荷叶（Nelumbo nucifera）是莲科莲属植物莲的叶片，是兼具药食观赏价值的植物[1-2]。我国荷叶资源丰富，广泛分布于浙江、湖北等地区，常用于制作减脂、瘦身产品，但其整体利用率较低[3]。对荷叶中所含的活性成分进行分析，发现荷叶中黄酮、生物碱类化合物含量丰富[4]，此外还含有膳食纤维、纤维素、挥发油、氨基酸、矿物质、多酚等[5-6]。对荷叶的药理学研究发现其具有消炎、抑菌、调节血脂、抗氧化、抗病毒等功效[7-8]。
生物碱是一类由天然植物合成的具有碱性和生物活性的有机化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化、降糖、降血压、降血压等生物活性[9-12]。荷叶中生物碱含量丰富，研究发现荷叶生物碱能够有效调节细胞内脂质代谢[13]，抗胆管癌细胞增殖[14]，改善葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎小鼠肠道炎症反应[15]。本研究以荷叶为原料优化荷叶生物碱提取工艺，并研究荷叶生物碱的抗氧化活性，以期为荷叶的开发利用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
干燥荷叶：市售；95%乙醇：武汉市洪山中南化工试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、三氯甲烷：四川西陇化工股份有限公司；盐酸小檗碱：成都埃法生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：北京博奥拓达科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2´-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：福州飞净生物科技有限公司；硫酸亚铁：天津市致远化学试剂有限公司；氢氧化钠、浓盐酸、抗坏血酸、过硫酸钾、水杨酸：福晨（天津）化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TU-1901 型双光束紫外分光观光仪：北京普析通用仪器有限责任公司；101-2A 型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；SB25-12D 型超声波清洗器、SCIENTZ-10N 型冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；FW80 型微型高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；FA224C 型电子天平：上海力辰邦西仪器科技有限公司；L535R 型医用离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵、WB-2000 型水浴锅、DL-400 型循环冷却器：郑州长城科工贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 材料处理
选择干燥、无杂质的荷叶，采用微型高速万能粉碎机破碎，过40 目筛得荷叶粉末，置于干燥具塞玻璃瓶中备用。
1.3.2 盐酸小檗碱标准曲线的绘制
精密称量7.7 mg 盐酸小檗碱于10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至10 mL，得到0.77 mg/mL的盐酸小檗碱标准溶液。吸取盐酸小檗碱标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶液定容至10.0 mL，以甲醇溶液为空白对照在波长418 nm 处测量其吸光度。以盐酸小檗碱标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线[16]。得到回归方程y=0.013 9x-0.003，R2=0.998，在试验范围内线性关系良好。
1.3.3 荷叶生物碱的提取工艺
干燥荷叶→粉碎成粉→加入不同浓度乙醇→采用超声波辅助提取→经抽滤后取抽滤液→旋转蒸发浓缩→冷冻干燥机冷冻48 h→0.1 moL/L 盐酸溶液溶解→氯仿萃取→得荷叶生物碱。
1.3.4 荷叶生物碱得率的测定
将荷叶粉精确称取10.000 0 g，加入不同浓度的乙醇溶液浸泡30 min，超声波辅助提取一定时间。提取完成后抽滤去除滤渣、旋蒸浓缩、冷冻干燥得到荷叶生物碱提取物。称取干燥后的提取物，用0.1 moL/L 盐酸溶液进行溶解，4 000 r/min 离心10 min，用氯仿萃取2～3 次，调节pH 值至10 再次萃取1～2 次。依据1.3.2 的方法测得荷叶生物碱浓度，重复3 次取平均值，以减少试验误差。利用标准曲线及回归方程对荷叶生物碱进行测定荷叶生物碱得率（H，%）按公式（1）进行计算。
H = C × V × N/（m × 103）× 100 （1）
式中：C 为荷叶样品中生物碱的浓度，mg/mL；V 为荷叶粉溶液稀释液体积，mL；N 为稀释倍数；m 为荷叶粉质量，g。
1.3.5 荷叶生物碱提取单因素试验
准确称取干燥荷叶粉10.000 0 g，以生物碱得率为试验指标，分别考察不同的料液比[1∶20、2∶20、3∶20、4∶20、5∶20（g/mL）]、乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、超声温度（40、45、50、55、60 ℃）对荷叶生物碱得率的影响。
1.3.6 荷叶生物碱提取工艺正交试验
以荷叶生物碱得率为试验指标，选取L9（34）进行正交试验，考察料液比、乙醇浓度、超声时间、超声温度对荷叶生物碱得率的影响。正交试验因素水平见表1。
表1 正交试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
因素水平123 A 料液比/（g/mL）1∶20 2∶20 3∶20 B 乙醇浓度/%60 70 80 C 超声时间/min 30 40 50 D 超声温度/℃50 55 60
1.3.7 荷叶生物碱体外抗氧化活性测定
1.3.7.1 羟基自由基清除能力测定
取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的荷叶生物碱溶液各2 mL，加入6 mmol/L 硫酸亚铁2.0 mL、6 mmol/mL双氧水2.0 mL，混合静置10 min，再加入6 mmol/L 水杨酸2.0 mL，混合静置30 min，于510 nm 波长处测吸光度Ai。用蒸馏水代替水杨酸测吸光度Aj，对照组以2.0 mL 蒸馏水代替荷叶生物碱溶液测定吸光度A0，抗坏血酸（VC）作阳性对照[17-18]。羟基自由基清除率（Q，%）按公式（2）进行计算。
1.3.7.2 DPPH 自由基清除能力测定
取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的荷叶生物碱溶液各2 mL 于试管中，加入2.0 mL 的2 mmol/L DPPH 无水乙醇溶液，静置于暗室30 min，在517 nm 测定吸光度为Ai，抗坏血酸作为阳性对照；对照组用2.0 mL 的无水乙醇代替DPPH，测定吸光度Aj；空白组以蒸馏水代替荷叶生物碱溶液，测定吸光度为A0[19-20]。DPPH 自由基清除率（D，%）按公式（3）进行计算。
1.3.7.3 ABTS+自由基清除能力测定
取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的荷叶生物碱溶液各2 mL 于试管中，加入2 mL 的ABTS 工作液，静置于暗室反应30 min，在734 nm 测定吸光度为Ai。以抗坏血酸作为阳性对照；对照组以2 mL 的无水乙醇代替ABTS 工作液，测定吸光度Aj，空白组以蒸馏水代替荷叶生物碱溶液，测定吸光度为A0[21-22]。ABTS+自由基清除率（B，%）按公式（4）进行计算。
1.4 数据处理
所有试验均重复3 次，采用Office 2019 和SPSS 进行绘图和统计分析。
2 结果与分析
2.1 荷叶生物碱提取单因素试验
2.1.1 料液比对荷叶生物碱得率的影响
料液比对荷叶生物碱得率的影响如图1 所示。
图1 料液比对荷叶生物碱得率的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of lotus leaf alkaloids
由图1 可知，在试验范围内，随着荷叶粉末添加量的增加，荷叶生物碱得率呈先上升后下降的趋势，在料液比2∶20 （g/mL）时，荷叶生物碱得率最大，为1.03%，当料液比超过2∶20 （g/mL）时，荷叶生物碱得率逐渐下降。随着荷叶粉末添加量的逐渐增加，有效成分释放增加，荷叶生物碱得率增加；此后，随着料液比超过2∶20 （g/mL），荷叶粉末浓度过高，无法与乙醇溶液充分接触，不利于生物碱的析出，因此，荷叶生物碱得率呈下降趋势。因此，选取料液比1∶20、2∶20、3∶20 （g/mL）进行后续正交试验。
2.1.2 乙醇浓度对荷叶生物碱得率的影响
乙醇浓度对荷叶生物碱得率的影响如图2 所示。
图2 乙醇浓度对荷叶生物碱得率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of lotus leaf alkaloids
由图2 可知，乙醇浓度在50%～70%时，随着乙醇浓度的增加，荷叶生物碱得率逐渐增加，最大值为1.27%；当乙醇浓度超过70%时，荷叶生物碱得率逐渐降低。这是由于随着乙醇浓度的增加，荷叶粉末与乙醇充分接触，有利于生物碱的释放；但当乙醇浓度超过70%时，其他非生物碱杂质在乙醇中的溶解度增加，这些非生物碱物质的持续溶解，影响生物碱的释放，使得荷叶生物碱提取率降低[23]。因此，选取乙醇浓度60%、70%、80%进行后续正交试验。
2.1.3 超声温度对荷叶生物碱得率的影响
超声温度对荷叶生物碱得率的影响如图3 所示。
图3 超声温度对荷叶生物碱得率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of lotus leaf alkaloids
由图3 可知，超声温度在40～55 ℃时，随温度上升，荷叶生物碱得率逐渐增加，最大值为1.24%；当超声温度持续增加超过55 ℃时，荷叶生物碱降低。超声辅助提取能够破坏细胞壁和细胞膜，有利于细胞内容物的释放，增加活性成分的得率[24]。当超声温度逐渐升高时，分子运动增加，荷叶中有效成分的渗透、扩散和溶解液会增加，利于生物碱的溶出；当超声温度过高，荷叶生物碱的结构被破坏，降低荷叶生物碱得率。因此，选取超声温度50、55、60 ℃进行后续正交试验。
2.1.4 超声时间对荷叶生物碱得率的影响
超声时间对荷叶生物碱得率的影响如图4 所示。
图4 超声时间对荷叶生物碱得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of lotus leaf alkaloids
由图4 可知，超声时间在20～60 min 范围内，随超声时间的延长，荷叶生物碱得率呈先上升后降低的趋势。在超声时间40 min 时，荷叶生物碱得率最高，为1.32%；当超声时间超过40 min 时，荷叶生物碱得率逐渐降低。提取过程中，一定时间的超声处理，可以增加分子间相互作用，利于生物碱的提取；但是当超声时间过长，热效应和机械效应会破坏生物碱结构，同时增加非生物碱杂质的释放，使得荷叶生物碱得率降低[25]。因此，选取超声时间30、40、50 min 进行后续正交试验。
2.2 提取工艺优化正交试验
为确定荷叶生物碱提取最佳工艺条件，研究料液比、乙醇浓度、超声时间、超声温度对荷叶生物碱提取的影响，以荷叶生物碱得率为评价指标，进行L9（34）正交试验。正交试验结果见表2，方差分析见表3。
表2 提取工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal test for extraction process optimization
试验号A 料液比B 乙醇浓度C 超声时间D 超声温度12 3 4 56789 k1 111222333 123123123 123231312 123312231生物碱得率/%1.011±0.039 1.043±0.045 1.056±0.081 1.581±0.029 1.112±0.026 1.345±0.026 1.203±0.010 1.336±0.029 1.127±0.045 k2 k3R 1.037 1.346 1.222 0.309 1.265 1.164 1.176 0.101 1.231 1.250 1.124 0.127 1.083 1.197 1.324 0.241因素主次最优组合A>D>C>B A2B1C2D3
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal test results
注：**表示影响极显著（P<0.01）。
方差来源自由度F0.05 F0.01 ABCD误差平方和0.436 0.255 0.084 0.262 0.031 2 2 2 2 1 8均方0.218 0.028 0.042 0.131 0.002 F 值125.251 15.799 24.015 75.123临界值3.555 3.555 3.555 3.555临界值6.013 6.013 6.013 6.013显著性********
通过表2 中生物碱得率的极差分析结果可知，各因素对生物碱得率影响的主次顺序为料液比>超声温度>超声时间>乙醇浓度。荷叶碱最佳的提取工艺条件为A2B1C2D3，即料液比2∶20 （g/mL）、乙醇浓度60%、超声时间40 min、超声温度60 ℃，该条件荷叶生物碱提取率最高，为（1.581±0.026）%。由表3 可知，因素A、B、C、D 对荷叶生物碱得率均有极显著影响（P<0.01），对生物碱得率影响的主次顺序为A>D>C>B，即料液比>超声温度>超声时间>乙醇浓度，与直观分析结果一致。
2.3 荷叶生物碱的抗氧化活性分析
2.3.1 羟基自由基清除能力
荷叶生物碱的羟基自由基清除率如图5 所示。
图5 荷叶生物碱的羟基自由基清除率
Fig.5 Scavenging rate of lotus leaf alkaloids against hydroxyl radicals
羟基自由基是生物体内最具代表性的自由基，能够破坏生物体内蛋白质、脂质、核酸等生物大分子，从而引起生物体老化损伤，因此，羟基自由基清除能力能较好反映体外抗氧化能力。由图5 可知，荷叶生物碱和VC 对羟基自由基的清除率呈现浓度依赖性，随着生物碱浓度的增加，羟基自由基清除率增加，但荷叶生物碱对羟基自由基清除能力低于VC。结果表明荷叶生物碱具有一定清除羟基自由基的能力。
2.3.2 DPPH 自由基清除能力
荷叶生物碱的DPPH 自由基清除率如图6 所示。
图6 荷叶生物碱的DPPH 自由基清除率
Fig.6 Scavenging rate of lotus leaf alkaloids against DPPH radicals
DPPH 自由基清除能力能较好地反映被测溶液的抗氧化活性。由图6 可知，随着VC 和荷叶生物碱浓度的增加，DPPH 自由基的清除率不断地升高，但荷叶生物碱对DPPH 自由基清除能力低于VC。结果表明荷叶生物碱具有一定清除DPPH 自由基的能力。
2.3.3 ABTS+自由基清除能力
ABTS+自由基的检测是一种使用广泛的间接检测天然产物的抗氧化活性的方法。由图7 可知，VC 和荷叶生物碱对ABTS+自由基清除率随浓度的增加而增大，但是荷叶生物碱的清除率低于VC。结果表明荷叶生物碱具有一定清除ABTS+自由基的能力。
图7 荷叶生物碱的ABTS+自由基清除率
Fig.7 Scavenging rate of lotus leaf alkaloids against ABTS+radicals
3 结论
采用正交试验设计优化荷叶生物碱的提取工艺，通过体外抗氧化试验探究最优提取工艺的荷叶生物碱的抗氧化能力。结果表明荷叶生物碱的最佳提取工艺条件为料液比2∶20（g/mL）、乙醇浓度60%、超声时间40 min、超声温度60 ℃，此条件下，荷叶生物碱得率可达（1.581±0.026）%。体外抗氧化试验结果显示荷叶生物碱对羟基自由基、DPPH 自由基、ABTS+自由基有明显的清除作用，综上，荷叶生物碱具有较好的抗氧化活性。
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