近年来，随着经济的快速发展，中国水产养殖产量约占世界70%。水产养殖行业包含各种淡水和海洋鱼类、贝类、甲壳类和水生植物，已成为我国和全球经济中最重要的经济产业之一[1]。但随着水产养殖行业的发展，水生污染、细菌性疾病、水产养殖物种的遗传退化等问题频发，海洋致病菌成为引起水生动物死亡及危害人类身体健康的重要原因[2-4]。弧菌是一种普遍存在于海水养殖中的革兰氏阴性菌，主要分布在海水及水生生物中，种类繁多，如哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌是较为常见的弧菌病原体，是导致水生动物感染及影响人类健康的主要原因[5]。抗生素及化学合成抗菌药是目前水产养殖中应用最广泛的治疗弧菌病药物，多用于沐浴、浸泡或与饲料混合的治疗形式[6]。最常用的抗生素及合成抗菌药包括甲氧苄啶、硫酸链霉素、氟苯尼考、四环素、喹诺酮类抗生素及磺胺类药物[7-9]。若在水产养殖中频繁地使用抗生素，病原体会产生抗生素耐药性，而耐药菌和耐药基因会严重危害环境及人类健康[10-11]。
中草药具有来源广泛、绿色环保、广谱抗菌等优点，可以提高水产动物非特异性免疫防治功能，所以采用中药代替抗生素药物具有较高的研究价值。莓茶（Ampelopsis grossedentata）系葡萄科蛇葡萄属野生藤本植物，作为药食同源草本植物，其干叶和茎是食品研究中的重要植物资源。莓茶中含有多种活性成分，包括黄酮类、多酚类、多糖类、萜类及挥发性成分[12-18]，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗菌等作用[19]。冯湘沅等[14]发现莓茶中多酚、黄酮总含量分别为468.22、266.18 mg/mL，黄酮醇类组分主要为杨梅素和槲皮素，莓茶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及痢疾杆菌均表现出较好的活性和稳定性。根据文献[15]可知，莓茶中黄酮类化合物含量最高，主要黄酮类物质是二氢杨梅素和杨梅素及少量异二氢杨梅素、杨梅黄素等，故对莓茶中黄酮类化合物进行抑制哈维氏弧菌预试验，筛选出二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、槲皮素4 种黄酮类化合物，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷的抑菌圈直径为（18.52±0.10）、（12.35±0.35） mm 和（10.87±0.13） mm，槲皮素无抑菌活性。基于此，本文以莓茶中黄酮类化合物的含量为考察指标采用单因素试验、正交试验及验证试验优化提取条件，利用牛津杯法和试管法测定最小抑菌浓度，最后通过对哈维氏弧菌生长曲线、细胞膜、细胞壁的影响和扫描电镜法研究莓茶对哈维氏弧菌的作用机制，以期为开发莓茶抗弧菌产品、防治水产养殖业中弧菌性疾病提供一定的方法与思路。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
莓茶：张家界君歌莓茶种植专业合作社；哈维氏弧菌（Vibrio harveyi 1.8690）：中国普通微生物菌株保藏管理中心，由江苏海洋大学海洋药物活性分子筛选重点实验室保存；无水乙醇（分析级）：永大化学试剂公司；MH 肉汤培养基（生物试剂）、琼脂粉（生物试剂）、海盐：乐渔科技有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。
Agilent 1260 型高效液相色谱仪：安捷伦公司；YMC-Pack ODS-A 型（10.0 mm×250 mm， 5 μm）色谱柱：日本株式会社维美希公司；YSO-LS 型全自动立式压力真空灭菌锅：上海博迅实业有限公司；Regulus 8100 型超高分辨场发射扫描电子显微镜：日本日立公司。
1.2 方法
1.2.1 莓茶活性物质提取
取干燥的莓茶粉碎后过12 目筛，精密称定0.5 g于50 mL 圆底烧瓶中，加入7.5 mL 乙醇，密塞，称定质量，超声功率225 W，超声回流提取1 h，放冷，用乙醇补足失重，摇匀过滤，取续滤液过0.45 μm 有机滤膜，即得供试品溶液。
1.2.2 色谱条件
1.2.2.1 检测波长选择
本试验检测对象二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷均为黄酮类化合物，根据这3 个化合物最大吸收波长，参考易开等[20]对二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷含量的检测方法，最终确定检测波长为292 nm。
1.2.2.2 色谱条件
色谱柱：YMC-Pack ODS-A（250 mm×10.0 mm， 5 μm）；流动相：甲醇-1%磷酸水溶液，柱温：30 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；流动相：甲醇（A）-1% 磷酸水溶液（B）。0～10 min：35%（A）-65%（B），10～20 min：35%～80%（A）-65%～20%（B），20～40 min：80%（A）-20%（B），进样体积为10 μL[16]。
1.2.3 单因素试验
利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）技术鉴定莓茶中主要黄酮类成分（二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷），黄酮类成分含量与峰面积增长趋势呈正相关，故以峰面积为指标，通过单因素及正交试验来优化提取方法，考察不同单因素条件下莓茶提取物对哈维氏弧菌的抑制作用。单因素试验设置如下。
乙醇浓度：取0.5 g 的莓茶粉末置于50 mL 圆底烧瓶内，固定提取时间为1 h，提取温度70 ℃，料液比1∶30 （g/mL），考察乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）对黄酮类成分含量的影响。
料液比：取0.5 g 的莓茶粉末置于50 mL 圆底烧瓶内，按“乙醇浓度”中筛选结果设定，固定提取时间为1 h，提取温度70 ℃，考察料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 （g/mL）]对黄酮类成分含量的影响。
提取时间：取0.5 g 的莓茶粉末置于50 mL 圆底烧瓶内，按“乙醇浓度”和“料液比”中筛选结果设定，考察提取时间（20、40、60、80、100 min）对黄酮类成分含量的影响。
1.2.4 正交试验设计及验证试验
根据单因素试验结果，以3 个水平的乙醇浓度、料液比、提取时间为考察因素，HPLC 测得的3 个峰面积作为主要的考察指标，按表1 的正交因素水平设计正交试验，优化提取条件；并进一步对优化条件进行验证试验，以确定提取方法的合理稳定可行。
表1 正交试验优化莓茶中黄酮类化合物因素水平
Table 1 Orthogonal experiment optimization of the factor levels of dihydromyricetin and other compounds from A. grossedentata by orthogonal test
因素水平1 2 3 A 乙醇浓度/%60 70 80 B 料液比/（g/mL）1∶20 1∶25 1∶30 C 提取时间/min 20 40 60
1.2.5 方法学考察
1.2.5.1 线性关系考察
精密称定二氢杨梅素18.10 mg、杨梅素13.60 mg、杨梅苷8.5 mg 分别置于50 mL 容量瓶，加入甲醇定容、摇匀，分别得到0.362 、0.272 、0.170 mg/mL 的不同对照品溶液；精密吸取200、40、600、800、1 000 μL 定容到10 mL，按色谱条件分别注入色谱仪，以对照品浓度为横坐标（X），以峰面积（Y）为纵坐标，分别得到二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷的回归方程和线性范围。
1.2.5.2 精密度考察
精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件连续进样6 次，分别计算二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷保留时间以及峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.2.5.3 重复性考察
称取莓茶粉末0.5 g 共6 份，制备供试品溶液，按色谱条件进行测定，分别计算二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷保留时间以及峰面积的RSD。
1.2.5.4 稳定性试验
制备供试品溶液，按色谱条件于0、2、4、8、12、24 h注入高效液相色谱仪中，分别计算二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷保留时间以及峰面积的RSD。
1.2.5.5 回收率试验
精密称定已知含量的莓茶粉末共6 份，每份约0.1 g，分别加入约相同量的二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素对照品，制备供试品溶液，按色谱条件进行测定，利用峰面积分别计算二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷的测得量及回收率。
1.2.6 最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）
通过牛津杯法测定最佳提取工艺得到的莓茶提取物对哈维氏弧菌的最小抑菌浓度，精密称定1 g 莓茶提取物溶于30 mL 80%乙醇中，采用二倍稀释法将样品溶液稀释成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 g/mL。将20 mL MH 肉汤培养基倒入培养皿中，待其完全凝固后用移液枪吸取200 μL 菌液均匀涂布在培养基上，将牛津杯放在对应标记处，加入200 μL提取物待测样品，32 ℃培养18 h，测定抑菌圈直径。
1.2.7 活性物质抗菌作用机理
1.2.7.1 对哈维氏弧菌生长曲线的影响
将400 μL 的哈维氏弧菌加入到含1/2 MIC、MIC和2 MIC 莓茶提取液的40 mL MHB 培养基中，以空白培养基为阴性对照。在37 ℃ 和160 r/min 振荡培养14 h，在培养过程中，每隔2 h 取样250 μL 添加到96 孔微量滴定板的孔中，试验设置3 组重复，测定OD600 nm处的吸光度。以吸光度的平均值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制细菌生长曲线[21]。
1.2.7.2 对哈维氏弧菌细胞膜完整性、通透性的影响
将400 μL 的哈维氏弧菌加入到含1/2 MIC、MIC和2 MIC 莓茶提取液的40 mL MH 肉汤培养基中，以空白培养基为阴性对照。在37 ℃和160 r/min 振荡培养，每隔1 h 收集细菌样品，连续监测4 h，取得上清液在OD400 nm 处测定吸光度。试验设为3 组平行，以吸光度平均值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制曲线[22]。
根据上述试验方法，取已测定吸光度的上清液约2.0 mL，加8.0 mL 蒸馏水，混匀测量电导率，以电导率为纵坐标，培养时间为横坐标绘制曲线。
1.2.7.3 对哈维氏弧菌细胞壁的影响
将400 μL 的哈维氏弧菌加入含1/2 MIC、MIC 和2 MIC 莓茶提取液的40 mL MHB 培养基中，以空白培养基为阴性对照。在37 ℃和160 r/min 振荡培养，每隔3 h 收集细菌样品，连续监测12 h，取得上清液0.1 mL离心，分别加入100 μL 缓冲液和基质液充分混匀后，37 ℃下水浴加热15 min 后加入400 μL 显色剂混匀，加入96 孔微量滴定板中，试验设为平行3 组，测定510 nm 处吸光度。以吸光度平均值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制曲线[22]。
1.2.7.4 对哈维氏弧菌形态的影响
将200 μL 哈维氏弧菌接种到含MIC 莓茶提取液的培养液中，以不加提取液为阴性对照。37 ℃下培养4 h 后6 500 r/min 下离心10 min 去上清液，加入磷酸盐缓冲液缓慢冲洗菌体3 次，添加1 mL 4%戊二醛放入冰箱过夜，于6 500 r/min 下离心10 min 去上清液。收集下层菌体置于盖玻片上，用乙醇脱水。样品在临界点用CO2 干燥、喷金，用扫描电子显微镜进行观察[23]。
1.3 数据分析
试验均重复3 次，采用Origin 2021 软件绘图，单因素、正交方差分析采用正交试验助手Ⅱ V3.1 分析软件。
2 结果与分析
莓茶提取物及标准品液相色谱图见图1、图2。
图1 二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷标准品混合液液相色谱图
Fig.1 Liquid chromatography of standard mixture of dihydromyricetin， myricetin， and myricitrin
1.二氢杨梅素；2.杨梅素；3.杨梅苷。
图2 莓茶液相色谱图
Fig.2 Liquid chromatography of Ampelopsis grossedentata
1.二氢杨梅素；2.杨梅素；3.杨梅苷。
由图2 可知，采用HPLC 对莓茶提取物及标准品的混合液作对照进行分析，得到3 个黄酮类成分，分别是二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷，对应保留时间分别为26.074、30.355、32.018 min。
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇浓度的筛选
乙醇浓度对二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷提取的影响见图3。
图3 乙醇浓度对二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷提取的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction of dihydromyricetin， myricetin， and myricitrin
a.二氢杨梅素；b.杨梅素；c.杨梅苷。
由图3 可知，随着乙醇浓度增大，3 种黄酮类化合物含量呈先增加后下降趋势，当乙醇浓度达到80%时，莓茶中各个成分达到了最大值。吕浩[24]研究表明，莓茶总黄酮提取率在70%乙醇处有明显峰值，与本试验相比较浓度略低，这可能是由于采用的测定方法与提取率的计算方式不同而产生差异，当乙醇浓度超过80%时，较多的杂质溶解渗出，导致3 种黄酮类化合物含量下降。因此，选择80%乙醇浓度进行后续单因素试验，确定60%、70%、80%为正交试验3 个水平。
2.1.2 料液比的筛选
料液比对二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷峰面积的影响见图4。
图4 料液比二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷提取的影响
Fig.4 Effect of material liquid ratio on the extraction of dihydromyricetin， myricetin， and myricitrin
a.二氢杨梅素；b.杨梅素；c.杨梅苷。
由图4 可知，莓茶中黄酮类化合物随着溶剂体积的增加峰面积呈先升高后降低趋势。这表明溶液体积增大，溶剂对莓茶中黄酮类化合物浸提越充分，当料液比达到1∶30 （g/mL）时，3 种黄酮类化合物的峰面积最大。然而，料液比为1∶35 （g/mL）时，黄酮类化合物的含量反而下降，可能是由于莓茶中有效成分与一定量的溶剂已经接触完全，增大溶剂体积后阻碍黄酮类化合物析出，从而使得含量下降。因此，选择料液比为1∶30 （g/mL）进行后续单因素试验，确定1∶20、1∶25、1∶30 （g/mL）为正交试验3 个水平。
2.1.3 提取时间的筛选
提取时间对二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷提取的影响见图5。
图5 提取时间对二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷提取的影响
Fig.5 Effect of extraction time on the extraction of dihydromyricetin， myricetin， and myricitrin
a.二氢杨梅素；b.杨梅素；c.杨梅苷。
由图5 可知，随着提取时间的延长，莓茶中黄酮类化合物的含量逐渐上升，当提取时间达到60 min时，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷的含量最高。当提取时间小于60 min 时，可能由于时间延长使得黄酮类化合物溶解速度加快；莓茶中黄酮类化合物在60 min时溶解度达到最大，提取时间再次延长导致有效成分在溶剂中溶解速度受到限制，从而使得黄酮类化合物含量下降。因此，确定20、40、60 min 为正交试验3 个水平。
2.2 正交试验及验证试验
2.2.1 正交试验设计结果
正交试验分析结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 莓茶总黄酮提取方法正交试验分析
Table 2 Orthogonal analysis of extraction methods of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata
编号A 乙醇浓度B 料液比C 提取时间峰面积1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 3 1 2 2 3 1二氢杨梅素58 931.259 5 61 738.850 9 61 508.801 3 58 921.617 5 63 477.583 2 64 294.924 5 61 382.386 3 62 046.711 2 65 099.235 8杨梅素898.056 3 1 132.331 1 1 177.06 02 972.698 4 1 061.767 6 1 211.482 1 1 025.332 4 1 077.709 6 1 153.958 2杨梅苷352.500 9 534.452 2 588.368 4 551.604 8 463.508 1 616.355 8 541.608 1 628.495 7 524.054 3总峰面积60 181.816 7 63 405.634 2 63 274.229 9 60 445.920 7 65 002.858 9 66 122.762 4 62 949.326 8 63 752.916 5 66 777.248 3 k2 k3 R 62 287.227 63 857.181 64 493.164 2 205.937 61 192.355 64 053.803 65 391.414 4 199.059 63 987.308 62 491.022 64 159.241 1 668.219
表3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance results
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
因素A 乙醇浓度B 料液比C 提取时间误差偏差平方和7 735 387.109 5 051 385.464 27 609 183.54 227 767.436自由度2 2 2 2 F 值33.962 122.178 21.217显著性0.029*0.043*0.008**
由表2 可知，影响成分峰面积的各因素主次关系为料液比＞乙醇浓度＞提取时间，由表3 得出，3 个因素对三个成分峰面积的影响显著。最佳提取条件为乙醇浓度80%、料液比1∶30 （g/mL）、提取时间60 min。
2.2.2 验证试验
分别称取莓茶粉末5 g 共3 份，按照乙醇浓度80%、料液比1∶30 （g/mL）、提取时间60 min 进行验证试验，结果见表4。验证试验结果高于正交试验结果中任意一组，说明提取方法可行。
表4 验证试验结果
Table 4 Validation test results
测定指标二氢杨梅素峰面积杨梅素峰面积杨梅苷峰面积总峰面积试验1 65 997.132 5试验2 67 034.898 1试验3 67 312.220 8平均值66 781.417 1 1 190.348 6 1 201.280 3 1 197.152 7 1 196.260 53 732.436 6 736.605 9 732.334 9 733.792 5 67 919.917 7 68 972.784 3 69 241.708 4 68 711.470 1
2.3 方法学考察结果
2.3.1 线性范围考察
以进样量对峰面积进行回归处理，对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，分别计算二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷的标准曲线，其线性数据结果见表5。
表5 二氢杨梅素等化合物线性范围
Table 5 Linear range of dihydromyricetin and other compounds
化合物二氢杨梅素杨梅素杨梅苷回归方程Y=532.94X-9.268 8 Y=146.95X-7.970 9 Y=126.28X-2.961 1 R2 0.999 1 0.994 9 0.999 0线性范围/（μg/mL）0.072 4～0.362 0 0.054 4～0.272 0 0.034 0～0.170 0
2.3.2 精密度试验
精密度试验结果见表6。
表6 精密度试验结果
Table 6 Precision test results
项目杨梅素二氢杨梅素峰面积38 766.225 2 38 844.708 6 38 835.061 4 38 896.057 8 38 773.884 8 38 807.927 2 0.13杨梅苷1 2 3 4 5 6 RSD/%保留时间/min 26.262 26.315 26.331 26.350 26.380 26.326 0.14峰面积494.783 5 483.657 0 494.490 2 494.222 4 492.202 6 493.444 5 0.86保留时间/min 30.381 30.396 30.400 30.406 30.413 30.398 0.04峰面积197.907 1 198.057 2 198.247 1 198.593 2 198.273 0 197.863 0 0.14保留时间/min 32.071 32.087 32.090 32.096 32.102 32.088 0.03
由表6 可知，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷3 个化合物保留时间和峰面积RSD 分别为0.03%～0.14%和0.13%～0.86%，表明仪器的精密度良好。
2.3.3 稳定性试验结果
稳定性试验结果见表7。
表7 稳定性试验结果
Table 7 Stability test results
项目杨梅素杨梅苷1 2 3 4 5 6 RSD/%二氢杨梅素峰面积40 872.984 5 40 778.394 3 40 799.481 4 40 661.295 4 40 680.089 4 40 460.284 4 0.36保留时间/min 26.786 26.644 26.534 26.261 26.072 26.090 1.14峰面积494.414 1 491.165 7 490.340 8 489.585 7 489.769 6 496.580 7 0.58保留时间/min 30.837 30.741 30.673 30.522 30.410 30.257 0.71峰面积162.357 0 163.276 1 163.696 8 164.104 1 163.822 2 164.896 2 0.52保留时间/min 32.520 32.434 32.372 32.488 32.387 32.288 0.26
由表7 可知，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷3 个化合物保留时间和峰面积RSD 分别为0.26%～1.14% 和0.36%～0.58%，表明仪器的稳定性良好。
2.3.4 重复性试验结果
重复性试验结果见表8。
表8 重复性试验结果
Table 8 Repeatability test results
项目杨梅素杨梅苷1 2 3 4 5 6 RSD/%二氢杨梅素峰面积40 375.530 9 41 438.024 8 40 981.115 9 40 071.386 1 41 596.316 4 41 448.012 0 1.50保留时间/min 26.120 26.074 26.039 26.017 26.017 25.992 0.18峰面积497.430 5 510.160 6 496.596 5 503.466 2 499.494 1 498.559 3 1.01保留时间/min 30.311 30.305 30.298 30.293 30.292 30.291 0.03峰面积199.932 5 195.246 5 194.555 9 191.944 6 199.842 1 197.358 0 1.60保留时间/min 32.004 32.998 32.994 32.991 32.987 32.968 1.22
由表8 可知，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷3 个化合物保留时间和峰面积RSD 分别为0.03%～1.22% 和1.01%～1.60%，表明仪器的重复性良好。
2.3.5 回收率试验结果
取已知含量的莓茶粉末6 份，每份0.1 g，精密称定。加入约相同量的二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷对照品测定峰面积，计算测得量及回收率，结果见表9。
表9 回收率试验结果
Table 9 Recovery test results
成分二氢杨梅素样品含量/mg 38.19加入量/mg 40.65平均回收率/%99.68杨梅苷1.77 1.96 101.53杨梅素0.78 0.78测得量/%75.63 76.09 76.41 75.97 77.23 75.45 3.48 3.66 3.65 3.53 3.51 3.70 1.63 1.61 1.53 1.57 1.53 1.55回收率/%99.02 99.63 100.05 99.46 101.12 98.78 98.44 103.55 103.36 99.91 99.24 104.65 104.38 103.62 97.90 100.50 98.04 98.91 100.56
由表9 可知，平均加样回收率为99.68%～101.53%，说明方法回收效果好，方法准确度高。
2.4 最小抑菌浓度
测定莓茶提取物对哈维氏弧菌的最小抑菌浓度（MIC）结果见表10。
表10 莓茶乙醇提取物对哈维氏弧菌的最小抑菌浓度
Table 10 A. grossedentata ethanol extract on V. harveyi minimum inhibitory concentration
注：哈维氏弧菌抑菌圈直径表示为平均值±标准差，n=3。- 为无抑菌活性。
莓茶乙醇提取物的浓度/（g/mL）1 0.5 0.25 0.125 0.062 5 0.031 3 0.015 6 0.007 8哈维氏弧菌抑菌圈直径/mm 23.67±0.17 21.29±0.19 20.33±0.55 19.63±0.03 16.21±0.12 14.24±0.25 10.41±0.06-
抑菌圈直径小于9 mm 视为无抑菌活性。由表10可知，莓茶乙醇提取物对哈维氏弧菌的MIC 值为0.015 6 g/mL。
2.5 活性物质抗菌作用机理
2.5.1 莓茶提取物浓度对哈维氏弧菌生长曲线的影响
莓茶提取物浓度对哈维氏弧菌生长曲线的影响结果见图6。
图6 不同浓度莓茶提取物对哈维氏弧菌生长曲线的影响
Fig.6 Effect of different concentrations of A. grossedentata extract on the growth curve of V. harveyi
由图6 可知，对照组的菌株生长较为快速，在8 h达到稳定期。当莓茶提取物浓度为1/2 MIC 和MIC时，菌株生长趋势稳步上升，细菌活性抑制不明显。当莓茶提取物浓度为2 MIC 时，细菌生长处于平稳状态，这说明在2 MIC 浓度下可以明显抑制哈维氏弧菌的生长。
2.5.2 莓茶提取物对哈维氏弧菌细胞膜完整性、通透性的影响
莓茶提取物对哈维氏弧菌细胞膜完整性及通透性的影响结果见图7、图8。
图7 不同浓度莓茶提取物对哈维氏弧菌细胞膜完整性的影响
Fig.7 Effect of different concentrations of A. grossedentata extract on cell membrane integrity of V. harveyi
图8 不同浓度莓茶提取物对哈维氏弧菌电导率的影响
Fig.8 Effect of different concentrations of A. grossedentata extract on the electric conductivity of V. harveyi
由图7 可知，对照组的吸光度几乎没有变化。随着时间的延长，1/2 MIC、MIC、2 MIC 浓度下莓茶提取物吸光度明显增加，说明菌液中生物大分子开始发生渗透，且随着时间的延长而逐步增加。2 MIC 效果最好，MIC 吸光度高于1/2 MIC。因此可以推测，莓茶提取物能够破坏哈维氏弧菌细胞膜完整性，使细胞内生物大分渗出，从而起到抑制作用。
由图8 可知，1/2 MIC、MIC、2 MIC 处理组的电导率明显高于对照组，且随着时间的延长，电导率不断上升，说明莓茶提取物能够破坏哈维氏弧菌的细胞膜，使细胞膜的通透性增大。
2.5.3 莓茶提取物对哈维氏弧菌细胞壁的影响
莓茶提取物对哈维氏弧菌细胞壁的影响如图9所示。由图9 可知，在0 h 时，1/2 MIC 的吸光度低于对照组数值，可能为操作误差导致，其他各组均高于对照组。随着时间的延长，1/2 MIC、MIC 呈稳定增长，2 MIC增长幅度较大，而对照组数值几乎无变化。因此，可以推测出加入莓茶提取物可使哈维氏弧菌中磷酸酶泄漏从而导致细胞壁破坏，而加入莓茶提取液浓度越高对弧菌细胞壁的破坏越大。
图9 不同浓度莓茶提取物对哈维氏弧菌细胞壁的影响
Fig.9 Effect of different concentrations of A. grossedentata extract on the phosphorus leakage of V. harveyi
2.5.4 莓茶对哈维氏弧菌形态的影响
扫描电子显微镜观察莓茶提取物对哈维氏弧菌细胞的影响如图10 所示。
图10 哈维氏弧菌扫描电子显微镜图
Fig.10 Scanning electron microscopy image of V. harveyi
由图10 可知，对照组菌体为短杆状，末端呈椭圆形。MIC 浓度下的菌体，细胞形态异常，部分细胞破裂，边缘模糊。
3 结论
本研究以莓茶为原料，通过对比乙醇浓度、料液比、提取时间对莓茶中黄酮类化合物含量的影响，确定了最佳的莓茶提取工艺条件，并采用牛津杯法测定莓茶提取物的最小抑菌浓度，得到以下结果：莓茶提取物最佳提取条件为乙醇浓度80%、料液比1∶30 （g/mL）、提取时间60 min；在此条件下，对莓茶提取物进行抑菌试验，采用牛津杯法测定抑菌圈直径为（23.67±0.17） mm，MIC 为0.015 6 g/mL。随着莓茶提取物浓度的增大和时间不断延长，对细菌的生长曲线抑制效果越明显，菌液细胞膜中生物大分子渗出越明显，细胞膜完整性、通透性增大。此外，磷酸酶泄漏导致细胞壁被破坏，通过扫描电镜观察细胞形态，部分细胞破裂，边缘模糊，形态异常，这表明莓茶提取物对哈维氏弧菌具有显著的破坏作用。本研究初步确定了莓茶抑制哈维氏弧菌活性成分最佳提取工艺条件，研究莓茶提取物的抑菌机制，后续可通过抗细菌生物膜、转录组学、蛋白组学等技术深入研究，为莓茶用于开发新型抗菌剂提供理论依据。
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