2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是糖尿病（diabetes mllitus，DM）中最普遍的一种，临床占比超过80%，它的主要特征是高血糖、相对胰岛素缺乏和胰岛素抵抗，这些因素都会扰乱机体糖代谢，进而影响记忆功能[1]。以初期学习记忆损伤为特征的阿尔茨海默病（Alzheimer´s disease，AD）与T2DM 之间密切相关，也称为3 型糖尿病（type 3 diabetes mellitus，T3DM）[2]。研究发现，T2DM 患者脑中伴随AD 相关症状的发生[3]。脑部影像学成像结果表明，AD 与T2DM 患者体内葡萄糖能量代谢均明显下降[4]，且研究进一步表明，脑内胰岛素在T2DM 海马区的AD 样病变发挥重要作用[5]。T2DM 患者大脑胰岛素水平下降，破坏大脑葡萄糖能量代谢平衡，引起认知障碍[6]。大脑多个区域，如下丘脑、海马体、皮层等均有胰岛素受体分布，并具有脑源性胰岛素[7]。使用外周药物治疗与AD 相关的病变，会导致脑液中胰岛素水平升高[8]。所以，提高脑内胰岛素水平是改善或缓解学习记忆障碍的重要手段之一。
硫胺素（thiamine）是一类常见的小分子活性物质，无法通过机体自身合成，必须通过饮食摄取[9]。临床研究表明，AD 患者脑内普遍存在硫胺素缺乏和代谢异常的现象[10]，这种缺乏会影响脑内能量代谢，损伤脑内神经元，进而引发AD 的相关病变[11]。硫胺素可以通过调整能量代谢相关酶的活性来发挥作用，有效降低血脂，从而减轻T2DM 相关症状[12]。同时，它参与神经递质合成，对神经冲动传导和神经元的生长发育起着至关重要的作用[13]。在T2DM 和AD 患者血液和大脑中，硫胺素的稳态常常发生改变[14]，这会导致血糖紊乱，影响大脑对葡萄糖的利用；而硫胺素不足会导致脑内能量代谢下降。开发由T2DM 引起的AD 相关性病变的治疗手段与方法是当前亟需解决的科学问题。通过改善神经元细胞在高糖环境下脑内葡萄糖能量代谢，对预防AD 症状发生具有重要意义。本研究采用高糖诱导HT-22 小鼠海马神经元细胞损伤，探讨硫胺素对高糖诱导的HT-22 细胞损伤的神经保护作用，以期为硫胺素在T2DM 所导致的神经相关性病变的研究中提供科学理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
HT-22 小鼠海马神经元细胞：上海中乔新舟生物科技有限公司；α-淀粉酶（2 000 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（100 U/mg）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、甲基噻唑蓝[（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、阿卡波糖、硫胺素（纯度>99%）、对硝基苯基葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG）、D-（+）-葡萄糖（纯度>99.5%）：美国Sigma-Aldrich 公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） （0.25%）：美国HyClone公司；双喹啉酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、苯甲磺酰氟（α-toluenesulfonyl fluoride，PMSF）、含放射免疫沉淀试验缓冲液（radio immuno precipitation assay，RIPA）的裂解液：上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、双抗：美国Thermo Fisher Scientific 公司；DMEM 高糖培养基：美国Gibco 公司；葡萄糖试剂盒、胰岛素测试盒：南京建成生物工程研究所；葡萄糖摄取荧光探针2-（N-7-硝基-2，1，3-苯并恶二唑-4-氨基）-2-脱氧-D-葡萄糖｛2-[N-（7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl）amino]-2-deoxy-Dglucose，2-NBDG｝：武汉安捷凯生物医药科技有限公司；磷酸盐缓冲液含吐温 20（phosphate buffered saline with tween 20，PBST）：上海源叶生物科技有限公司；突触素（synaptophysin，SYP）、脑源性神经营养因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）、β-Catenin、GSK-3β：美国Cell Signal Technology 公司；聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）：美国BIO-RAD Laboratories公司；抗Insulin 和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）：爱博泰克生物科技有限公司；β-actin、4´，6-二脒基-2-苯基吲哚（4´，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、FITC 标记山羊抗兔IgG （H+L）：武汉赛维尔生物科技有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）、超敏增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）液：大连美仑生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
CB150 型细胞培养箱：德国Binder 公司；DH100-4干式恒温器：杭州瑞诚仪器有限公司；SHP-250 生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；Fluoroskan Ascent FL 型酶标仪：美国Thermo Fisher Scientific 公司；Image Quant LAS 500 凝胶成像系统：美国GE Healthcare公司；MRc5 荧光倒置显微镜：德国 Carl Zeiss 公司；UV-1700 紫外可见分光光度计：日本SHIMADZU 公司。
1.3 方法
1.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率的测定
1.3.1.1 α-葡萄糖苷酶抑制率
参考文献[15]的方法，在含有50 μL PBS 中加入20 μL 浓度分别为0.1、0.4、0.8、1.2、1.5 mg/mL 的硫胺素样品溶液（在含有10% DMSO 的PBS 中溶解），然后加入5 μL α-葡萄糖苷酶溶液（10 U/mL）。随后加入10 μL PNPG 用于反应，混匀在37 ℃条件下静置20 min。随后用150 μL 的1 mol/L Na2CO3 溶液以停止反应，酶标仪测定405 nm 处的吸光度。阿卡波糖为阳性对照[16]。α-葡萄糖苷酶抑制率（X，%）计算公式如下。
式中：A1 为空白组（PBS）吸光度；B1 为处理组（硫胺素/阿卡波糖）吸光度。
1.3.1.2 α-淀粉酶抑制率
参考文献[17]的方法，将10 μL α-淀粉酶溶液（10 U/mL）和20 μL 硫胺素溶液（浓度分别为0.1、0.4、0.8、1.2、1.5 mg/mL）混匀后，放置在37 ℃生化培养箱。随后加入500 μL 质量分数为1% 的淀粉溶液反应5 min，结束后加入600 μL 的DNS 停止反应，然后放置在100 ℃干式恒温器中10 min，冷却后用紫外可见分光光度计在540 nm 处测定吸光度。α-淀粉酶抑制率（Y，%）计算公式如下。
式中：A2 为空白组（PBS）吸光度；B2 为处理组（硫胺素/阿卡波糖）吸光度。
1.3.2 HT-22 细胞培养
细胞培养条件：HT-22 细胞在37 ℃、5% CO2 的细胞培养箱中，以含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM 培养基进行培养，在细胞融合达到约86%时，进行传代。
高糖培养基的制备：1.8 g D-葡萄糖添加在10 mL含有10% 胎牛血清和1% 青霉素链霉素的DMEM 培养基中，0.22 μm 滤膜过滤，制备1 000 mmol/L 高糖母液。随后根据试验要求，将高糖溶液稀释成不同浓度。
1.3.3 MTT 试验
1.3.3.1 不同浓度硫胺素对HT-22 细胞活性影响
采集对数生长期细胞，在96 孔板中每孔加入100 μL 细胞悬液（每孔约6×104 个细胞），在细胞培养箱中培养24 h。弃除上清液，加入100 μL 含有不同浓度 硫 胺 素（25、50、100、300、600、800、1 000、1 200、1 600、2 000 μmol/L）培养基孵育24 h。去除上清液，加入100 μL 含有5 mg/mL 的MTT 培养液，继续培养细胞4 h。吸出上清液，并添加100 μL DMSO，使用酶标仪在490 nm 处测定吸光度[18]。细胞活力（Z，%）按照下列公式计算。
式中：Asample 为处理组（高糖/硫胺素、MTT、DMSO、细胞）吸光度；Acontrol 为空白对照组（MTT、DMSO、细胞）吸光度；Ablank 为对照组（MTT、DMSO）吸光度。
1.3.3.2 不同浓度高糖对HT-22 细胞活性影响
同1.3.3.1 中96 孔板细胞培养方法，收集相同浓度细胞培养孵育后，培养基中葡萄糖浓度为50、75、100、125、150、175、200 mmol/L 孵育24 h。采用MTT试验测定细胞活力。
1.3.3.3 硫胺素对高糖损伤HT-22 细胞的保护
同1.3.2 细胞培养方法，收集相同浓度细胞培养孵育后，由HT-22 细胞在合适的高糖浓度下培养作为模型组，然后去除上清液，加入100 μL 培养基，在不同硫胺素浓度（600、800、1 000 μmol/L）下于高糖环境孵育24 h。空白组为正常培养，模型组为1.3.3.2 筛选出的高糖损伤模型，采用MTT 试验测定细胞活力。
1.3.4 葡萄糖消耗与摄取以及胰岛素分泌测定
1.3.4.1 葡萄糖消耗测定和胰岛素分泌测定
HT-22 细胞接种于细胞培养皿中，高糖损伤后，加入硫胺素孵育，收集细胞培养液，以1 000 r/min 离心10 min，取上清液，随后根据葡萄糖试剂盒和胰岛素试剂盒说明书进行操作。
1.3.4.2 2-NBDG 摄取检测
2-NBDG 是一种荧光标记的2-脱氧葡萄糖的类似物。细胞在12 孔板中由硫胺素处理结束后，加入终浓度100 μmol/L 的2-NBDG，在37 ℃下培养1 h，洗净后在荧光倒置显微镜下观察。
1.3.5 免疫荧光
将HT-22 细胞在6 孔板培养后用PBS 清洗，用固定液进行细胞固定20 min。使用0.3% 的PBST 渗透处理10 min。PBST 清洗后用5% 山羊血清在24 ℃下封闭细胞30 min，用抗Insulin（1∶100，体积比）孵育15 h，PBST 清洗3 次后，FITC 二抗避光孵育1 h，DAPI染色5 min，用荧光倒置显微镜观察并分析。
1.3.6 蛋白免疫印迹
用预冷的PBS 清洗细胞，并在冰上用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液进行裂解。在4 ℃下进行30 min 振荡后，将细胞以10 000×g在4 ℃下离心10 min。收集上清液，并使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定细胞中蛋白浓度。上样，电泳，转膜1 h，清洗后在摇床封闭2 h，加入一抗4 ℃摇床孵育过夜。洗膜后二抗孵育1 h，洗膜，在Image Quant LAS 500 凝胶成像系统中进行曝光并拍照，利用 ImageJ 软件分析。
1.4 数据处理与统计分析
使用GraphPad Prism 9.4 工具绘制数据图形，试验均进行3 次，所有数值以平均值±标准差表示，使用One-way ANOVA 分析评估显著性，不同小写字母表示各组间存在显著性差异（P<0.05），不同大写字母表示各组间存在极显著性差异（P<0.01）。
2 结果与分析
2.1 HT-22 细胞活性研究
2.1.1 不同浓度硫胺素对细胞活性的影响
硫胺素作为一种在人体代谢中发挥至关重要作用的功能性小分子，在适当剂量下对细胞几乎无任何毒害作用[19]。不同浓度硫胺素对HT-22 细胞活力的影响见图1。
图1 不同浓度硫胺素对HT-22 细胞活力的影响
Fig.1 Effect of various thiamine concentrations on viability of HT-22 cells
不同大写字母表示各组间存在极显著性差异（P<0.01）。
图1 结果显示，与空白组相比，硫胺素在浓度为25～2 000 μmol/L 下细胞活性增加；尤其在100、300、600、800、1 000 μmol/L 的浓度下，细胞活性极显著增加（P<0.01）。这一现象可能归因于硫胺素作为一种重要的辅酶，在体内参与了诸如转酮醛酸酶（ketol-acid reductoisomerase，KARI） 反应等多种能量代谢酶促反应过程，进而推动了葡萄糖的代谢和能量的产生[20]。因此，在一定浓度范围内，硫胺素能够有效提升神经元细胞的代谢活性，这在MTT 试验中通过较高的吸光度得到了体现。因此，后续采用600、800、1 000 μmol/L的硫胺素对高糖损伤的HT-22 细胞进行神经保护作用研究。
2.1.2 不同浓度高糖对HT-22 细胞活性的影响
T2DM 患者大脑中持续的高血糖环境会引发细胞功能的紊乱，进而加速细胞凋亡过程，对神经细胞造成不可逆的损害，最终导致记忆功能障碍的发生[21]。不同高糖环境下对HT-22 细胞活力的影响见图2。
图2 高糖环境下对HT-22 细胞活力的影响
Fig.2 Effect of environment with elevated glucose levels on viability of HT-22 cells
不同大写字母表示各组间存在极显著性差异（P<0.01）。
由图2 可知，随着葡萄糖浓度升高，HT-22 细胞活性逐渐降低，且与葡萄糖浓度之间存在着明显的依赖关系。与空白组相比，当葡萄糖浓度大于75 mmol/L时，细胞活力均极显著降低（P<0.01）。为使细胞活力下降且不导致细胞大量死亡，因此选择葡萄糖浓度为75 mmol/L 诱导HT-22 细胞作为神经损伤模型。
2.1.3 硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞活性的影响
硫胺素在适当浓度下能够改善HT-22 细胞活力。不同浓度硫胺素对HT-22 细胞在高糖环境损伤的保护作用见图3。
图3 硫胺素对HT-22 细胞高糖损伤模型的保护作用
Fig.3 Protective effect of thiamine on high glucose-induced damage model of HT-22 cells
a.细胞形态；b.硫胺素对细胞的保护作用。不同大写字母表示各组间存在极显著差异（P<0.01）。
由图3a 可知，HT-22 细胞经75 mmol/L 葡萄糖处理24 h 后，模型组细胞出现了明显的损伤形态。这些细胞边缘变得模糊不清，胞体呈圆形，突触结构也发生了坍缩；然而用硫胺素（600、800、1 000 μmol/L）处理后，HT-22 细胞中的黏附性能与模型组细胞相比都具有较长的梭状形状，细胞边缘光滑，突触明显。由图3b 可知，与模型组相比，浓度为800 μmol/L 和1 000 μmol/L硫胺素处理后细胞活性极显著增加；其中，800 μmol/L的硫胺素处理组细胞活性提高更为明显。以上试验结果表明，硫胺素对神经元细胞在高糖环境下具有增强细胞活性的作用。因此，选择800 μmol/L 硫胺素为模型损伤保护浓度。
2.2 硫胺素降血糖活性研究
2.2.1 硫胺素对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影响
体外α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率是衡量降糖效果的重要指标[22]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂类似物可以大幅度降低这两种酶的活性[23]，这类药物常被DM 患者用作口服的降糖药，然而，长期服用可能产生耐药性[24]。硫胺素作为一种关键的辅酶，参与转酮醛酸酶反应，对糖代谢中的关键酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）具有抑制作用。这两种酶在糖代谢中发挥着不可或缺的作用：α-淀粉酶可以将淀粉分解为葡萄糖单元，而α-葡萄糖苷酶则能将多种α-糖基连接的底物水解成单糖。在这一系列反应中，转酮醛酸酶具有重要作用。硫胺素通过参与转酮醛酸酶反应，干扰了这些酶系统的正常功能，进而抑制了α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性[25]。硫胺素对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图4。
图4 硫胺素对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用
Fig.4 Inhibitory effects of thiamine on α-amylase and αglucosidase
A.α-葡萄糖苷酶抑制率；B.α-淀粉酶抑制率。不同小写字母表示各
组间存在显著性差异（P<0.05）。
由图4 可知，硫胺素浓度为0.1～1.5 mg/mL 时，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性抑制效果呈现出明显的剂量依赖性；当硫胺素浓度为1.5 mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分别为26.73%和29.68%。
2.2.2 硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞内葡萄糖消耗与摄取的影响
2-NBDG 作为一种荧光葡萄糖类似物，与D-葡萄糖具有相同的转运体和类似代谢方式[26]。因此，它常被用作荧光示踪剂，以监测哺乳动物细胞通过葡萄糖转运蛋白摄取D-葡萄糖中的过程以及后续的葡萄糖代谢。硫胺素对HT-22 细胞在高糖环境下对葡萄糖消耗和摄取的影响见图5。
图5 硫胺素对葡萄糖消耗和摄取的影响
Fig.5 Effect of thiamine on glucose consumption and uptake
Ⅰ.2-NBDG 荧光；Ⅱ.2-NBDG 荧光强度定量；Ⅲ.葡萄糖消耗。不同大写字母表示各组间存在极显著性差异（P<0.01），不同小写字母表示各组间存在显著性差异（P<0.05）。
由图5 可知，与空白组相比，模型组高糖诱导HT-22 细胞内2-NBDG 的荧光强度极显著下降，然而，在硫胺素处理后，与模型组相比，2-NBDG 的荧光强度极显著增加（P<0.01），表明硫胺素可以显著改善高血糖环境下的葡萄糖摄取与转运。与模型组相比，硫胺素显著增加了高糖诱导HT-22 细胞内的葡萄糖消耗（P<0.05）。在T2DM 的高糖环境下，细胞对葡萄糖的消耗能力受到影响，导致血糖浓度上升[27]，并且高糖环境还会影响细胞对葡萄糖的摄取，促使T2DM 进一步恶化[28]。因此，葡萄糖消耗和摄取能力强弱，也是反映降血糖能力高低的指标之一[29-30]。以上研究结果表明，硫胺素可以显著改善高糖诱导HT-22 细胞内葡萄糖消耗和摄取，具有良好的降血糖能力。
2.2.3 硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞内胰岛素含量的影响
高糖环境通过多种途径影响HT-22 细胞的胰岛素分泌相关功能，硫胺素对HT-22 细胞在高糖环境下的胰岛素分泌影响见图6。
图6 硫胺素对胰岛素分泌的影响
Fig.6 Effect of thiamine on insulin secretion
A.培养基上清液中胰岛素含量；B.胰岛素免疫荧光染色；C.荧光强度定量。不同小写字母表示各组间存在显著性差异（P<0.05）。
由图6 可知，与空白组相比，模型组高糖诱导的HT-22 细胞中，胰岛素含量显著降低；然而硫胺素处理后，与模型组相比细胞内胰岛素含量显著增加（P<0.05）。硫胺素能够显著增加高糖诱导HT-22 细胞内胰岛素的相对荧光强度（P<0.05）。在高糖环境下，神经元细胞受到损伤，从而降低其葡萄糖的消耗和摄取能力，进一步导致胰岛素含量的下降，最终可能引发脑内葡萄糖能量代谢的失衡。结果表明，在高糖环境中，HT-22 细胞内胰岛素合成以及分泌能力减弱，而硫胺素显著促进高糖损伤HT-22 细胞分泌胰岛素的能力，从而有助于改善高糖诱导HT-22 细胞神经元损伤。
2.3 硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞内突触相关蛋白的影响
神经元细胞内突触相关蛋白表达是衡量突触可塑性的重要指标。然而高糖内环境影响突触相关蛋白表达，进而可能导致神经元的损伤，硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞内突触相关蛋白的影响如图7 所示。
图7 硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞内突触相关蛋白的影响
Fig.7 Effect of thiamine on synapse-related proteins in HT-22 cells induced by high glucose
A.蛋白免疫印迹条带；B.SYP 蛋白定量分析；C.BDNF 蛋白定量分析。不同小写字母表示各组间存在显著性差异（P<0.05）。
由图7 可知，与空白组相比，高糖诱导HT-22 细胞内BDNF 和SYP 蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；然而硫胺素处理后，BDNF 和SYP 蛋白表达水平显著增加（P<0.05）。以上结果表明，硫胺素可以增加突触相关蛋白表达，进而增强损伤神经元突触可塑性。
2.4 硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞内β-Catenin/GSK-3β 信号通路的影响
高糖环境会导致HT-22 细胞内的信号通路受到影响，硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞内β-Catenin/GSK-3β 信号通路的影响如图8 所示。
图8 硫胺素对高糖诱导HT-22 细胞内β-Catenin/GSK-3β 信号通路的影响
Fig.8 Effect of thiamine on β-Catenin/GSK-3β signaling pathway in HT-22 cells induced by high glucose
A.GSK-3β 和p-GSK-3β 蛋白表达水平；B.β-Catenin 荧光强度。不同小写字母表示各组间存在显著性差异（P<0.05）。
由图8A 可知，与空白组相比，高糖诱导的HT-22细胞内p-GSK-3β/GSK-3β 表达量显著降低（P<0.05）；然而，经过硫胺素处理后，p-GSK-3β/GSK-3β 表达量显著增加（P<0.05）。同样，硫胺素处理后还显著增强了高糖诱导HT-22 细胞内β-Catenin 荧光强度（P<0.05）。以上研究结果表明，硫胺素能够通过增加HT-22 细胞在高糖环境下的p-GSK-3β 及β-Catenin 表达，进而促进脑源性胰岛素分泌。
3 讨论
T2DM 患者体内高糖环境所引发的与AD 相关的病变，进而导致的认知功能障碍的具体机制尚未完全明确，其中脑葡萄糖代谢减退引起能量代谢失衡被认为是认知功能障碍形成的主要诱因。长期的高血糖状态会干扰葡萄糖进入脑细胞的途径，降低葡萄糖的消耗和摄取能力，打破脑内葡萄糖能量代谢的失衡，这种情况会进一步影响神经元细胞胰岛素的合成与分泌，最终对大脑认知功能产生负面影响。因此，对学习和记忆来说，维持高糖环境下海马神经元细胞中葡萄糖能量代谢平衡显得尤为重要。在高糖内环境下，胰岛素的分泌会减少，从而导致葡萄糖无法得到充分利用。口服α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制剂是治疗糖尿病的重要手段之一。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶酶活性上升会促进胰岛素抵抗、损伤胰岛B 细胞，进而加重糖尿病的并发症。因此，为了提高细胞内葡萄糖分解速度，减少α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，对控制血糖水平和改善机体损伤具有重要作用。体外升糖能力酶活性抑制试验结果表明，硫胺素能显著抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶酶活性，具有优良的降血糖效果。高糖内环境会导致细胞对葡萄糖消耗和摄取能力下降[27]，而硫胺素是参与能量产生的中间代谢的酶辅助因子[12]，可以促进细胞对葡萄糖消耗与摄取。使用试剂盒与荧光探针2-NBDG 测定高糖环境下HT-22细胞内葡萄糖消耗与摄取，结果显示，高糖环境降低了神经元细胞对葡萄糖的消耗与摄取；而硫胺素干预后，显著提高了细胞对葡萄糖的消耗与摄取，这一效果可能与脑源性胰岛素的合成与分泌有关。
此外，在高血糖环境下，胰岛B 细胞受损，进而影响胰岛素的分泌。脑源性胰岛素的分泌通过促进葡萄糖摄取和消耗，维持大脑能量代谢稳态[6]，进而调节与学习、记忆和认知相关的突触可塑性，最终影响认知功能。研究表明，硫胺素能通过调节胰岛素受体基因表达，促进胰岛素信号通路正常功能。为了深入探讨硫胺素对高糖环境下HT-22 细胞内胰岛素合成与分泌功能的影响，本研究采用了免疫荧光试验对细胞内胰岛素进行荧光定位。结果表明，高糖环境会明显降低神经元细胞胰岛素合成和分泌，而硫胺素处理则能提升这种环境下胰岛素合成与分泌能力。同时，通过蛋白免疫印迹试验进一步证实，硫胺素能显著增加葡萄糖诱导的HT-22 细胞内突触素和BDNF 蛋白的表达，表明硫胺素具有增强体外胰岛素神经元损伤细胞内突触可塑性的作用。此外，在高糖环境下，p-GSK-3β 的水平会调控下游与胰岛素相关的基因表达，进而促进脑源性胰岛素的生成。通过蛋白免疫印迹和免疫荧光试验，分析了葡萄糖诱导的HT-22 细胞内p-GSK-3β和β-Catenin 表达，试验结果显示，硫胺素能显著上调p-GSK-3β/GSK-3β 表达水平和β-Catenin 荧光强度。以上研究结果表明，硫胺素可能通过β-Catenin/GSK-3β 信号通路，调节细胞内葡萄糖消耗和摄取，增加突触相关蛋白表达，从而改善高糖诱导的神经元损伤，这为硫胺素改善或缓解T3DM 提供理论依据和参考。
4 结论
硫胺素对高糖诱导的HT-22 细胞展现出显著的保护作用，有助于缓解神经元损伤。硫胺素能够显著抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，进而促进葡萄糖的消耗与摄取，并提升胰岛素的分泌水平；此外，硫胺素还能增加突触相关蛋白表达，有效增强突触的可塑性，并通过调节β-Catenin/GSK-3β 信号通路，提高脑源性胰岛素合成与分泌能力，维持细胞内葡萄糖代谢及能量稳态，对葡萄糖诱导胰岛素神经元损伤具有保护作用，为硫胺素改善或缓解T3DM 提供理论依据和参考。
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