大曲是以小麦为主要原料采用生料发酵方式制成的含有多菌类的曲块[1]。大曲是曲酒生产过程中的糖化和发酵剂，酿酒行业有“曲为酒之骨”、“曲定酒型”等说法，因此，酒曲在酿酒过程中扮演着重要的角色[2]。成品大曲质量受到气候、原料、工艺、制曲环境等因素的影响[3]，而成品大曲质量的优劣会对白酒酿造中的出酒率、酒质等造成直接影响[4]。不同季节生产的大曲，其发酵性能往往不同[5]，造成差异的主要原因是曲块内在的微生物群落结构的差异。宋瑞滨等[6]对不同季节生产浓香型中高温包包曲的理化指标和微生物数量进行了分析和探讨；李尧等[7]对不同月份的凤型大曲理化指标变化情况进行了分析与讨论；蔡鹏飞等[8]分析了春夏两季成品大曲感官、理化指标、酶活力和液态发酵指标的变化；Wang 等[9]采用高通测序技术，研究了不同季节成品大曲中细菌微生物群落结构的差异；王艳等[10]采用16S rRNA 及真菌种属鉴定（internal transcribed spacer identification，ITS）高通量测序方法和非靶向代谢组学对秋夏生产的贮存期大曲进行分析。综上，目前关于不同季节大曲中微生物群落结构的差异和香味成分的差异研究具有一定的片面性，对季节影响新建曲房所产大曲的微生物群落结构和香味的认识不足。
基于此，本试验采用高通量测序技术和多元统计方法，对新建曲房春冬两季大曲的理化、微生物群落结构和香味成分进行差异分析，通过系统分析研究春冬季节对大曲生产的影响，以期为今后工厂不同季节制曲的工艺调整提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
本研究所用大曲采自某白酒企业，分别采集同一间新建曲房冬季（11 月份）生产的大曲样品A 和春季（3 月份）生产的大曲样品B 作为样品来源。取样按照五点取样法，将取得的大曲混合为一个大曲样品为该曲房的代表样品，共2 个大曲样品，编号分别为QA、QB，本研究中的大曲均以纯小麦为原料，小麦经破碎和压制成型后，在曲房经过一系列的自然发酵过程制作而成。
1.1.2 试剂
氢氧化钠、酚酞、磷酸氢二钠、柠檬酸、可溶性淀粉、三氯乙酸、硫酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；碘、碘化钾、氯化钴、重铬酸钾、铬黑T、无水葡萄糖、硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乳酸、乳酸钠、硼砂（均为分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；福林试剂、酪氨酸（均为分析纯）：北京酷来搏科技有限公司；土壤基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：美国Omega Bio-tek公司；DNA 凝胶回收试剂盒：美国Axygen 公司。
1.2 仪器与设备
FA2104N 电子天平：上海箐海有限公司；XMTD-8222 恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；UV9000 型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9053A 电热鼓风干燥箱、GHP-9080恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；MiSeq 测序仪：美国Illumina 公司；9700 型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国ABI 公司。
1.3 方法
1.3.1 大曲理化指标的测定
水分含量、酸度、糖化力、发酵力的测定参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》。
1.3.2 大曲样品微生物菌群多样性分析
参照DNA 提取试剂盒说明书提取大曲样品基因组DNA，提取的基因组DNA 产物用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度法进行质量和浓度检测。质检合格的样本进行高通量测序，ITS 采用ITS3-ITS4 通用引物，即5´-GCATCGATGAAGAACGCAG-3´，5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´扩增真菌ITS rDNA 的ITS2 区；16S采 用338F（5´-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3´）和806R（5´-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3´）扩增16S V3-V4 区域，使用Illumina Miseq 高通量测序平台进行PE300 Paired-end 测序。
下机数据使用iTools Fqtools fqcheck （v.0.25）进行质控，采用cutadapt （v.2.6）去除接头与引物，并采用readfq （v1.0）进 一 步 过 滤 获 得Clean Data。采 用FLASH（v1.2.11）进行Tags 拼接。利用软件 QIIME2中的 DADA2（divisive amplicon denoising algorithm）方法去噪，获得不同扩增子序列变异（amplicon sequence variants，ASVs）序列，使用 Unite 数据库对 ASVs 代表序列进行物种类别注释，进而得到特征表（Feature）。采用R 语言进行Alpha 多样性、Beta 多样性和物种聚类等分析。以上过程在武汉华大基因科技有限公司完成。
1.3.3 挥发性成分分析方法
1.3.3.1 大曲前处理方法
称取5 g 曲粉放入50 mL 离心管中，加20 mL 超纯水，漩涡振荡5 min 混匀，冰浴超声30 min，4 ℃过夜，5 000 r/min、4 ℃离心10 min。预先在顶空瓶中加入1.5 g NaCl，吸取5 mL 上清液置于顶空瓶中，再加入10 μL 薄荷醇作为内标。
1.3.3.2 大曲气相色谱质谱检测方法
采用顶空固相微萃取气相色谱-质谱检测大曲的挥发性化合物。7890A-5975C 配备DB-Wax 毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）作为色谱柱。将5 mL 大曲浸泡液和10 μL 内标（薄荷醇）准确添加到顶空瓶中，挥发性化合物使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头在50 ℃下萃取40 min，然后，在230 ℃下脱附5 min。气相色谱条件：进样口温度230 ℃；载气高纯氦（>99.999%）；流速1 mL/min。升温条件：40 ℃保持2 min，2 ℃/min 至100 ℃，4 ℃/min 至180 ℃，6 ℃/min 至230 ℃后保持15 min。
质谱条件：离子源温度230 ℃；传输线温度230 ℃；电离模式：电子电离（70 eV）；采用全扫描方式，质量采集范围（m/z）35～500。MS 库：MS Search 2.0（NIST 2011）。
1.4 数据处理
理化数据和微生物α-多样性采用IBM SPSS Statistics 20 软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），采用 Duncan 氏法比较组间差异显著性，结果用平均值±标准差表示。微生物β-多样性采用Origin 9.0 进行绘图分析。挥发性成分热图采用HemI 软件进行绘制。冗余分析图采用Canoco 5 进行绘制。
2 结果与分析
2.1 中高温大曲样品理化指标的分析
不同季节中高温大曲样品的理化指标见表1。
表1 春冬两季中高温大曲理化指标
Table 1 Physical and chemical data of middle-high temperature Daqu in spring and winter
注：同列不同字母表示存在显著性差异（P<0.05）。
组别QA QB水分含量/%14.90±0.42a 13.21±0.84b酸度/（mmol/10 g）0.93±0.07b 1.13±0.03a糖化力/[mg/（g·h）]1 128.00±64.90a 1 078.00±76.27a发酵力/[g/（100 g·72 h）]77.10±16.01a 48.97±3.18b
由表1 可知，2 种中高温大曲的水分含量、酸度和发酵力存在显著性（P<0.05）差异，糖化力无显著性差异。其中，QA 的水分含量和发酵力显著高于QB（P<0.05），酸度显著低于QB（P<0.05）。大曲水分和酸度指标在一定程度上能够反映大曲品质，是目前大曲质量评价的重要指标[11]，根据QB/T 4259—2011《浓香大曲》，浓香型白酒大曲水分含量<14.0%，而QA 水分含量>14%，或许是因为冬季气温低，大曲发酵不彻底。本研究中大曲发酵力较其它研究中的大曲发酵力低[12-13]，这可能是因为本研究中大曲取自新建曲房，因新建曲房尚不成熟，会导致大曲制作过程中发酵不彻底使理化指标出现一定的差异。大曲酸度指标在0.3～1.5 mmol/10 g 均为正常，本研究中酸度与已有研究中的中高温大曲酸度较一致[12]。综上结果表明，不同季节大曲的理化指标存在差异性，推测QA 水分含量较高的原因是冬季制曲时气温较低，导致曲块失温过快，对曲块后续升温发酵有影响。
2.2 中高温大曲微生物多样性指数分析
不同季节中高温大曲样品的α 多样性分析见表2。
表2 春冬两季中高温大曲α 多样性分析
Table 2 Alpha diversity of microorganisms in middle-high temperature Daqu in spring and winter
注：同列相同字母表示不存在显著性差异（P>0.05）。
组别QA QB 16S ITS Chao1 指数150.50±15.01a 167.38±15.08a ACE 指数151.68±11.79a 190.81±29.32a Shannon 指数2.66±0.08a 2.11±0.40a (a)Chao1 指数102.61±3.09a 111.67±15.11a ACE 指数106.24±5.11a 123.15±25.81a Shannon 指数1.63±0.54a 1.59±0.26a
由表2 可知，QB 细菌的Chao1 指数和ACE 指数高于QA，但不存在显著性差异，同时，QB 真菌的Chao1 指数和ACE 指数高于QA，但不存在显著性差异，QB 细菌和真菌的Shannon 指数低于QA，但不存在显著性差异。综上说明，QB 的微生物丰富度高于QA，微生物均匀度稍低于QA，但QA 与QB 的两项微生物α 多样性指数不存在显著性差异。大曲的α 多样性指数反映大曲微生物的物种丰富度和多样性，表明春季大曲QB 的物种丰富度更好，说明春季大曲微生物生长繁殖的更好。春冬两季中高温大曲ASVs 数目见图1。
图1 春冬两季中高温大曲ASVs 数目
Fig.1 Number of ASVs in middle-high temperature Daqu in spring and winter
由图1 可知，从大曲中共检出259 个细菌ASVs和155 个真菌ASVs，其中大曲细菌共有ASVs 是145 个，QA 特有ASVs 个数最多有69 个，QB 有45 个；真菌共有ASVs 有97 个，QA 和QB 特有ASVs 分别有22 个和36 个。应用 Illumian MiSeq 高通量测序技术对中高温大曲的细菌和真菌的物种组成进行分析，结果见图2。
图2 春冬两季中高温大曲细菌和真菌门水平组成分析
Fig.2 Bacterial and fungal community composition at the phylum level in middle-high temperature Daqu in spring and winter
由图2 可知，细菌水平共得到9 个细菌门、16 个细菌纲和99 个细菌属，真菌水平共得到3 个真菌门、10 个纲和66 个细菌属。大曲中9 个细菌门分别是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、装甲菌门（Candidatus_Saccharibacteria）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes），这与其它学者的研究结果一致[13-14]。大曲中变形菌门（57.11%）、厚壁菌门（37.44%）和蓝藻菌门（4.34%）相对丰度均大于1%，为大曲中的绝对优势细菌门，QB中变形菌门相对丰度（67.50%）高于QA（46.73%），厚壁菌门（28.41%）和蓝藻菌门（2.91%）相对丰度低于QA（46.46%和5.77%）；大曲中3 个真菌菌门是子囊菌门（Ascomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota）和担子菌门（Basidiomycota）。大曲中子囊菌门（93.11%）和毛霉菌门（6.11%）相对丰度均大于1%，为大曲中绝对优势真菌门。QB 中子囊菌门相对丰度（95.69%）大于QA（90.54%），但其毛霉菌门相对丰度（3.34%）低于QA（8.78%）。从大曲门水平的物种组成上来看，冬季大曲和春季大曲门水平优势微生物相对丰度存在一定的异质性，但种类不存在明显差异。春冬两季中高温大曲细菌和真菌属水平组成见图3。
图3 春冬两季中高温大曲细菌和真菌属水平组成
Fig.3 Bacterial and fungal community composition at the genus level in middle-high temperature Daqu in spring and winter
由图3 可知，从大曲中共得到99 个细菌属和67 个真菌属，其中核心细菌微生物（相对丰度>1%）共有13 个属，分别是Lactobacillus（乳杆菌属）、Kroppenstedtia（克罗彭斯特菌）、Weissella（魏斯氏菌）、Leuconostoc（明串珠菌）、Kosakonia（科萨克氏菌）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Lactococcus（乳球菌）、Pediococcus（片球菌属）、Serratia（沙雷氏菌）、Thermoactinomyces（高温放线菌属）；核心真菌微生物（相对丰对>1%）共有7 个属，分别是Saccharomycopsis（复膜孢酵母属）、Issaxchenkia（伊萨酵母属）、Thermoascus（嗜热子囊属）、Aspergillus（曲霉属）、Rhizopus（根霉属）、Hyphopichia（丝孢毕赤酵母属）、Candida（假丝酵母属）。
QA 和QB 大曲中在属水平上的优势细菌属种类大体相似但略有不同，且相对丰度有一定差异。2 种大曲中第一大优势细菌属均为乳杆菌属，相对丰度分别是QA（29.69%）和QB（29.04%），有研究报道，乳杆菌属作为白酒发酵过程中重要的微生物，是形成乳酸乙酯和乳酸的主要基础物质[15]，是白酒风味物质演替的推动者之一。大曲中第二大优势菌属是克罗彭斯特菌属，相对丰度分别是21.55%（QA）和14.81%（QB），该菌属在白酒发酵过程中能够促进乳酸和乙酸乙酯等物质的生成[16]，在一定程度上会影响白酒的风味。QA中魏斯氏菌属（9.43%）的相对丰度与乳杆菌属和克罗彭斯特菌属这4 个菌属的相对丰度占QA 细菌总丰度的60%以上，但QB 中魏斯氏菌属（8.15%）、乳杆菌属和克罗彭斯特菌这4 个菌属的相对丰度占QB 细菌总丰度的50%以上，当这4 种菌属占据较大优势时，其它微生物群相对丰度会较低，导致样品微生物的丰富度偏低，因此相对而言QB 菌属的丰富度更高，结合QB 的α多样性指数可知QB 的物种丰富度和物种丰度均更高。
QA 和QB 大曲中真菌微生物群落结构组成较一致，但优势菌属的相对丰度分布存在一定的异质性，2 种大曲中第一大优势真菌属均为复膜孢酵母属，相对丰度分别是45.98%（QA）和36.01%（QB），该结果与任宇婷等[16]和王清龙等[12]得出的中高温大曲中第一大优势属是嗜热子囊菌属的结果不一致，可能是由于地区的差异、制曲工艺不同等因素造成真菌多样性不同。复膜孢酵母属具有分泌α-淀粉酶、蛋白酶在内多种水解酶的能力[17]，其对大曲的酶活力具有一定的影响。QA 第二大优势真菌属是嗜热真菌属（15.49%），QB 第二大优势真菌属是伊萨酵母菌属（28.30%），QA 的伊萨酵母菌属相对丰度是13.15%，QB 中嗜热真菌属的相对丰度是18.62%，QA 和QB 中复膜孢酵母属、伊萨酵母属和嗜热真菌属的相对丰度占总丰度的74% 以上。据报道，嗜热子囊菌属多容易出现在高温大曲中，对酱香风味的形成具有重要作用[18]。伊萨酵母是大曲曲皮中主要功能菌群[19]，在白酒酿造过程中能产生各种酯类和芳香类物质[20]。
2.3 大曲的挥发性组分分析
从2 种大曲中共检出8 大类59 种挥发性成分，具体见表3。
表3 春冬两季中高温大曲挥发性成分分析
Table 3 Volatile components of middle-high temperature Daqu in spring and winter
序号含量/（mg/L）12345678分类酸类酸类酸类酸类酸类酸类酸类醇类中文名称异戊酸乙酸己酸3-甲基戊酸异丁酸辛酸2-甲基己酸苯乙醇QA 0.00 7.26 11.20 6.83 1.72 2.28 3.58 154.92 QB 40.45 20.98 9.92 0.18 4.33 3.05 0.00 244.09
续表3 春冬两季中高温大曲挥发性成分分析
Continue table 3 Volatile components of middle-high temperature Daqu in spring and winter
序号9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59分类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类醇类酯类酯类酯类酯类酯类酯类酯类酯类酯类醛类醛类醛类醛类醛类醛类醛类醛类醛类醛类醛类酮类酮类酮类酮类吡嗪类吡嗪类吡嗪类吡嗪类吡嗪类吡嗪类吡嗪类酚类酚类酚类其它类其它类中文名称异戊醇正己醇（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇2-甲基-1-丁醇2-乙基己醇1-戊醇2，3-丁二醇1-辛烯-3-醇苄醇庚醇1-辛醇S-（-）-2-甲基-1-丁醇糠醇DL-β-乙基苯乙基乙醇5-甲基-2-呋喃甲醇棕榈酸乙酯油酸乙酯正己酸乙酯十四酸乙酯辛酸乙酯α-戊基-γ-丁内酯壬酸乙酯乙酸乙酯癸酸乙酯苯甲醛异戊醛2-甲基丁醛己醛乙醛反式-2-壬烯醛3-甲基-2-丁烯醛糠醛壬醛2-吡咯甲醛2-苯基巴豆醛2-庚酮3-辛酮2，4-二羟基苯乙酮仲辛酮2，3，5-三甲基吡嗪2，3，5，6-四甲基吡嗪2，6-二甲基吡嗪2，5-二甲基吡嗪2，3-二甲基吡嗪2，3-二甲基-5-乙基吡嗪2-甲基吡嗪4-乙烯基-2-甲氧基苯酚苯酚4-乙基-2-甲氧基苯酚邻苯二甲醚1-石竹烯含量/（mg/L）QA 111.14 67.22 14.74 25.11 18.32 17.75 11.63 18.14 4.37 4.04 4.38 0.00 2.40 0.76 0.00 61.30 15.70 13.33 8.41 5.37 8.55 0.97 0.45 1.55 156.38 29.67 7.14 6.24 6.65 3.91 3.36 2.59 3.80 0.00 2.29 3.08 4.14 0.00 1.89 26.77 14.30 14.39 9.94 6.79 0.00 2.78 15.61 4.52 4.42 3.36 2.30 QB 94.07 54.47 28.84 15.26 12.23 11.37 13.79 4.30 8.37 3.53 3.08 6.62 3.99 1.82 2.03 41.30 9.15 5.67 4.04 4.09 0.00 2.51 2.27 0.67 100.52 20.02 5.52 6.22 2.77 2.10 2.47 2.73 1.44 3.31 0.52 3.60 0.42 4.28 2.17 36.92 24.92 23.58 15.53 8.90 8.00 2.74 50.16 3.29 0.00 0.00 0.00
由表3 可知，挥发性成分有异戊酸、乙酸、己酸和辛酸等7 种酸类，苯乙醇、异戊醇、正己醇和1-辛醇等16 种醇类，棕榈酸乙酯、油酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯等9 种酯类，苯甲醛、异戊醛、2-甲基丁醛和己醛等11 种醛类，2-庚酮、3-辛酮、2，4-二羟基苯乙酮和仲辛酮共4 种酮类，2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪等7 种吡嗪类，以及3 种酚类和2 种其它类。QA 中共检出53 种挥发性成分，QB 中共检出54 种挥发性成分，醇类、酯类、醛类是 2 种大曲中的主要风味成分，在 QA 和QB 大曲中的占比分别为48.41%和51.37%，12.31%和7.05%，和 23.63%和14.93%。
表3 结果显示，大曲中苯乙醇含量最高，其中QA含量为154.92 mg/L，QB 含量为244.09 mg/L，苯乙醇有新鲜的面包香、清甜的玫瑰花香，是白酒中主要的挥发性成分之一[21]；大曲中含量次高的挥发性物质是苯甲醛，QA 中含量为156.38 mg/L，QB 中含量为100.52 mg/L，苯甲醛具有杏仁味道[22]，是醛类中贡献最大的香味成分；酯类中棕榈酸乙酯含量最高，QA 中含量为61.3 mg/L，QB 中含量为41.3 mg/L，棕榈酸乙酯是高沸点酯类，对白酒香味具有一定贡献，但质量浓度超过2 mg/L 时，在低于25% vol 白酒中容易引起白酒浑浊[23]；2 种大曲中检出7 种吡嗪类物质，且三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量较高，吡嗪类物质一般都具有烘焙和坚果香[24]，目前认为吡嗪类物质是酱香型白酒的主要香味成分和功能因子[25]。
2.4 大曲理化指标与优势微生物冗余分析
对大曲中优势微生物和理化结果进行冗余分析（redundancy analysis，RDA），结果见图4。
图4 大曲理化指标和优势微生物RDA 分析
Fig.4 Redundancy analysis of physical and chemical indicators and dominant microbial groups in Daqu
由图4 可知，QA 和QB 分布于Axis1 轴左右两侧，且Aixs1 区分度为46.79%，说明冬季曲和春季曲在理化和微生物水平上能被很好的区分开。大曲水分含量和大曲中40%的优势微生物（根霉、嗜热真菌属、曲霉属、高温放线菌、芽孢杆菌和魏斯氏菌）呈正相关关系，并且大曲水分的箭头方向与样品QA1、QA2、QA3 均分布于Axis1 轴右侧，说明冬天的大曲普遍水分含量较高，这与理化数据分析结果一致。大曲发酵力与克罗彭斯特菌呈正相关关系，大曲糖化力和酸度与大曲中一半以上的优势微生物（乳杆菌、科萨克氏菌、葡萄球菌、乳球菌、明串珠菌、沙雷氏菌、丝孢毕赤酵母、复膜孢酵母菌、伊萨酵母菌属）呈正相关关系，这表明大曲中大部分优势菌属参与大曲中酸度、发酵力和糖化力的供给。
3 结论
大曲的培曲过程受季节的影响，因不同季节天气温度的差异对大曲的质量存在一定影响，从而对大曲内在的理化指标和微生物群落结构造成一定的影响。文中采用化学分析方法和高通量测序技术对新建曲房冬季和春季大曲理化指标和微生物群落结构进行解析，发现冬季和春季大曲水分、酸度和发酵力存在显著性差异，大曲的α 多样性结果表现为春季大曲的物种丰度和物种丰富度优于冬季大曲，β 多样性结果表明冬季和春季大曲细菌群都以乳杆菌和克罗彭斯特菌属为主要优势菌群，真菌群都以复膜孢酵母菌属、伊萨酵母菌属和嗜热真菌属，冬季和春季大曲微生物群落组成较一致，但相对而言春季曲微生物群落分布更均衡。利用HS-SPME-GC-MC 方法从2 种大曲中共检出8 大类59 种挥发性成分，结果发现大曲中苯乙醇含量最高，且春季曲含量高于冬季曲，苯乙醇有新鲜的面包香、清甜的玫瑰花香，是白酒中主要的挥发性成分之一。大曲冗余分析结果表明，春季曲和冬季曲可以被很好的区分开，且一半以上优势微生物与春季曲呈正相关，且与酸度、糖化力和发酵力呈正相关，以上结果均表明春季曲和冬季曲从理化、微生物群落结构和香味成分上存在差异。
本研究得到新建曲房春季曲和冬季曲理化、微生物群落结构和香味成分上存在差异，说明不同季节制曲对大曲品质会造成一定的影响，这为今后不同季节制曲的品质评价具有指导性意义。今后将进一步扩大研究范围，探讨四季曲的内在差异，为工厂不同季节制曲的工艺调整提供理论依据。
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