杨梅酒是杨梅的深加工产品,根据工艺不同分为浸泡杨梅酒和发酵杨梅酒。因工艺简单、操作方便,在杨梅季自制一壶杨梅浸泡酒是浙江沿海地区的习俗。随着人们生活品质的日益提高,果香浓郁、酒精度低、营养丰富的发酵型果酒越来越受消费者喜爱[1],因此不少杨梅酒生产企业逐渐将目光转向发酵型杨梅酒。发酵型杨梅酒生产工艺为原料分选去杂、清洗、榨汁、成分调整、加热灭菌、冷却、接种发酵、停止发酵、二次调整、澄清过滤、杀菌、灌装[2-3],其中加热灭菌、接种发酵、调配、杀菌等均为发酵果酒的关键控制点[4-6]。
灭菌工艺是利用高温对杨梅汁中的微生物起到消杀作用,从而避免杂菌对发酵产生不利的影响。杨梅汁发酵过程中添加的酵母菌相较于天然存在的杂菌在数量上占据优势,但是仍然存在被其他微生物破坏的可能性[7-11]。腐败微生物污染主要来源于发酵设备和水果表皮,包括酵母菌、丝状真菌和细菌等污染。腐败微生物不仅影响果酒的风味还有可能造成食品安全问题[12-13]。灭菌工艺对多酚氧化酶也兼具钝化作用,可减少杨梅酒酶促褐变的发生,保持酒体的清亮鲜红[14]。王月晖等[15]、闫真真[16]的研究表明热处理技术对果酒酶促褐变发生有明显的抑制作用。过度加热则会对杨梅酒的营养成分和风味物质产生不利影响,因此研究和控制合适的灭菌条件对杨梅酒发酵过程尤为重要。
目前,国内外对杨梅酒的发酵、澄清、降酸等技术研究较多,对灭菌工艺的研究相对较少[17-18]。关于不同灭菌条件处理的杨梅酒成分差异的研究鲜见报道。本试验通过研究不同灭菌条件对发酵型杨梅酒色值、营养成分、理化特性的影响,从而确定较为有效的灭菌工艺,以期为探究更优的杨梅酒生产工艺以及品质更佳的杨梅酒产品提供参考。
杨梅汁:浙江聚仙庄饮品有限公司;白砂糖:市售;葡萄酒果酒专用酵母(angel wine and fruit wine specific yeast,SY):安琪酵母股份有限公司;RP 离子色谱小柱:上海安谱实验科技股份有限公司;17 种氨基酸混标、茚三酮显色液:富士和光纯药株式会社;平板计数琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基:广东环凯微生物科技有限公司;柠檬酸、乳酸、乙酸、DL-苹果酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇(均为分析纯):上海麦克林生化科技股份有限公司。
全自动色度分析仪(PFXi-995):英国罗维朋公司;全自动氨基酸分析仪(LA8080):日本日立公司;气相色谱仪(GC-2010 Plus):日本岛津公司;酒精分析仪(DMA4100M):奥地利安东帕公司;恒温恒湿培养箱(HPP260)、生化培养箱(IPP 400Plus):德国美墨尔特公司;电热恒温油浴锅(ICCbasic):艾卡仪器设备有限公司。
1.3.1 杨梅酒的制备
油浴锅按照不同加热温度(60、80、100、120 ℃)和加热时间(20 s,2、5、10、20 min)共设置20 种灭菌条件。将杨梅汁放入油浴锅,并用温度计测量其中心温度。杨梅汁达到设定温度后开始计时,到达设定时间后取出放入冰水中迅速冷却降温。灭菌后的杨梅汁添加SY(0.2 g/L),置于(25±5)℃的室温下单向密闭发酵24 h。按照200 g/L 的添加量添加白砂糖,摇匀后置于(25±5)℃的室温下单向密闭发酵10 d。取上清液转入另外的容器中置于(25±5)℃室温和自然光照的条件下陈酿6 个月。对照样本为不采用任何灭菌工艺的杨梅汁直接添加酵母和白砂糖进行发酵和陈酿处理。
1.3.2 杨梅酒酒精度、干浸出物含量的测定
酒精分析仪用水和不同浓度酒精进行校正,设置仪器参数:测量温度为20 ℃,测量时间为600 s,测量模式为红酒,重复测定3 次取平均值。取50 mL 杨梅酒放入自动进样器,启动运行并记录酒精度和总浸出物含量。参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]中的方法对样品中的总糖含量进行测定。干浸出物含量即为总浸出物含量与总糖含量差值。
1.3.3 杨梅酒色值测定
全自动色度分析仪预热和调零,设置仪器参数:光源D 65,视角2°,光程长度10 mm,选定色度标准CIE Lab,重复测定3 次取平均值。取10 mL 杨梅酒10 000 r/min 离心3 min,过4 μm 的水系滤膜。滤液转移至10 mm 比色皿并放入仪器进行测量,分别记录L*值、a*值、b*值。
1.3.4 菌落总数、霉菌、酵母菌的测定
参考GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物检验菌落总数的测定》[20]中的方法进行菌落总数的测定,观察并记录(36±1)℃培养(48±2)h 菌落总数。参考GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物检验霉菌和酵母计数》[21]中的方法进行霉菌和酵母菌的测定,观察并记录(28±1)℃培养5 d 的霉菌和酵母数。
1.3.5 有机酸的测定
取样品1 mL 用纯水稀释并定容至20 mL 容量瓶,经RP 离子色谱小柱净化,有机滤膜过滤,然后经离子色谱检测。离子色谱仪器条件:色谱柱为Dionex Ion-Pac AS 19(250 mm×4 mm×7.5 mm)和Dione IonPacx AS 19(50 mm×4 mm×11 mm);流动相为KOH 溶液(由Dionex EGC500 KOH 淋洗液自动发生器在线产生);流速为1.0 mL/min;检测器为电导检测器;池温30 ℃;柱温30 ℃;梯度洗脱条件0~13 min,4 mmol/L;13~14 min,4~16 mmol/L;14~33 min,16 mmol/L;33~37 min,16~50 mmol/L;37~43 min,50 mmol/L;43~45 min,50~4 mmol/L;45~50 min,4 mmol/L[22]。
1.3.6 酯类和醇类化合物的测定
杨梅酒经过0.22 μm 有机滤膜过滤,进气相色谱仪检测。色谱条件:色谱柱为DB-WAX UI 毛细色谱柱(60 m×0.250 mm×0.25 μm);检测器为火焰离子化检测器,温度250 ℃;气化室温度250 ℃;进样体积为1 μL;分流比50∶1;升温程序:35 ℃保持4 min,以4 ℃/min升至230 ℃,230 ℃保持7 min;载气流速1.0 mL/min。
1.3.7 游离氨基酸的测定
参考李沁娅等[23]的方法对样品进行沉淀蛋白和去杂处理。利用全自动氨基酸分析仪对杨梅酒中的游离氨基酸成分进行测定。
采用Excel 2007 和SPSS 22.0 软件进行数据处理和统计分析,Kaiser-Meyer-Olkin(KMO)检验统计量用于比较变量间简单相关系数和偏相关系数,用于判定试验数据是否适合作因子分析。
一般来说,果酒的酒精度为8%vol~15%vol,酒精度过高或过低均会影响杨梅酒的口感,过高会掩盖杨梅酒的天然芳香,过低则导致杨梅酒口味不足。酒精度与鲜味呈显著负相关(P<0.05),酒精度与苦味呈显著正相关(P<0.05)[24-25]。酒精度主要由杨梅果实中的含糖量和外源添加糖量决定。虽然杨梅酒的发酵是很复杂的化学反应过程,但其中最主要的变化就是糖在酵母菌的作用下转化为酒精和二氧化碳,因此酒精度也是衡量杨梅酒发酵成败的关键指标。杨梅酒中富含的糖、有机酸、多种维生素、无机盐、花青素等营养成分含量的高低通常以干浸出物来表示。不同灭菌条件下杨梅酒的酒精度和干浸出物含量见表1 和表2。
表1 不同灭菌条件下杨梅酒酒精度
Table 1 Alcohol content of bayberry wine under different sterilization conditions
灭菌条件60 ℃20 s 60 ℃2 min 60 ℃5 min 60 ℃10 min 60 ℃20 min酒精度/%vol 14.4 14.4 14.3 13.9 14.1灭菌条件80 ℃20 s 80 ℃2 min 80 ℃5 min 80 ℃10 min 80 ℃20 min酒精度/%vol 14.3 14.3 14.3 14.4 14.4灭菌条件100 ℃20 s 100 ℃2 min 100 ℃5 min 100 ℃10 min 100 ℃20 min酒精度/%vol 14.4 14.2 14.4 14.4 14.4灭菌条件120 ℃20 s 120 ℃2 min 120 ℃5 min 120 ℃10 min 120 ℃20 min酒精度/%vol 14.6 14.3 14.2 14.5 14.5
表2 不同灭菌条件下杨梅酒干浸出物含量
Table 2 Dry extract content of bayberry wine under different sterilization conditions
灭菌条件60 ℃20 s 60 ℃2 min 60 ℃5 min 60 ℃10 min 60 ℃20 min干浸出物含量/(g/L)24.3 24.3 24.2 25.4 25.1灭菌条件80 ℃20 s 80 ℃2 min 80 ℃5 min 80 ℃10 min 80 ℃20 min干浸出物含量/(g/L)24.5 24.5 24.5 25.3 24.5灭菌条件100 ℃20 s 100 ℃2 min 100 ℃5 min 100 ℃10 min 100 ℃20 min干浸出物含量/(g/L)24.9 24.8 25.3 25.0 23.8灭菌条件120 ℃20 s 120 ℃2 min 120 ℃5 min 120 ℃10 min 120 ℃20 min干浸出物含量/(g/L)24.7 24.7 24.7 25.2 23.4
由表1 和表2 可知,不同灭菌条件下的杨梅酒酒精度为13.9% vol~14.6% vol,干浸出物含量为23.4~25.4 g/L。对照样品的酒精度为14.4% vol,干浸出物含量为24.7 g/L。采用单样本t 检验,对样本平均值和对照样品测定值的差异进行分析。酒精度差异的显著性为0.073,干浸出物差异的显著性为0.698,均为不显著。由此可见,不同灭菌条件对样品酒精度和干浸出物含量影响不大。
L*值是反映样品亮度变化的指标(数值越大,颜色越亮),a*值是反映样品红色变化的指标(数值越大,颜色越红),b*值是反映样品黄蓝变化的指标(正数时数值越大,颜色越黄;负数时绝对值越大,颜色越蓝)。刚发酵完成的杨梅酒色泽鲜红诱人,随着陈酿时间的延长,杨梅酒颜色逐渐褐变暗淡,不同灭菌条件处理下杨梅酒颜色变化见图1。
图1 不同的灭菌条件对样品色值的影响
Fig.1 Effect of different sterilization conditions on color value of samples
由图1 可知,120 ℃加热5 min 以内,L*值更高,杨梅酒在亮度上稍占优势。5 min 后,不同加热温度下杨梅酒L*值均有所降低。120 ℃加热,在20 s 时,杨梅酒的红色色度较深,黄色色度较浅。杨梅酒保留了杨梅中的酚类物质,在多酚氧化酶和氧的作用下酚类物质容易形成醌聚合物,从而发生不同程度的褐变。高温短时的灭菌工艺使多酚氧化酶发生钝化,能在一定程度上遏制酶促褐变发生。但是加热时间延长,VC 氧化、氨基酸的美拉德反应等非酶促褐变便会加剧,这对杨梅酒呈色没有益处。相对来说,120 ℃加热20 s 的灭菌条件下杨梅酒颜色更佳。
杨梅汁pH 值较小,不利于一般微生物的生长,然而耐低pH 值和耐高糖特性的酵母菌则成了天然优势菌[26-27]。在杨梅酒生产过程中酵母菌是必不可少的,但这些天然的酵母菌并非均为有益菌,如酒香酵母属与德克酵母属的酵母通常会产生令人不愉快的风味。本试验对不同灭菌条件下微生物的杀灭效果进行测定发现,未灭菌的杨梅汁菌落总数测定值为63 CFU/mL、酵母菌2 834 CFU/mL、霉菌31 CFU/mL。60 ℃20 s 灭菌条件下杨梅汁中含有2 CFU/mL 菌落总数、104 CFU/mL酵母菌、2 CFU/mL 霉菌,没有达到理想的灭菌效果。其他灭菌条件下杨梅果汁菌落总数、霉菌、酵母菌均小于1 CFU/mL,灭菌效果均符合预期。这与田学智等[28]的研究结果相似。
所谓“无酸不成酒”,酸具有呈味作用,适量的酸可使杨梅酒口感活泼、爽口、协调。杨梅中含有大量的有机酸,其在发酵、陈酿过程中有机酸的种类和含量都会发生变化。研究表明杨梅酒的有机酸主要有柠檬酸、乳酸、苹果酸、乙酸等。不同的灭菌条件对杨梅酒中有机酸成分的影响见图2。
图2 不同的灭菌条件对柠檬酸、乳酸、苹果酸、乙酸含量的影响
Fig.2 Effect of different sterilization conditions on contents of citric acid,lactic acid,malic acid,and acetic acid
由图2 可知,柠檬酸含量最高,对杨梅酒酸味的贡献最大。相关性分析结果表示,柠檬酸含量与加热时间和加热温度相关性不显著,可能是因为杨梅酒的柠檬酸主要来源于杨梅果汁本身,与菌体糖酵解、三羧酸循环、苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)、乙酸发酵、酒精发酵等代谢途径较少关联。乳酸酸味柔和且带有稍许乳香味,是对果酒风味有益的不挥发酸。苹果酸有刺激性爽快的酸味,稍带苦涩味,呈味时间较长。高含量的苹果酸会导致酒体品质下降甚至酸败。MLF 也被称为二次发酵,是将苹果酸转化为乳酸,伴随产生二氧化碳和风味物质的步骤。该过程一般发生在酒精发酵之后,目的是让杨梅酒的口感变得更加柔顺细腻。相关性分析结果表示,乳酸与加热时间呈现显著的负相关,与加热温度不相关。苹果酸与加热时间呈现显著的正相关,与加热温度不相关。可见缩短加热时间有利于MLF。乙酸具有醋香味,一般果酒的含量为300~600 mg/L,当乙酸含量超过700 mg/L 时,醋味则变得明显。不同灭菌条件下杨梅酒中乙酸含量为288~508 mg/L,该值未超过产生不良风味的阈值。
酯类化合物是杨梅酒主要呈香、呈味物质,可赋予果酒果香和花香的属性。酯类化合物的保留在杨梅酒的酿造及调配工艺中至关重要。通过对杨梅酒中17 种酯类物质的检测,发现乙酸乙酯、乳酸乙酯是杨梅酒中的主要酯类化合物。不同灭菌条件对杨梅酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的影响结果见图3。
图3 不同的灭菌条件对乙酸乙酯、乳酸乙酯含量的影响
Fig.3 Effect of different sterilization conditions on contents of ethyl acetate and ethyl lactate
乙酸乙酯有菠萝香、苹果香,它是构成杨梅酒水果香气的主要物质。由图3 可知,2 min 内不同加热温度处理的杨梅酒乙酸乙酯含量下降趋势均不明显。2 min后其含量急剧下降。加热时间为20 min 时,乙酸乙酯含量下降至18.6~26.6 mg/L,然而未经加热处理对照样品的含量为101.9 mg/L。乳酸乙酯有朗姆酒、水果和奶油的香味,促使酒体浓厚丰满。加热时间20 s,不同温度的热处理工艺对乳酸乙酯含量影响不明显。加热时间为2 min 时,加热温度越高乳酸乙酯含量下降幅度越大。热处理工艺对杨梅酒酯类化合物影响很大,加热时间越长,加热温度越高,对酯类物质生成越不利,这可能与酯类化合物的前体物质如乙酸、乳酸在加热过程挥发和破坏有关。综上分析,在60、80、100、120 ℃不同温度下加热20 s 的热处理工艺能较好地保留杨梅酒酯类成分。
醇是发酵酒重要的香气化合物,它是醇甜的主要物质来源,也是酯类的前驱物质。大部分的醇类化合物的香气阈值较高,香气特征主要是水果香、花香和醇香。酵母能在有氧条件下把糖转化成醇,在厌氧条件下把氨基酸转化成醇。醛类物质也可能通过还原反应形成少量相应的醇[29]。本研究对杨梅酒9 种醇类物质开展检测,除乙醇外,检测到的醇类物质还有正丙醇、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇等杂醇油。杂醇油的毒性和麻醉力比乙醇强,且与碳链的长短有关,碳链越长毒性越强,以异丁醇和异戊醇的毒性为主。不同的灭菌条件对β-苯乙醇、正丙醇、异丁醇和异戊醇含量的影响见图4。
图4 不同的灭菌条件对β-苯乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇含量的影响
Fig.4 Effect of different sterilization conditions on contents of βphenylethanol,n-propanol,isobutanol,and isoamyl alcohol
由图4 可知,随着加热时间的延长,正丙醇、异丁醇的含量整体呈现下降的趋势,异戊醇含量整体呈上升的趋势。利用偏相关分析对测量结果进行分析,加热温度和β-苯乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇含量相关性不显著。加热时间和β-苯乙醇含量相关性不显著,但和正丙醇、异丁醇含量呈现显著的负相关,和异戊醇含量呈现显著的正相关。异戊醇含量3 591~6 816 mg/L,相对于其他杂醇油占比最大,对酒的品质影响较大。在60、80、100、120 ℃不同温度下加热20 s,异戊醇含量较低,对控制杂醇油的含量较为有利。
杨梅发酵酒独特的口感,与其含量丰富的游离氨基酸有关。氨基酸的呈味特性与其侧链R 基团的疏水性有密切关系。甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸呈甜味,亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸呈苦味,天门冬氨酸和谷氨酸则呈酸味和鲜味[30]。对照样品中游离氨基酸检测总量为76.6 mg/L,其中赖氨酸占比最高,为10.3 mg/L。亮氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸也是杨梅酒主要呈味氨基酸,其含量依次为8.8、8.2、8.1 mg/L。不同的灭菌条件对杨梅酒游离氨基酸含量的影响见图5。
图5 不同的灭菌条件对杨梅酒游离氨基酸含量的影响
Fig.5 Effect of different sterilization conditions on content of free amino acids in bayberry wine
由图5 可知,适当的加热有利于提高游离氨基酸的含量,60 ℃加热10 min、80 ℃加热2 min、100 ℃加热2 min、100 ℃加热5 min、120 ℃加热20 s 条件下处理的杨梅酒中游离氨基酸的含量均超过80 mg/L,相较于其他条件下处理的杨梅酒更占有优势,可能加热处理更加有利于蛋白质酶解形成游离氨基酸。
利用SPSS 主成分分析功能对不同灭菌工艺下的杨梅酒的重要品质指标(β-苯乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇、乳酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、游离氨基酸含量)进行降维统计。KMO 检验用于研究变量之间的相关性,本试验KMO 统计量为0.692,认为对样本进行的主成分统计分析可以接受。分析提取的两个公共因子累计方差贡献率为74.559%。分别对其进行加权求和,得到各个样品的综合得分,最终计算出指标的排序,见表3。
表3 重要品质指标主成分分析
Table 3 Principal component analysis of important quality indicators
灭菌条件60 ℃20 s 60 ℃2 min 60 ℃5 min 60 ℃10 min 60 ℃20 min综合得分0.418 9 0.521 3 0.409 4 0.093 1-0.669 9排序7681 0 16灭菌条件80 ℃20 s 80 ℃2 min 80 ℃5 min 80 ℃10 min 80 ℃20 min综合得分0.900 3 0.588 8 0.010 2-0.698 3-0.743 0排序151 1 17 19灭菌条件100 ℃20 s 100 ℃2 min 100 ℃5 min 100 ℃10 min 100 ℃20 min综合得分0.853 1 0.630 0-0.597 9-0.777 6-0.730 4排序241 3 20 18灭菌条件120 ℃20 s 120 ℃2 min 120 ℃5 min 120 ℃10 min 120 ℃20 min综合得分0.821 0 0.366 7-0.105 0-0.669 5-0.621 3排序391 2 15 14
由表3 可知,80 ℃20 s、100 ℃20 s、120 ℃20 s、100 ℃2 min、80 ℃2 min 灭菌条件下生产的杨梅酒综合得分较高,有机酸、游离氨基酸等营养物质丰富,醇类、酯类等香气成分比例协调,此条件下生产的杨梅酒品质最为突出。
未来果酒行业一定会是兼具“健康”与“美味”发展方向。由于酿造工艺的复杂性,杨梅发酵酒在生产过程中往往会造成香气损失、感官下降、营养成分流失等现象,因此亟需建立以品质导向为基础的发酵果酒调控技术。本试验采用不同条件灭菌的杨梅果汁发酵杨梅酒,并研究不同的灭菌条件对杨梅发酵酒酒精度、色值、有机酸、酯类物质、醇类物质、营养成分含量的影响。结果表明,不同的灭菌条件对酒精度、干浸出物含量等理化指标无显著影响。加热时间对主要有机酸、酯类物质、醇类物质的保留有显著的影响,加热时间控制为20 s,更有利于有益组分的转化和保留。在120 ℃下加热灭菌20 s,呈色效果较好。综合考虑,80 ℃20 s、100 ℃20 s、120 ℃20 s、100 ℃2 min、80 ℃2 min 灭菌条件下生产的杨梅酒品质较佳。灭菌工艺对杨梅酒成分改变的研究可为杨梅酒产品的研发、品质提升提供数据参考。
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