示,多糖经过体外胃肠液消化后,ABTS+自由基清除能力下降了14%[35]。综上,本研究结果表明RRTP 经过体外模拟胃肠道消化后的产物具有较强的抗氧化能力。
4 结论
RRTP 经过体外模拟胃消化,总糖和还原糖含量总体上无变化；经过体外模拟小肠消化,总糖含量下降,还原糖含量上升；经过体外模拟结肠厌氧发酵,总糖和还原糖含量均显著下降,并产生了乙酸、丙酸和正丁酸等SCFAs,提示RRTP 在胃内的消化有限,主要在结肠进行厌氧发酵和分解,产生SCFAs,可能具有一定的益生元功能。
RRTP 在体外模拟胃消化阶段,其产物对·OH 的清除率呈现先升高后下降的趋势；在小肠消化阶段,RRTP 产物对·OH 和ABTS+自由基的清除率在6 h 时升高；在结肠厌氧发酵阶段,RRTP 产物对DPPH 自由基的清除率也呈现先升高后下降的趋势。表明RRTP的体外消化产物具有较强的抗氧化功能,且抗氧化功能会随着体外消化的进行而发生改变。
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