抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是具有天然防御细菌能力和抵抗耐药细菌的一类小分子肽，是自然免疫系统的重要组成部分，在植物、动物、昆虫和微生物中广泛存在[1]。在植物AMPs 中，防御素因其广谱抗菌特性而备受关注[2]。与一级结构相比，防御素的三维结构高度稳定，由1 个二硫化物稳定的αβ（Csαβ）基序[3]、1 个突出的α-螺旋[4]和1 个三重反平行β-折叠组成[5]。根据报告，防御素序列中还有一个重要的核心碱基序列（GXCX3-9c），对抗菌活性有重要贡献。研究指出，防御素通常被认为对哺乳动物和植物细胞无毒[6]。AMPs 对细菌有不同的作用方式，一些抗菌肽通过渗透细胞膜杀死这些细菌[7-8]，而其他抗菌肽则与细菌细胞内的大分子作用[9-10]。因此，植物防御素具有抗生素替代品的开发利用价值[11]。
天然抗菌肽序列丰富，功能多样，但由于结构差异，抗菌肽的抗菌活性和分子功能存在较大差异。一般通过改变抗菌肽的电荷、两亲性、螺旋性和特殊氨基酸的数量，以及基因工程和定点突变对其定向改良[12]。Fimland 等[13]发现色氨酸残基在膜相互作用肽中发挥了特殊作用。Kazazicm 等[14]提出N 端抗菌肽的带电残基可能通过细菌素与靶细胞结合而影响细胞特异性[14]。Ju 等[15]诱导氨基酸残基突变和新型细菌素Durancin GL 的逆行位点诱导突变，发现3 个突变体失去了抗菌活性，10 个突变体的活性降低，7 个突变体的活性更高。抗菌肽的活性可以通过在一定范围内增加正电荷数[16]、C 末端疏水性和特殊氨基酸的变化来增加[17-19]。Ahn 等[20]用碱性氨基酸赖氨酸取代了亲水部位的天冬氨酸和组氨酸，在增加正电荷的同时保留疏水螺旋结构。
2013 年，首次从墨西哥鳄梨果实中分离到了鳄梨防御素（PaDef）[21]。PaDef 由45 个氨基酸组成，生物信息 学 分 析 表 明，重 组PaDef（recombination PaDef，rPaDef）作为一种防御素，其氨基酸序列与其他植物防御素具有80%的同源性，由1 个稳定的Csαβ 基序（半胱氨酸稳定的αβ 基序）、1 个α-螺旋和3 个反向β-折叠以及它们之间的环形域组成。rPaDef 此前已成功在毕赤酵母GS115 中表达，其对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出良好的抗菌活性[22]，rPaDef 的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）为50～80 μg/mL，具有良好的热稳定性、pH 稳定性和蛋白酶稳定性。不仅如此，rPaDef 具有较低的人血、鸡血和鼠血溶血性和较低的动物细胞毒性，即安全性良好，这些结果均可证明rPaDef 抗菌肽具有巨大的应用前景[22]。本研究旨在通过定向分子改良获得抗菌活性更高、稳定性更强以及具有较高生物安全性的改良肽。
1 材料与方法
1.1 材料
pPICZαA-rPaDef、pPICZαA-rPaDefT3R、pPICZαArPaDefD29R、pPICZ α A-rPaDefQ33H、pPICZ α A-rPa-DefK43M 等质粒：天津科技大学营养代谢性疾病研究实验室制备保存；Pichia pastoris 菌株GS115：Invitrogen公司；Listeria monocytogenes（ATCC 21633）、Staphylococcus aureus（ATCC 25923）、Escherichia coli O157（ATCC 35150）和Salmonella enterica（ATCC 10467）：美国菌种保藏中心（http：//www.atcc.org/）； 人红细胞、鸡红细胞、小鼠红细胞：苏州汇智和源生物技术有限公司；Ni SepharoseTM 6 fast flow 树脂：GE Healthcare 公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）：美国Gibco 公司；戊二醛（分析纯）：福州飞净生物科技有限公司；碘化丙啶：美国Sigma 公司。
1.2 仪器与设备
Bio-Rad 小型垂直电泳转印系统：伯乐Bio-Rad 公司；neon nxt 细胞电转染系统、SpectraMax iD3 / iD5 多功能酶标仪、GENESYS 180 紫外分光光度计：赛默飞世尔科技公司；Tm4000 扫描电子显微镜：日本日立公司；BX-53 荧光显微镜：日本Olympus 公司；DNP-9022恒温培养箱：上海精其仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 rPaDef 改良肽的载体构建和抗菌肽筛选
通过比较rPaDef 序列与其他防御素序列确定保守区域，通过Discovery Studio 4.5 预测抗菌肽结构[23]，通过定向改变净电荷、亲疏水性等性质，设计了4 个改良肽（rPadefT3R、rPadefD29R、PadefQ33H 和rPadefK43M）。利用定点突变构建并鉴定正确序列的质粒。经限制性内切酶（ByFastSacI Endonuclease， Sac I）线性化，利用电穿孔法将其转入宿主菌Pichia pastoris GS115。通过菌落聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）选择阳性克隆体，经甲醇诱导表达后，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）验证重组抗菌肽的表达[22]。
1.3.2 重组抗菌肽的亲和纯化
诱导表达的上清液与结合缓冲液按照1∶3 的体积比混合，并在4 ℃条件下结合，分别使用含20、40、60 mmol/L 咪唑的溶液梯度漂洗，用含500 mmol/L 咪唑的洗脱液洗脱，利用超滤管去除洗脱液中的咪唑后冷冻干燥，保存于-80 ℃以备后续使用。
1.3.3 抗菌活性测定
根据临床和实验室标准测定其抗菌活性[22]。抑菌能力通过测量最小抑菌浓度和抑菌圈直径来表示。将培养至对数期（OD600=1.0）的受试菌稀释1 000 倍，将冻干的抗菌肽用置换缓冲液稀释至不同浓度，在96 孔板中添加20 μL 的抗菌肽样品和100 μL 的受试菌稀释液，封口膜密封后在37 ℃培养16～24 h，酶标仪线性振荡30 s 测定595 nm 处的吸光度。细菌抑制率（I，%）计算公式如下，每组反应设置3 个平行。
式中：A1 为同时加入PBS 和受试菌稀释液的吸光度；A2 为同时加入庆大霉素和受试菌稀释液的吸光度；A3 为同时加入rPaDef 改良肽和受试菌稀释液的吸光度。
将培养至对数期（OD600=1.0）的受试菌稀释100 倍，取500 μL 均匀涂布于LB 平板上，用直径6 mm 的金属打孔器在平皿适当的位置打孔，用移液枪吸取50 μL 的抗菌肽注入孔内。抑菌试验时，用50 μg/mL的庆大霉素作为阳性对照。于37 ℃恒温培养箱中，正置培养6～8 h，观察抑菌圈的大小，拍照并测量抑菌圈直径。
1.3.4 抗菌肽的稳定性和安全性测定
在不同温度（4、25、37、65、90 ℃）和不同种类蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K）的条件下检测1×MIC 浓度的重组抗菌肽抑菌效果，结果用抑菌圈直径表示。用纯化后的抗菌肽处理人红细胞、鸡红细胞和小鼠红细胞（37 ℃，1 h）。PBS 和0.2% 的Triton X-100 分别用作阴性和阳性对照。在576 nm 处测量释放的血红蛋白的吸收。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-zy1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT]法测定肽及其突变体对HEK293 和BHK21 细胞系的毒性。所有试验均设置3 个平行。
1.3.5 抗菌肽的抗菌机制研究
受试菌株在LB 培养基中生长至对数期，用PBS漂洗菌体。将菌株与120 μg/mL 的AMPs 在37 ℃下共同孵育1 h，PBS 作为阴性对照。孵育后的样品在100 μL 的戊二醛中于4 ℃固定过夜，利用不同浓度的乙醇溶液（25%、50%、70%、80%、90% 和无水乙醇）进行脱水，每次10 min，最终溶解在10 μL 无水乙醇中，置于盖玻片上进行干燥后表面喷金，并通过扫描电子显微镜（scanning electron microscope， SEM）进行观察。
荧光显微镜样品，取对数期的受试菌与重组抗菌肽孵育后，与碘化丙啶（propidium iodide， PI）（1 mg/mL，使用时稀释1 000 倍）在37 ℃下孵育30 min，利用PBS洗去残余的PI 染料后制片，在荧光显微镜下观察。
1.4 统计分析
所有数据均以平均值±标准差表示。使用IBM SPSS 21.0 中的单向方差分析和邓肯多范围检验进行统计分析。P＜0.05 被认为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 改良抗菌肽的设计
为寻找PaDef 的改良位点，首先对与美洲鳄梨密切相关物种的植物防御素抗菌肽进行蛋白序列对比，结果见图1。
图1 PaDef 与其他植物防御素的序列比对
Fig.1 Sequence alignment of PaDef and other plant defensins
C 为半胱氨酸（cysteine）；G 为甘氨酸（glycine）；S 为丝氨酸（serine）；P 为苯丙氨酸（phenylalanine）；A 为天冬氨酸（asparagine）；α 为α 螺旋部位；
β、β1、β2 为β 折叠部位
表示相似度较差。
通过rPaDef 与来自密切相关物种的其他植物防御素的多序列比对结果可知，PaDef 的部分序列与其他防御素的序列高度保守，包括典型的7 个保守半胱氨酸残基、3 个甘氨酸残基、1 个丝氨酸残基、1 个苯丙氨酸残基和1 个天冬酰胺残基，从结构上看，这些保守的氨基酸都存在1 个α 螺旋和3 个反向β 折叠部位，可能与防御素的抗菌活性有关，因此将这些位置的氨基酸进行突变以期待能够得到抗菌活性增加的改良肽。
2.2 rPaDefT3R 与rPaDefD29R 的结构预测结果
由于通过静电荷的改变可增强防御素的活性，分别在rPaDef 的3 号苏氨酸位及29 号天冬氨酸位，对rPaDef 进行点突变获得两种突变蛋白即rPaDefT3R 与rPaDefD29R，使用Discover Studio 4.5 对两种蛋白结构进行预测，结果如图2 所示。
图2 蛋白质表面根据电荷势着色
Fig.2 Protein surface coloring based on charge potential
方框表示在三维结构中3 号苏氨酸所在的位置。
图2 结果显示，将第3 位的苏氨酸（threonine， T）点突变为精氨酸（arginine， R）获得改良肽（reform PaDef T replace R in 3 site，rPaDefT3R），rPaDefT3R 增加了1 个PaDef 净电荷（+4～+5）。此外，将29 位的天冬氨酸（aspartic acid， D）突变为精氨酸，获得改良肽（reform PaDef D replace R in 3 site，rPaDefD29R）增加了2 个PaDef 净电荷（+4～+6）。
2.3 rPaDefK43M 的结构预测结果
疏水基的改变同样可增强防御素的活性，而且在PaDef 的C 端除了43 位的赖氨酸其余7 个氨基酸均是疏水性基团，据此本研究对PaDef 的43 位赖氨酸点突变为蛋氨酸获得rPaDefK43M，使用Discover Studio 4.5 对rPaDefK43M 蛋白结构进行预测，结果如图3所示。
图3 蛋白质表面分别根据亲疏水性和电荷势着色
Fig.3 Protein surface coloring based on hydrophobicity and charge potential
方框表示在三维结构中43 位赖氨酸所在的位置。
图3 结果显示，将43 位赖氨酸突变为蛋氨酸（methionine， Met）获得改良肽（reform PaDef K replace R in 43 site，rPaDefK43M），同时降低了净电荷（+4～+3），增加了C 末端的疏水性。
2.4 rPaDefQ33H 的结构预测结果
亲水基的改变可增强防御素的活性，将33 位的谷氨酰胺突变为组氨酸获得改良肽rPaDefQ33H 以增强表面亲水性而不改变净电荷，使用Discover Studio 4.5对rPaDefQ33H 蛋白结构进行预测，结果如图4 所示。
图4 蛋白质表面根据亲疏水性和氢键着色
Fig.4 Protein surface coloring based on hydrophilicity and H
bond
方框表示在三维结构中33 位的谷氨酰胺所在的位置。
图4 结果显示，将33 位的谷氨酰胺（glutamine， Q）突变为组氨酸（histidine，H）获得改良肽（reform PaDef Q replace H in 43 site，rPaDefQ33H）通过Discover Studio 4.5 预测结果显示，这种组氨酸可以与PaDef 结构中的49 位精氨酸（arginine 49，Arg49）、50 位精氨酸（arginine 49，Arg49）和47 位缬氨酸（valine 47，Val47）形成离子键。
2.5 rPaDef 及其突变质粒真核表达鉴定结果
将重组PaDef（rPaDef）及其突变质粒及其突变质粒转入毕赤酵母GS115 进行真核表达，根据选择的突变位点，设计引物进行PCR 扩增，经SDS-PAGE-Tricine 电泳验证目的条带大小正确性，条带灰度值使用Image J 进行分析，鉴定及分析结果如图5 所示。
图5 几种改良肽的表达量分析
Fig.5 Analysis of expression levels of several modified peptides
**表示差异显著 （P＜0.05）；n.s.表示无显著差异。
图5 显示，rPaDef 及其改良肽均能正常表达，对条带的灰度分析表明，突变体rPaDefT3R 和rPaDefK43M的蛋白表达水平高于rPaDef。
2.6 rPaDef 及其改良肽对不同细菌菌株的MIC 检测结果
对rPaDef 及其改良肽的抑菌效果进行检测，各改良肽对受试菌株的MIC 检测结果如表1 与图6 所示。
表1 rPaDef 及其改良肽的MIC 测定
Table 1 MIC determination of rPaDef and modified peptides
受试菌株MIC /（μg/mL）rPaDef 60 rPaDefT3R 40 rPaDefD29R 40 rPaDefQ33H 20 rPaDefK43M 20 60 60 20 20 L.monocytogenes（ATCC 221633）S. aureus（ATCC 25923）E. coli O157（ATCC 35150）S. enterica（ATCC 10467）70 60 40 60 20 20 40 40 60 40 20
图6 rPaDef 及其改良肽对于几种受试菌的抑制能力
Fig.6 Inhibition ability of rPaDef and modified peptides against several tested bacteria
a、e 为S. aureus（ATCC 25923）；b、f 为L.monocytogenes（ATCC 221633）；c、g 为S. enterica（ATCC 10467）；d、h 为E. coli O157（ATCC 35150）。*表示差异显著 （P＜0.05）； **表示极显著 （P＜0.01）； ***表示差异非常显著 （P＜0.001）； ****表示差异高度显著（P＜0.000 1）；n.s.表示无显著差异。
表1 显示，rPaDef 对单增李斯特杆菌（L. monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S. aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli， E. Coli）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis， S. enterica）有不同程度的抑制作用。并且定向改良后的PaDef 的抑菌能力会不同程度的提高，MIC 为20～60 μg/mL，其中rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 显示出高于rPaDef 1～2 倍的抗菌活性。
图6 结果显示，改良肽对于不同种类的受试细菌抑菌能力进行检测时，改良肽rPaDefQ33H 和rPaDefK43 M 处理后的抑菌圈直径也明显大于PaDef、rPaDefT3R和rPaDefD29R，这也表明改良肽rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 的抗菌效果要优于其它改良肽，因此后续试验主要围绕这两种改良肽进行研究。
2.7 PaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 的杀菌动力学检测结果
PaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 的杀菌动力学检测结果如图7 所示。
图7 rPaDef 及其改良肽杀菌能力
Fig.7 Bactericidal ability of rPaDef and modified peptides
图7 显示，与PBS 阴性对照组相比，重组抗菌肽PaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 在作用180 min 后能将菌落数从4.3 lg（CFU/mL）降至3.1 lg（CFU/mL），而庆大霉素处理后40 min 后菌落数从4.3 lg（CFU/mL）降 至0 lg（CFU/mL）。因 此，PaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 是一种抑菌型而不是杀菌型防御素。
2.8 PaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 改良肽的良好的稳定性评价结果
根据PaDef 及其改良肽的抗菌效果，选择rPaDefQ33 H 和rPaDefK43M 两种改良肽，利用Staphylococcus aureus（ATCC 25923）作为受试菌比较PaDef、rPaDefQ33H和rPaDefK43M 的稳定性，三者评价结果如图8 所示。
图8 rPaDef 及其改良肽的稳定性
Fig.8 Stability of rPaDef and modified peptides
**表示极显著（ P＜0.01）；****表示差异高度显著（P＜0.000 1）； n.s.表示无显著差异。
图8 显示，PaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 抗菌肽在4～90 ℃温度范围以及不同种类蛋白酶处理下保留了接近100%的抑菌活性。
2.9 rPaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 改良肽的良好的安全性评价结果
rPaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 改良肽的良好的安全性评价结果如图9 所示。
图9 rPaDef 及其改良肽的溶血性和细胞毒性
Fig.9 Hemolysis and cytotoxicity of rPaDef and modified peptides
a.鸡红细胞；b.小鼠红细胞；c.人红细胞；d. HEK293；e. BHK21。n.s.表示无显著差异。
图9 显示，改良肽对鸡和小鼠红细胞显示出较低的溶血活性。当改良肽的浓度达到200 μg/mL 时，对人红细胞显示出一定的溶血活性。利用BHK21 和HEK293 进行了细胞毒性测定。改良肽对HEK293 的细胞毒性低于对BHK21 的细胞毒性，当用10 μg/mL的rPaDefK43M 处理时，HEK293 细胞活力略高于rPaDef、rPaDefQ33H 处理后的细胞活力。当改良肽浓度大于50 μg/mL 时，两种细胞的存活率均较低。
2.10 rPaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 在细菌细胞膜表面形成孔隙电镜检测结果
rPaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 在细菌 细 胞膜表面形成孔隙电镜检测结果如图10 所示。
图10 SEM 观察rPaDef 及其改良肽对受试菌的作用
Fig.10 Scanning electron microscopy observation of effects of
rPaDef and modified peptides on tested bacteria
扫描电子显微镜和荧光显微镜观察rPaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 在细菌细胞膜表面形成孔隙，图10 显示，与PBS 处理的对照组相比，无论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，经PaDef、rPaDefQ33H和rPaDefK43M 处理后的受试菌株表面都被破坏，产生孔隙，这些孔隙会使细菌细胞的内容物流出，最终导致细菌死亡。
2.11 rPaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 在细菌细胞膜表面形成孔隙荧光检测结果
rPaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 在细菌细胞膜表面形成孔隙荧光检测结果如图11 所示。
图11 荧光显微镜观察rPaDef 及其改良肽对受试菌的作用
Fig.11 Fluorescence microscope observation of effects of rPaDef and modified peptides on tested bacteria
碘化丙啶（PI）只能穿透受损的细胞膜与DNA 结合并将DNA 染成红色。为了进一步研究其抗菌机理，将PaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 处理过的受试菌中利用PI 染色，清除多余的PI 染料后利用荧光显微镜检测了与DNA 结合的PI，如图11 所示，PaDef、rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 的处理破坏了受试细菌细胞膜的完整性，因此PI 能够穿透受损的细胞膜并将DNA 染成红色。由于革兰氏阴性细菌的质膜穿透率高于革兰氏阳性细菌，因此抗菌肽处理后的革兰氏阴性菌的荧光强度要高于革兰氏阳性菌。
3 结论
毕赤酵母表达的重组抗菌肽rPaDef 具有广泛的抗菌谱和抑菌能力，但其抗菌活性不是很强。本研究以重组抗菌肽rPaDef 为模板，分别从改变其净电荷数量、亲疏水性以及改变其环结构域的结构等方面出发，利用定点突变和基因工程等方法设计并体外表达rPaDef 及其改良肽。经过对其抗菌能力及稳定性、安全性等方面的研究，结果显示改良肽rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 抗菌活性上调了1～2 倍，且其稳定性和安全性并不受到影响。由此分析，净电荷数量和环结构域的改变对于rPaDef 的抗菌能力的影响较小，如改良肽rPaDefT3R 和rPaDefD29R 的抑菌能力并未发现显著提高。而改良肽rPaDefQ33H 和rPaDefK43M 表面的疏水提高的情况下，改良肽的抗菌活性显著提高，尤其是rPaDefK43M 在净电荷数量减少的情况下抗菌活性仍然显著提高。该试验结果明抗菌肽rPaDef 表面的亲疏水性是影响其抗菌能力的主要因素。对其抑菌机制的初步探索表明，抗菌肽rPaDef 及其改良肽破坏了受试细菌的完整性，导致细菌细胞内容物流出，最终导致细菌死亡。在荧光显微镜下观察到抗菌肽rPaDef及改良肽处理后的细菌能够被PI 染色。并且通过对其荧光强度的分析，似乎rPaDef 及其改良肽对于革兰氏阴性菌的质膜穿透率更高，一方面可能是由于革兰氏阴性菌具有较薄的肽聚糖层，容易在抗菌肽的作用下穿透脂膜。此外，rPaDef 的另一个抗菌机制可能是与革兰氏阴性菌表面的脂质膜成分结合而发生相互作用，这也能解释rPaDef 表面疏水性的提高能够显著提升其抗菌能力。因此抗菌肽rPaDef 及改良肽的抗菌作用分子机制还需要更加深入的研究。
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