3 种食用菌多糖的抗氧化活性和抑菌能力比较

多糖、活性蛋白等是食用菌的主要活性物质，研究证实这些活性物质具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、增强免疫等功能[1]。食用菌多糖的抗氧化活性主要通过清除自由基能力的强弱体现。机体在整个代谢进程中产生大量的自由基，而当自由基在机体产生的数量超出了机体自身能够清除的数量时，将造成机体内蛋白质变性、细胞解体、生物膜结构破坏，甚至可能引起机体病变和导致机体的死亡[2]。许多天然物质具有抗氧化能力，近年来，食用菌多糖的抗氧化活性研究引起了广泛关注[3]，例如有学者从白灵菇[4]、秀珍菇[5]等食用菌中提取多糖，发现其对于机体中的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基、超氧阴离子自由基等有明显的清除效果。张博华等[6]以大球盖菇、金针菇、香菇3 种食用菌为原料提取真菌多糖，发现这3 种多糖均具有抗氧化活性，并且3 种真菌多糖之间抗氧化活性存在一定的强弱关系。

食用菌多糖除了具有较好抗氧化活性，还具备抑菌活性，是环境友好型天然抑菌剂来源。近些年，对于食用菌多糖抑菌作用研究不断深入，李向阳等[7]从原木花菇和袋栽花菇的香菇子实体中提取多糖，并对常见致病菌进行抑菌试验，发现香菇多糖对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有一定的抑菌作用，并且原木花菇中的香菇多糖抑菌效果更好；罗敬文等[8]以3 种木耳为原材料提取多糖并对多糖的生理活性进行研究，发现玉木耳、毛木耳、黑木耳多糖均具有抑菌活性，并且不同品种的木耳多糖所抑制的菌属具有一定的差异。以上研究对不同培养基质、不同类型的食用菌抑菌能力进行了比较，但不同品种的食用菌多糖抑菌能力研究较少，因此有必要对常见食用菌多糖的抑菌和抗氧化活性进行比较研究，以充分利用食用菌多糖抗氧化活性和抑菌活性，促进食用菌活性多糖的应用和相关产品开发。

本研究以金针菇、银耳和黑木耳3 种食用菌为原料，通过热水浸提法制备食用菌多糖，对3 种多糖抗氧化活性与抑菌活性进行比较分析，以期为金针菇、银耳和黑木耳多糖抗氧化与抑菌产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳、银耳：市售；金针菇冻干粉：北京绿友食品有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌：广东省微生物菌种保藏中心；水杨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司；邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris）：无锡市亚秦联合有限公司；30% H2O2 试剂、铁氰化钾、三氯乙酸、过硫酸钾：天津市巴斯夫化工有限公司；盐酸试剂、三氯化铁：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸亚铁：天津市致远化学试剂有限公司；无水乙醇：广州市科玛化学技术有限公司；DPPH、2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：合肥千盛生物科技有限公司；牛肉膏蛋白胨培养基：上海博唯生物科技有限公司。以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

420C 型电热恒温水温箱、RE-52AA 型旋转蒸发器：北京伊诺泰仪器设备有限公司；L-80-XP 型离心机：北京市永光明医疗仪器有限公司；722N 型可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；UY120 型电子天平：上海精科科技有限公司；QHX-250BSH-Ⅲ型生化培养箱：上海圣科仪器设备有限公司；Z10 型抑菌圈（抗生素效价）测量仪：重庆川东化工有限公司；DHG-9023A 型烘箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食用菌多糖的制备

食用菌多糖的制备参考魏华等[9]的方法，略作改动。黑木耳、银耳粉碎过60 目筛备用。分别称取30 g 银耳、黑木耳、金针菇粉末，采用热水浸提法，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸馏水，并于90 ℃水浴3 h。水浴结束后，5 000 r/min 离心15 min 取上清液，旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，加入3 倍体积无水乙醇沉淀，4 ℃静置过夜，5 000 r/min 离心10 min 后收集沉淀，置于50 ℃烘箱内烘干24 h，获得食用菌多糖。

1.3.2 食用菌多糖抗氧化活性测定

1.3.2.1 DPPH 自由基清除能力测定

DPPH 自由基清除能力测定参照文献[10-11]方法并略作改动。分别吸取2 mL 不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的3 种食用菌多糖溶液于试管中，依次加入0.16 mmol/L 的DPPH 溶液2 mL，经振荡摇匀后置于25 ℃水浴锅内30 min，在波长为517 nm 处测定试样吸光度。DPPH 自由基清除率（X，%）根据下列公式计算。

式中：A0 为蒸馏水代替样品的吸光度；A1 为不同质量浓度样品的吸光度；A2 为蒸馏水和DPPH 混合溶液的吸光度。

1.3.2.2 超氧阴离子自由基清除能力测定

参考Yan 等[12]的方法，并略作改动。分别吸取2 mL不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的3 种食用菌多糖溶液于试管中，依次加入0.2 mol/L、pH8.2 的Tris-HCl 缓冲液2 mL，经振荡摇匀后置于37 ℃水浴锅内加热30 min，然后加入1 mL 已在37 ℃水浴预热2 min 的7 mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液并摇匀，5 min 后测定其在波长320 nm 处的吸光度。超氧阴离子自由基清除率（Y，%）按照下列公式计算。

式中：A1 为蒸馏水代替样品的吸光度；A2 为不同质量浓度样品的吸光度。

1.3.2.3 羟基自由基清除能力的测定

羟基自由基清除能力参考文献[13-14]方法，并略作修改。取2 mL 浓度为6 mmol/L 的硫酸亚铁（FeSO4）溶液和2 mL 浓度为6 mmol/L 的过氧化氢（H2O2）溶液混合，使其发生反应，生成羟基自由基。分别吸取2 mL不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的3 种食用菌多糖溶液于试管中，依次加入2 mL 浓度为6 mmol/L的水杨酸液，振荡摇匀后放置于37 ℃水浴锅中加热30 min，测定其在波长510 nm 处的吸光度。羟基自由基清除率（P，%）根据下列公式计算。

式中：A0 为蒸馏水代替样品的吸光度；A1 为不同质量浓度样品的吸光度；A2 为用蒸馏水代替H2O2 的吸光度。

1.3.2.4 ABTS+自由基清除能力的测定

参考Chen 等[15]的方法，并稍作改动。将等体积7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 的K2S2O8 溶液混匀，在避光条件下保存15 h 获得ABTS 储备液。将ABTS 储备液用10 mmol/L、pH7.4 的磷酸盐缓冲液稀释至波长734 nm 处吸光度在0.700±0.020 之间，获得ABTS 测定液，现配现用。分别吸取2 mL 不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的3 种食用菌多糖溶液于试管中，依次加入2 mL ABTS 测定液，经振荡摇匀后在室温、避光条件下反应6 min，立即测定其在波长734 nm 处的吸光度。ABTS+自由基清除率（M，%）计算公式如下。

式中：A0 为蒸馏水替代样品的吸光度；A1 为不同质量浓度样品的吸光度；A2 为磷酸盐缓冲液代替ABTS+处理样品的吸光度。

1.3.3 食用菌多糖抑菌能力的测定

食用菌多糖抑菌能力参考文献[16-20]测定，并略作改进。用接种环将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌接种在备好的斜面培养基中，37 ℃恒温培养24 h 进行活化。使用无菌水将已活化好的菌种进行稀释，并制备成菌悬液。依次用移液枪移取0.2 mL 每种菌的菌悬液，加在已制备好的牛肉膏蛋白胨固体培养基表层上，并涂布均匀。将3 种食用菌多糖溶液进行稀释，依次配制成浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的多糖溶液。并将已消毒和烘干的滤纸片分别浸泡在无菌水和多糖溶液中，随后轻置于培养基表面，将培养皿放于37 ℃电热恒温水温箱中恒温培养24 h，观察并测量培养皿中抑菌圈直径。每个菌种做3 次平行测定，并取平均值。

1.4 数据处理

采用Origin 2018 分析软件对数据进行分析，试验结果均为3 次试验的平均值，试验结果用平均值±标准差表示。采用SPSS Statistics 20 统计软件，用t 检验比较两种处理样品间的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 食用菌多糖抗氧化活性对比分析

2.1.1 食用菌多糖对DPPH 自由基的清除作用

3 种不同浓度的食用菌多糖对DPPH 自由基清除效果如图1 所示。

由图1 可知，金针菇、银耳和黑木耳多糖对DPPH 自由基清除率随浓度增加而增加。浓度为0.1~0.6 mg/mL时，3 种食用菌多糖对DPPH 自由基清除能力由高到低依次为金针菇多糖>黑木耳多糖>银耳多糖；浓度为0.8~1.0 mg/mL 时，金针菇多糖对DPPH 自由基的清除作用最强，并且清除能力与其余浓度条件时相比变化最大；浓度为0.8 mg/mL 时，金针菇多糖与银耳多糖的DPPH 自由基清除率均达到80%以上，黑木耳多糖的清除率达到70% 以上。当3 种多糖溶液浓度达到1.0 mg/mL 时，3 种多糖溶液对于DPPH 自由基的清除能力相当，均高于89%，金针菇多糖DPPH 自由基清除率最高，达到90.7%。结果表明，3 种食用菌多糖溶液对DPPH 自由基有明显的清除作用，并且金针菇多糖对DPPH 自由基清除能力最强。

2.1.2 3 种食用菌多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

3 种不同浓度的食用菌多糖对超氧阴离子自由基的清除作用如图2 所示。

由图2 可知，随多糖溶液浓度的增加，3 种食用菌多糖溶液对于超氧阴离子自由基的清除作用增强。与DPPH 自由基清除活性相似，浓度为0.2~0.4 mg/mL时，黑木耳多糖的超氧阴离子自由基清除率最高，其次为金针菇多糖，银耳多糖清除率最低；浓度为0.4~1.0 mg/mL 时，3 种多糖的超氧阴离子自由基清除率由高到低依次是黑木耳多糖>金针菇多糖>银耳多糖。

2.1.3 3 种食用菌多糖对羟基自由基的清除作用

3 种食用菌多糖对羟基自由基的清除率见图3。

由图3 可知，3 种食用菌多糖对羟基自由基的清除能力随着浓度的增加而提高。在浓度为0.1 mg/mL时，金针菇多糖与黑木耳多糖对羟基自由基的清除率较强，均达到60% 以上，但银耳多糖羟基自由基清除率仅达40%以上，清除作用最差。当浓度为0.2~1.0 mg/mL 时，3 种多糖对羟基自由基的清除率由高到低依次为银耳多糖>金针菇多糖>黑木耳多糖。当浓度为1.0 mg/mL 时，三者对羟基自由基的清除率均较高，达到了95%以上。

2.1.4 3 种食用菌多糖对ABTS+自由基的清除效果

3 种不同浓度食用菌多糖对ABTS+自由基清除效果如图4 所示。

由图4 可知，3 种食用菌多糖的清除作用随着浓度的增加而增强。当3 种食用菌多糖浓度为1.0 mg/mL时，对ABTS+自由基清除率均在77% 以上；黑木耳多糖对ABTS+自由基的清除作用较其它两种更好，总体趋势是先增强后趋于平缓，ABTS+自由基清除率最高达到94.71%。

2.2 3 种食用菌多糖抑菌作用比较分析

通过测定3 种食用菌多糖对4 种常见致病菌的抑菌圈直径来判断抑菌活性，结果如表1 所示。

由表1 可知，3 种食用菌多糖均具有抑菌活性，且抑菌活性随浓度增加而增强。当多糖溶液浓度为0~1.5 mg/mL 时，4 种病原菌抑菌圈直径增大，表明抑菌效果增强。在此浓度下，黑木耳多糖对蜡样芽孢杆菌的抑制效果最为明显，银耳多糖对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性较强。当多糖浓度为1.5~2.0 mg/mL时，金针菇多糖对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果较好，对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果稍弱；黑木耳多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的抑菌效果增强，但对枯草芽孢杆菌抑菌效果减弱；银耳多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效果减弱，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果增强。总体而言，金针菇多糖对大肠杆菌的抑菌能力最强，黑木耳多糖对蜡样芽孢杆菌的抑菌能力最强，银耳多糖对枯草芽孢杆菌抑制能力最强。

3 结论

本研究以金针菇、黑木耳和银耳为原料，利用水提醇沉法提取3 种食用菌多糖。通过测定3 种食用菌多糖对DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基和ABTS+自由基的清除率，以及对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌4 种常见致病菌的抑菌圈直径，分析3 种食用菌多糖抗氧化活性和抑菌能力。结果表明，3 种食用菌多糖均具有抗氧化活性，并且多糖对于自由基的抗氧化活性具有剂量依赖性，金针菇多糖对DPPH 自由基的清除效果较好，黑木耳多糖对超氧阴离子自由基和ABTS+自由基的清除效果较好，银耳多糖对羟基自由基的清除效果较好；3 种食用菌多糖具有抑菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果与多糖浓度呈正相关，对蜡样芽孢杆菌的抑制效果较差；银耳多糖对枯草芽孢杆菌的抑制效果随浓度上升而增强，黑木耳多糖、金针菇多糖对枯草芽孢杆菌的抑制效果在0~1.5 mg/mL 随着浓度的增高而增强。3 种食用菌多糖均具有较强的抗氧化活性和抑菌活性，但是不同品种的食用菌多糖抗氧化效果和抑菌作用有明显区别，且对不同菌种的抑制作用也不同。食用菌多糖可以作为潜在的食品抗氧化剂和防腐剂。

[1] 温泉,王锡昌.食用菌风味物质的研究及应用进展[J].长江大学学报B(自然科学版),2006,3(4):211-213,229.WEN Quan, WANG Xichang. Progress in flavor research of edible fungus and its application[J].Journal of Yangtze University B:Natural Science Edition,2006,3(4):211-213,229.

[2] PRAMANIK M, CHAKRABORTY I, MONDAL S, et al. Structural analysis of a water-soluble glucan (Fr.I) of an edible mushroom,Pleurotus sajor-caju[J]. Carbohydrate Research, 2007, 342(17):2670-2675.

[3] LEE Y L,YEN M T,MAU J L.Antioxidant properties of various extracts from Hypsizigus marmoreus[J].Food Chemistry,2007,104(1):1-9.

[4] 王耀辉.白灵菇多糖提取工艺优化及其抗氧化活性研究[D].太原:山西大学,2017.WANG Yaohui. Optimization of extraction process of polysaccharide from Pleurotus nebrodensis and its antioxidant activity[D]. Taiyuan:Shanxi University,2017.

[5] 陈芙蓉.秀珍菇多糖提取、纯化及其抗氧化活性研究[D].福州:福建农林大学,2014.CHEN Furong.Study on extraction,purification and antioxidant activity of polysaccharide from Pleurotus geesteranus[D].Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University,2014.

[6] 张博华,张明,范祺,等.三种食用菌多糖及其复合多糖功能性评价研究[J].中国果菜,2021,41(6):74-79.ZHANG Bohua, ZHANG Ming, FAN Qi, et al. Study on functional evaluation of three kinds of edible fungus polysaccharides and their compound polysaccharides[J]. China Fruit ＆ Vegetable, 2021, 41(6):74-79.

[7] 李向阳,胡一鸿,韦翔华,等.原木花菇与袋栽花菇中香菇多糖抗氧化和抑菌能力比较[J].湖南农业科学,2009(11):129-132.LI Xiangyang,HU Yihong,WEI Xianghua,et al.Comparison of antioxidative and antimicrobial abilities of lentinan between wood planting flower-mushroom and bag planting flower-mushroom[J].Hunan Agricultural Sciences,2009(11):129-132.

[8] 罗敬文,司风玲,顾子玄,等.3 种木耳多糖的抗氧化活性与抑菌能力比较分析[J].食品科学,2018,39(19):64-69.LUO Jingwen, SI Fengling, GU Zixuan, et al. Antioxidant and antimicrobial activities of polysaccharides from three species of Auricularia[J].Food Science,2018,39(19):64-69.

[9] 魏华, 张娣, 陆玲, 等. 几种食用菌多糖的提取与抗氧化性研究[J].南京师大学报(自然科学版),2017,40(2):72-75,88.WEI Hua, ZHANG Di, LU Ling, et al. Extraction, purification and antioxidant activities of several polysaccharides from edible and medicinal fungi[J]. Journal of Nanjing Normal University (Natural Science Edition),2017,40(2):72-75,88.

[10] CHEUNG L M, CHEUNG P C K, OOI V E C. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts[J]. Food Chemistry,2003,81(2):249-255.

[11] 王莹,邢晓玲,李屿君,等.香菇多糖脱蛋白工艺及其抗氧化活性研究[J].食品研究与开发,2020,41(14):98-103.WANG Ying, XING Xiaoling, LI Yujun, et al. Study on de-protein technology and antioxidant activity of lentinan[J]. Food Research and Development,2020,41(14):98-103.

[12] YAN J M, ZHU L, QU Y H, et al. Analyses of active antioxidant polysaccharides from four edible mushrooms[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019,123:945-956.

[13] 马晓华,连宾.几种常见食用菌清除羟基自由基能力的研究[J].食品与发酵工业,2005,31(10):25-28.MA Xiaohua, LIAN Bin. Hydroxyl radical scavenging activities of several kinds of edible fungi[J]. Food and Fermentation Industries,2005,31(10):25-28.

[14] WANG H,GAO X D,ZHOU G C,et al.In vitro and in vivo antioxidant activity of aqueous extract from Choerospondias axillaris fruit[J].Food Chemistry,2008,106(3):888-895.

[15] CHEN G J,FANG C C,RAN C X,et al.Comparison of different extraction methods for polysaccharides from bamboo shoots(Chimonobambusa quadrangularis) processing by-products[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019,130:903-914.

[16] 吴存兵,吴君艳,李家春,等.黑乌龙茶茶多糖提取工艺的优化及其抗氧化与抑菌性分析[J]. 安徽农业大学学报, 2021, 48(6):1005-1012.WU Cunbing, WU Junyan, LI Jiachun, et al. Optimized extraction condition of tea polysaccharide from dark oolong tea and analysis of its antioxidant and antibacterial activity[J]. Journal of Anhui Agricultural University,2021,48(6):1005-1012.

[17] 龙杰凤,胡秀虹,范成念,等.黔产生黄精多糖的抑菌活性研究[J].贵州科学,2022,40(1):5-9.LONG Jiefeng,HU Xiuhong,FAN Chengnian,et al.Study on antibacterial activity of polysaccharide in Polygonatum from Guizhou[J].Guizhou Science,2022,40(1):5-9.

[18] ZHAO Z W, WANG L, RUAN Y, et al. Physicochemical properties and biological activities of polysaccharides from the peel of Dioscorea opposita Thunb. extracted by four different methods[J].Food Science and Human Wellness,2023,12(1):130-139.

[19] AYUB M A, CHOOBKAR N, HANIF M A, et al. Chemical composition, antioxidant, and antimicrobial activities of P. roxburghii oleoresin essential oils extracted by steam distillation, superheated steam, and supercritical fluid CO2 extraction[J]. Journal of Food Science,2023,88(6):2425-2438.

[20] BENEK A , CANL K , ALTUNER E M .Antimicrobial and antioxidant activities of some mosses[J].Anatolian Bryology, 2023, 9(1):42-49.