肠道屏障是指肠道黏膜的一层保护层，在过滤有害物质和维持肠道健康方面起关键作用。内毒素又称脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，内毒素应激是一种导致肠道屏障功能受损的常见病理过程。研究表明，内毒素与肥胖、糖尿病等慢性代谢疾病的发生有关[1-2]，因此，提高肠道的屏障功能对维持机体健康至关重要。
肠道菌群是指生活在肠道内的微生物群落，稳定的肠道菌群可以减少有害菌对肠道的破坏，其通过产生代谢物和参与免疫调节等方式，对肠道屏障的功能和健康起重要影响[3-4]。研究发现，当肠道菌群失衡时，肠道氨氮（ammonia nitrogen，NH3-N）含量升高，导致肠道的氨基酸代谢紊乱，破坏肠道黏膜结构，进而促进内毒素的产生和吸收[5]。此外，肠道菌群还可以分解食物中的纤维，产生短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFAs），如乙酸、丙酸和丁酸等，这些SCFAs 能为肠道细胞提供能量，促进肠道黏膜的修复和再生，增强肠道屏障的完整性[6]。不同类型的菌群产生的代谢物可能不同，对肠道屏障的影响也不同。一些研究发现，富含有益菌的菌群状态与较高的乙酸和丙酸产量以及较低的氨氮含量相关，这表明这些菌群可能有利于肠道屏障的健康[7-8]。
近年研究表明，膳食多酚具有调节肠道微生物菌群和保护肠道的作用[9]。咖啡樱桃皮多酚可以通过抑制核因子κB 信号通路来减轻结肠炎症，并增加肠道有益菌的丰度[10]。苹果皮多酚能够在转录和翻译水平上促进紧密连接蛋白的表达，增强肠道屏障功能[11]，红葡萄多酚可以促进克雷伯氏菌、另枝菌属和阿克曼氏菌的增殖，同时抑制Blautia coccoides、Anaeroglobus 和拟杆菌的生长[12]。野樱莓多酚具有富集乳酸菌菌群，同时减少疣状菌菌群和毛罗杆菌属等有害菌的数量。此外，它还能逆转由LPS 损伤所致的Selenomonadales和Negativitices 两种致病菌的增加[13]。因此，多酚类化合物通过调节肠道微生物的组成和丰度，发挥多种有益的功能，对维护肠道健康起到重要作用。
猕猴桃是备受消费者喜爱的一种浆果。截至2019 年底，我国猕猴桃栽培面积达29.07 万hm2，总产量达300 万t，陕西、四川、河南、湖南、贵州等省份是我国猕猴桃的主要产区[14-15]。其中贵州以“贵长”猕猴桃为主，但猕猴桃产业的发展也带来了大量的皮渣副产物。前期研究发现，“贵长”猕猴桃皮富含多酚类化合物[16]，能提高脂膳食大鼠肠腔的抗氧化水平[17]。在此基础上，本研究以内毒素应激大鼠作为研究对象，通过苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）、杯状细胞染色、血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）含量及肠腔黏蛋白MUC1 表达量，明确猕猴桃皮多酚提取物对内毒素应激大鼠肠道屏障功能的影响，通过测定肠道氨氮值和SCFAs 含量以及肠道菌群组成的变化，探讨其可能的作用机制，为猕猴桃皮多酚作为促进肠道健康的功能因子提供理论支撑，有利于提高猕猴桃皮渣副产物的综合利用率。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂
SPF 级健康雄性SD 大鼠（体质量150～180 g）：辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号为SCXK（辽）2020-0001，该动物实验已通过贵州医科大学伦理委员会审核。
1.2 材料与试剂
猕猴桃皮：市售；二胺氧化酶试剂盒：南京建成生物工程研究所；改良Hale 胶体铁黏多糖染色液试剂盒：北京雷根生物技术有限公司；苏木素-伊红染色试剂盒、乙酸标准品（≥99.5%）、丙酸标准品（≥99.5%）、丁酸标准品（≥99.5%）：北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂盒（Trizol）、去基因组反转录试剂盒（prime script rt reagent kit with gDNA eraser，RT）、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应试剂盒（TB Green TM Premix Ex Taq TM Ⅱ）：宝日医生物技术（北京）有限公司；偏磷酸、亚硝基铁氰化钠、氯化铵、磷酸氢二钠（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；NEB Next® Ultra DNA Library Prep Kit 建库试剂盒：美国lllumina 公司。
1.3 仪器与设备
旋转蒸发仪（RE-52AA）：上海贺帆仪器有限公司；超声清洗器（KQ-500DE 型）：江苏昆山美美超声仪器有限公司；数显式电热恒温水浴锅（XMTD-204 型）：天津市泰斯特仪器公司；光学倒置显微镜（Ti2R）：日本Nikon 公司；气相色谱仪（7890B）、生物分析仪（5400）：美国安捷伦公司；可见分光光度计（721 型）：上海菁华科技仪器有限公司；荧光定量PCR 仪（ABIViiA7）：美国ABI 公司；测序仪（Novaseq booo）：美国lllumina 公司。
1.4 方法
1.4.1 猕猴桃皮多酚的提取及制备
猕猴桃皮经过烘干、粉碎后，采用前期优化的提取方法提取猕猴桃皮多酚（kiwifruit peel polyphenols extract，KPE）[18]，按料液比1∶30（g/mL） 溶于60%甲醇溶液，在60 ℃、450 W 功率下超声辅助提取20 min，将粗提液于转速3 500 r/min 离心l0 min，取上清液，上清液经旋转蒸发，调整浓度至10 mg/mL。
1.4.2 动物分组及处理方式
24 只SPF 级雄性SD 大鼠适应性喂养一周后，根据体质量随机分为对照组、脂多糖组（LPS 组）、猕猴桃皮多酚干预组（KPE-LPS 组）。KPE-LPS 组按80 mg/kg bw 灌胃猕猴桃皮多酚提取物，对照组和LPS 组灌胃等体积蒸馏水。两 周后，LPS 组和KPE-LPS 组按100 μg/kg bw 腹腔注射LPS，对照组腹腔注射等体积的灭菌生理盐水，持续两周。整个实验周期内大鼠自由摄食和饮水。
实验周期结束后，大鼠禁食不禁水12 h，经麻醉后，解剖大鼠，腹腔静脉取血，采集各组大鼠结肠组织和盲肠内容物。
1.4.3 肠道组织HE 染色及杯状细胞染色
取前端结肠约0.5 cm 置于10% 甲醛固定液中固定24 h，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片（厚度4～5 μm）。然后依照HE 染色及改良Hale 胶体铁黏多糖染色液试剂盒说明书将切片进行染色，收集并镜检（×100），观察结肠形态变化。
1.4.4 肠道组织切片免疫组织化学染色
取1.4.3 方法中的结肠石蜡切片进行如下操作：无水乙醇脱蜡和水化切片；柠檬酸钠缓冲液微波炉（100 ℃）加热10 min 进行抗原修复；在组织上滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育30 min；用10% 的山羊血清室温封闭30 min；滴加稀释好的一抗后4 ℃过夜孵育；滴加与一抗相应种属的二抗，室温孵育1 h；3，3´-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液显色；苏木素染色液复染后分化3 s，自来水冲洗5 min返蓝；无水乙醇梯度脱水；中性树胶封片。
1.4.5 黏蛋白MUC1 mRNA 表达水平检测
取0.1 g 结肠组织加入1 mL RNA 提取试剂盒（Trizol）匀浆，4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min 后取上清液，按上清液∶氯仿=5∶1（体积比）加入氯仿，4 ℃12 000 r/min 离心5 min，按体积比1∶1 加入异丙醇，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，去上清液，用75% 酒精洗去残留溶剂，干燥EP 管后，加入40 μL 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA 提取物，测定样品浓度及纯度。根据反转录试剂盒说明书将结肠组织RNA 反转录为cDNA。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如表1 所示。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
基因β-actin MUC1上游引物序列5´-CCTGTGGCATCCATGAAACT-3´5´-CACTCACGGACGCTATGTGC-3´下游引物序列5´-GAAGCACTGCGGTGCACGAT-3´5´-GGTTGGTGTAAGAGAGACCGCTAC-3´
按照TB Green TM Premix Ex Taq TM Ⅱ试剂盒说明书进行扩增获得CT 值，以β-actin 为内参，通过2-ΔΔCT 法进行计算。
1.4.6 盲肠食糜NH3-N 含量和短链脂肪酸含量的测定
盲肠食糜NH3-N 含量的测定：取盲肠内容物1.0 g，用蒸馏水稀释10 倍，混匀取上清液待测。取2.5 mL 苯酚显色剂于10 mL 离心管中，分别加入10 μL 内容物上清液、2.0 mL 50 mg/L 次氯酸盐溶液，充分混匀后4 ℃水浴15 min，自然冷却至常温后于650 nm 处测定吸光度。采用氯化铵作为标准品，绘制标准曲线（y=206 7x-102.37，R2=0.999 1），将所测得的吸光度代入标准曲线并计算出NH3-N 含量（mg/L）。
盲肠内容物短链脂肪酸含量的测定：参考文献[14]中的检测方法，称取各组大鼠盲肠内容物0.5 g 溶于8 mL 生理盐水，旋涡混匀，4 500 r/min 离心5 min，取2 mL 上清液，加入0.5 mL 25% 偏磷酸，混匀静置，过0.25 μm 滤膜后待测。
色谱条件：色谱柱型号为Agilenr DB-FATWAX UI（30 m×0.250 mm×0.25 μm）；柱温90 ℃、进样口温度200 ℃、氢火焰离子检测器温度为250 ℃。载气为氮气，流 量 为17.6 mL/min、分 流 比8∶1，空 气 流 量400 mL/min，燃气（氢气）流量40 mL/min。程序设定为初始温度90 ℃，持续1 min，再以60 ℃/min 的速率升温至170 ℃，再以15 ℃/min 升温至200 ℃，20 ℃/min升温至220 ℃。
短链脂肪酸的回归方程为乙酸Y=774.42X+11.231，R2=0.999 8；丙酸 Y=2 911.9X-3.055，R2=0.999 6；丁酸Y=2 059.5X-5.814 4，R2=0.999 4。
1.4.7 盲肠食糜微生物组成测定
1.4.7.1 样本基因组DNA 的提取
将适量的肠道内容物加入到装有1 000 μL 十六烷基三甲基溴化铵裂解液和溶菌酶的EP 管里，65 ℃水浴并混匀；离心（12 000 r/min、10 min）取上清液，以酚（pH8.0）∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1 的体积比加入相应试剂，离心（12 000 r/min、10 min）；取上清液，加入异丙醇，上下摇晃，-20 ℃沉淀；离心（12 000 r/min、10 min），弃上清液。用 1 mL 75%乙醇洗涤 2 次，室温晾干后加入ddH2O 溶解DNA 样品，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度。
1.4.7.2 PCR 扩增
用引物341F（5´-CCTAYGGGRBGCASCAG-3´）和860R（5´-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3´）对V3～V4可变区进行PCR 扩增和纯化，98 ℃预变性1 min；30 个循环（包括98 ℃变性10 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s）；最后72 ℃延伸5 min。
1.4.7.3 文库构建和上机测序
使用NEB Next® Ultra DNA Library Prep Kit 建库试剂盒进行文库构建，将构建好的文库使用生物分析仪进行检测和实时荧光定量PCR；待文库合格后，使用测序仪进行上机测序。
1.5 数据统计分析
采用ANCOM、ANOVA、Kruskal Wallis、LEfSe 和DEseq2 方法鉴定分组和样本间丰度有差异的细菌。采用SPSS 27.0 软件进行统计分析。多组间差异性比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 猕猴桃皮多酚提取物对内毒素应激大鼠肠道通透性的影响
KPE对LPS应激大鼠肠道组织形态的影响如图1所示。由图1 可知，对照组中大鼠肠道黏膜结构清楚，腺体排列规律有序，LPS 组大鼠肠黏膜结构及腺体排列紊乱，且有大量炎性细胞浸润，经KPE 干预后大鼠肠道结构形态与对照组相似。综上，KPE 能改善LPS 应激造成的肠道形态的变化，减少炎细胞浸润。
图1 KPE 对LPS 应激大鼠肠道组织形态的影响
Fig.1 Effect of KPE on the morphology of intestinal tissue in LPS-stressed rats
KPE 对LPS 应激大鼠肠道杯状细胞和黏蛋白MUC1 的影响如图2 所示。
图2 KPE 对LPS 应激大鼠肠道杯状细胞和黏蛋白MUC1 的影响
Fig.2 Effect of KPE on gut goblet cells and mucin MUC1 in LPS-stressed rats
杯状细胞主要分布在肠道黏膜的上皮细胞层中，其通过分泌黏蛋白形成黏液层，起到保护肠道屏障和增强免疫功能的作用[19]。由图2A 可知，对照组杯状细胞数量较多且分泌产生大量黏蛋白，LPS 组杯状细胞数量明显减少且分泌黏蛋白较少，而KPE 干预能够促进肠道杯状细胞的增殖和分化，并刺激其分泌黏蛋白，增强肠道屏障功能。
MUC1 的表达与肠道黏膜保护和免疫调节密切相关，其参与形成肠道黏液屏障保护肠道上皮细胞免受有害物质的侵害[20]。由图2B 可知，MUC1 主要表达在肠道绒毛上皮细胞顶端，MUC1 蛋白平均光密度值结果显示（图2C），对照组与KPE-LPS 组MUC1 的表达显著高于LPS 组（P<0.001、P<0.01），其 中对照组MUC1 蛋 白 表 达 是LPS 组 的1.72 倍，KPE-LPS 组MUC1 蛋白表达是LPS 组的1.53 倍；进一步采用RTPCR 对肠道组织黏蛋白MUC1 的mRNA 水平进行定量，图2D 结果表明，与对照组相比，LPS 组MUC1 表达含量高度显著降低（P<0.001），经KPE 干预后MUC1的表达含量呈显著上升趋势（P<0.05），且其表达含量约为LPS 组的3 倍。综上，KPE 能够促进黏蛋白MUC1 的分泌增强肠道屏障功能。
KPE 对LPS 应激大鼠肠道血清DAO 含量的影响如图3 所示。
图3 KPE 对LPS 应激大鼠肠道血清DAO 含量的影响
Fig.3 Effect of KPE on intestinal serum DAO content in LPSstressed rats
DAO 主要存在于哺乳动物肠道黏膜的表层和固有层细胞内，其含量与肠道黏膜细胞核酸和蛋白质合成密切相关，当肠道黏膜组织受损时，黏膜细胞内DAO 含量减少，血清中DAO 含量上升[21-22]。由图3 可知，与对照组相比，LPS 组DAO 含量升至16.53 U/L，升高51.48%（P<0.001），而经KPE 干预后DAO 含量下降至7.54 U/L，与LPS 组相比，差异高度显著（P<0.001），而与对照组无显著差异（P>0.05）。综上，LPS 应激导致了肠道损伤，使肠通透性增加，而KPE 干预能缓解LPS 造成的肠道损伤。
2.2 猕猴桃皮多酚提取物对内毒素应激大鼠盲肠内容物NH3-N 含量的影响
KPE 对LPS 应激大鼠盲肠内容物NH3- N 含量的影响如图4 所示。
图4 KPE 对LPS 应激大鼠盲肠内容物NH3- N 含量的影响
Fig.4 Effect of KPE on the NH3-N values of cecal contents in LPSstressed rats
NH3-N 是肠道微生物代谢产生的有害性代谢产物，其积累会导致氨中毒，并增加肠道的pH 值，从而抑制有益菌的生长和繁殖[23]。由图4 可知，LPS 组NH3-N 含量高达52.66 mg/L，极显著高于对照组和KPE-LPS 组（P<0.01），为对照组的1.47 倍，而经KPE 干预后下降至33.53 mg/L，与对照组相比无显著性差异。
2.3 猕猴桃皮多酚提取物对LPS 应激大鼠盲肠内容物SCFAs 含量的影响
KPE 对LPS 应激大鼠盲肠内容物SCFAs 含量的影响如图5 所示。
图5 KPE 对LPS 应激大鼠盲肠内容物SCFAs 的影响
Fig.5 Effect of KPE on SCFAs of the cecal contents in LPSstressed rats
A.乙酸含量；B.丙酸含量；C.丁酸含量。*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。
短链脂肪酸是由肠道微生物发酵产生的非营养物质，它们不仅能为肠上皮细胞提供能量，还具有保护肠黏膜屏障、调节电解质平衡、抑制肠道炎症、抗肿瘤等功能。SCFAs 通过调节肠道pH 值促进有益菌的多样性，从而防止有害菌的入侵[24]。由图5 可知，与对照组相比，LPS 组乙酸、丙酸、丁酸的含量分别下降了29.3%、28.6%和61.8%（P<0.01），而经KPE 干预后，乙酸、丙酸、丁酸含量显著上升，分别为（2.02±0.43）、（0.51±0.05）、（0.64±0.14） mg/g。而对照组与KPE-LPS组中乙酸和丙酸含量差异无统计学意义。Loo 等[25]发现甘蔗多酚可以促进有益菌生长和增殖，提高SCFAs的总产量，特别是丙酸和丁酸，促进宿主肠道健康。
2.4 猕猴桃皮多酚提取物对LPS 应激大鼠盲肠内容物微生物组成的影响
不同处理组大鼠盲肠微生物群的组成如图6 所示。
图6 不同处理组大鼠盲肠微生物群的组成
Fig.6 Composition of cecal microbiota in rats from different treatment groups
A.韦恩图；B.肠道微生物菌群的物种稀释曲线；C.盲肠微生物丰富度和均匀度的α 多样性；D.主成分分析图评分；E.基于肠道微生物操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）的weight-unifracde非度量多维标度评分图。**表示差异极显著，P<0.01；ns 表示两组之间无差异。
肠道内容物NH3-N 含量、短链脂肪酸含量的变化与肠道微生物组成的变化有关。采用16S rRNA 高通量测序技术对盲肠食糜短链脂肪酸的组成进行分析。韦恩图用于展示组间共有及各组特有的OTU，由图6A可知，这3 个组共有584 个OTU，对照组特有602 个OTU，LPS 组 特 有1 217 个OTU，KPE-LPS 组 特 有1 449 个OTU；由图6B 可知，各组稀释性曲线均趋向平坦，表明测序结果可以反映样品中绝大多数微生物信息。Shannon 指数用来评估物种个体出现的紊乱和不确定性，如图6C 所示，LPS 组的Shannon 指数极显著高于对照组和KPE-LPS 组（P<0.01）。综上，LPS 应激可能导致肠道菌群失衡，微生物种群多样性发生较大的变化，而KPE 干预能够维持肠道菌群稳态。
β 多样性通过比较不同组间距离的远近来衡量各组多样性变化的差异程度，图6D 显示对照组、LPS 组和KPE-LPS 组彼此分离，图6E 显示对照组独立分开，且较LPS 组，KPE-LPS 组距对照组更近，说明KPE 干预使得肠道微生物谱发生了积极的变化。
大鼠盲肠微生物群的组成及关键物种如图7 所示。
图7 大鼠盲肠微生物群的组成及关键物种
Fig.7 Composition and key species of the cecal microbiota in rats
A.科水平微生物组成柱状图；B.属水平分组百分比堆积图；C、D.LEfSe 和LDA SCORE（lg）差异物种鉴定。
由图7A 可知，在科水平上，与对照组相比，LPS 组中瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）等有害菌的相对丰度有所增加，经KPE 干预后，降低了瘤胃球菌科、毛螺菌科菌群的丰度。研究表明，瘤胃球菌科与肠道炎症密切相关，并且其相对丰度的高低与症状的严重程度呈正相关[26-27]。
由图7B 可知，在属水平上，较LPS 组，KPE 干预能够增加异杆菌属（Allobaculum）、埃希菌（Escherichia）、乳杆菌属（Lactobacillus）、经黏液真杆菌属（Blautia）及双歧杆菌属（Bifidobacterium）等有益菌的丰度。研究显示，Allobaculum 是人体肠道中重要的SCFAs 产生菌，Allobaculum 能促进葡萄糖代谢产生丁酸盐和乳酸盐[28]，Allobaculum 丰度的增加能够增强肠道屏障和免疫功能。Blautia 是肠道中最丰富的属之一，它不仅能够产生细菌素防止病原体的定殖，还能促进乙酸和丁酸的产生，并上调调节性T 细胞以促进肠道免疫和维持葡萄糖稳态[29-30]。双歧杆菌属是肠道内常见的有益菌，能够维持肠道菌群的平衡，具有抗感染、抗炎、抗肿瘤和促进心理健康等特性，并产生生物素、丙酸盐、丁酸盐等代谢产物[31]。
为鉴定对照组、LPS 组和KPE-LPS 组类群相关的特异性细菌门，运用LEfSe 和LDA 鉴定最可能解释组间差异的核心类群。由图7C 可知，对照组中肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、变形菌科（Gammaproteobacteria）等细菌富集，LPS 组中毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、梭状芽孢杆菌科（Clostridia）等富集，而KPE-LPS 组中，产甲烷菌科（Methanobacteriaceae）、广古菌门（Euryarchaeota）、双歧菌科（Bifidobacteriaceae）等富集。
3 结论
为探究猕猴桃皮多酚提取物对肠道的保护作用，从肠道屏障的角度对大鼠结肠组织进行形态学和黏蛋白测定，检测了盲肠内容物短链脂肪酸含量，并通过微生物组学明确各组大鼠肠道菌群的变化。结果表明KPE 具有多种对肠道健康有益的效应。KPE 能够减轻LPS 应激引起的肠道通透性增加，降低DAO 含量，促进杯状细胞增殖且促进黏蛋白MUC1 的表达，从而增强肠道屏障功能；其次LPS 组NH3-N 含量是对照组的1.47 倍，与对照组相比，LPS 组乙酸、丙酸、丁酸的含量分别下降了29.3%、28.6%和61.8%，而KPE 干预能够降低NH3-N 含量并增加肠道乙酸、丙酸和丁酸的含量，从而维持肠道的稳态。此外，KPE 还能够增加异杆菌属和经黏液真杆菌属等有益菌的丰度，同时抑制瘤胃球菌科和毛螺菌科等有害菌的增殖。以上效应共同改善了肠道的健康状况，维持肠道微生物稳态，并有助于对抗LPS 对肠道的损伤。本研究为猕猴桃皮多酚提取物在保护机体健康方面提供理论支持。
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