桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又称斜纤孔菌、斜生纤孔菌、白桦茸、茶卡等，属于担子菌亚门、层菌纲、锈革孔菌目、锈革孔菌科、纤孔菌属[1-2]。桦褐孔菌主要分布在温度较低地区，如芬兰、波兰、俄罗斯、日本等国家，在我国主要分布于黑龙江、吉林和内蒙古等地[3]。据报道，桦褐孔菌中富含多糖、多酚、三萜类、黑色素和木质素等活性成分[4-5]。桦褐孔菌作为传统药物，数百年来被广泛用于治疗各种疾病。现代药理作用研究表明，桦褐孔菌具有降血脂、降血糖、抗癌、抗氧化、抗炎、抗疲劳和免疫调节等活性[5-6]。
目前，桦褐孔菌提取方法可分为传统提取方法、新型提取方法和生物提取方法等。传统提取方法包括热水浸提、溶剂提取、回流提取、索氏提取等；新型提取方法包括超声辅助提取、微波辅助提取、超临界CO2 萃取、超高压提取等；生物提取法主要是酶解法[7-9]。据报道，应用现代分析方法从桦褐孔菌中鉴定出200 多个化合物[10-11]。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法因其高效、准确的优点在天然产物分析中广泛应用。Wang 等[12]采用高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS）技术从桦褐孔菌中分析并鉴定原花青素、咖啡酸、对香豆酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷等10 种化合物。张勇等[13]建立了桦褐孔菌提取物中紫萁酮的HPLC 测定方法，并比较了不同溶剂和提取方法得到的提取物中紫萁酮含量。段雨晴等[14]采用HPLC 法同时检测了桦褐孔菌中栓菌酸、桦褐孔菌醇、麦角甾醇、羊毛甾醇4 种化合物含量，并对桦褐孔菌子实体的黑褐色外壳和内部黄色菌肉中4 种成分的含量进行比较。张士彦等[15]采用超高效液相色谱法同时测定桦褐孔菌中原儿茶醛、丁香酸和（E）-4-（3，4-二羟基苯基）丁-3-烯-2-酮3 种化合物含量。由于不同产地的桦褐孔菌中主要活性成分的含量均有不同，因此建立桦褐孔菌中主要活性成分检测的分析方法具有重要的意义。
本研究以桦褐孔菌中原儿茶酸、原儿茶醛和紫萁酮为研究对象，建立高效液相色谱法对桦褐孔菌中3 种化合物含量的分析方法，并对该检测技术进行方法学考察，同时采用超声辅助提取、回流提取、微波辅助提取、酶解提取4 种方法提取桦褐孔菌子实体中活性成分，应用建立的HPLC 法对比评价不同粗提物中3 种有效成分的含量，考察不同提取方法对桦褐孔菌中有效成分含量的影响，以期为桦褐孔菌的研发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
桦褐孔菌:吉林延边华厦有限公司（来自于俄罗斯西伯利亚地区，生长期为8 年以上），经过长春师范大学时东方教授鉴定为桦褐孔菌。桦褐孔菌子实体试验前进行切片，经高速万能粉碎机粉碎，过60 目筛，粉末密封保存。
甲醇（分析纯）:北京精细化学品有限公司；甲醇、醋酸（均为色谱级）:加拿大Caledon Laboratories 公司；磷酸二氢钠、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）（均为分析纯）:国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶（50 000 U/g）（分析纯）:宁夏和氏璧生物科技有限公司；原儿茶酸标准品、原儿茶醛标准品:上海源叶生物科技有限公司；紫萁酮标准品:成都普思生物科技股份有限公司。
1.1.2 仪器与设备
Finnigan Surveyor Plus 高效液相色谱仪:美国赛默飞公司；KQ-400DE 型数控超声波清洗器:昆山禾创超声仪器有限公司；RV10 型旋转蒸发仪:德国艾卡公司；MSU224S-CE 型电子分析天平:德国赛多利斯公司；FW-100 高速万能粉碎机:北京中兴伟业仪器有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅:江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；MAS-I 型微波合成仪:新仪微波化学科技有限公司。
1.2 色谱条件
色 谱 柱:ZORBOX SB-C18 色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相:A 为色谱甲醇，B 为0.5%醋酸水溶液；梯度洗脱条件:0～20 min（20%～40%A）；20～50 min（40%～80% A）；50～58 min（80%～100% A）；58～60 min（100%～20% A）。柱温25 ℃；检测波长280 nm；流速0.50 mL/min；进样量5 µL。
1.3 标准溶液配制及标准曲线绘制
精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、紫萁酮标准品用色谱级甲醇溶解，均配制成1.0 mg/mL 的母液备用。向1.5 mL 离心管中加入3 种化合物溶液各200 µL，并加入400 µL 的色谱级甲醇，制成混合对照品溶液，3 种化合物最终浓度均为200 µg/mL。
将上述配制好的标准溶液，用色谱级甲醇逐级稀释，得到6 个系列浓度（6.25、12.5、25、50、100、200 µg/mL）。按照1.2 中色谱条件依次进样分析，进样体积5 µL。
1.4 不同提取方法制备桦褐孔菌粗提物
1.4.1 回流提取法
参考高文庚等[16]的方法，并略作修改。准确称取样品4.997 7 g，按1∶20 （g/mL）料液比加入甲醇，架好回流装置，放置于水浴锅中进行回流提取，回流时间1.5 h，回流温度85 ℃，抽滤，重复提取3 次，合并滤液，减压浓缩至溶剂挥干，加入4 mL 甲醇溶解，过0.45 µm 滤膜，4 ℃保存备用。
1.4.2 超声辅助提取法
参照张勇[17]的提取方法，并略作修改。准确称取桦褐孔菌粉末5.000 7 g，按照1∶20 （g/mL）料液比加入甲醇，超声时间1 h，超声功率400 W，抽滤，重复提取3 次，合并滤液。减压浓缩至溶剂挥干，加入4 mL 甲醇溶解，过0.45 µm 滤膜，4 ℃保存备用，粗提物终浓度为1 250 mg/mL。
1.4.3 微波辅助提取法
参考荣丹等[18]的方法，并作修改。准确称取样品5.000 0 g，按料液比1∶20 （g/mL）加入甲醇溶解，提取时间60 s，提取温度50 ℃，微波功率500 W，重复提取3 次，抽滤，合并滤液。减压浓缩至溶剂挥干，加入4 mL 甲醇溶解，过0.45 µm 滤膜，4 ℃保存备用。
1.4.4 酶解提取法
参考丁霄霄等[19]的方法，并作修改。称取桦褐孔菌子实体样品粉末4.999 9 g 置于250 mL 烧杯中，加入pH5.0 的复合酶（30%纤维素酶、30%木瓜蛋白酶）磷酸缓冲液45 mL，37 ℃恒温水浴中酶解60 min。酶解结束后，在90 ℃热水中灭酶10 min，取出冷却，加入100 mL 的甲醇，400 W 功率条件下，超声辅助提取1 h，提取结束后抽滤。减压浓缩至溶剂挥干，加入4 mL 甲醇溶解，过0.45 µm 滤膜，4 ℃保存备用。
1.5 方法学考察
1.5.1 精密度考察
将1.3 中配制的混合对照品溶液，按照1.2 色谱条件连续进样5 次，记录峰面积并计算3 种化合物峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.5.2 稳定性考察
将超声辅助提取法得到的粗提物样品稀释1 倍，分别于0、2、6、14、24 h 时进行HPLC 测定，计算所得到的上述3 种化合物峰面积的RSD。
1.5.3 重复性考察
称取等质量的桦褐孔菌样品粉末5 份，采用超声辅助提取法制备粗提物，稀释1 倍后按照1.2 色谱条件进行测定，计算上述3 种化合物峰面积的RSD。
1.5.4 加标回收率考察
精密称取桦褐孔菌粉末5 份，每份约2.500 g，得到粗提物溶液，按每种化合物质量比1∶1 的比例加入混合对照品，按照1.2 色谱条件进样测定，并计算峰面积的RSD。
1.6 粗提物含量计算
将所得粗提物溶液，用甲醇稀释1 倍（625 mg/mL），与标准溶液相同色谱条件进入HPLC 分析。粗提物含量（H，%）计算公式如下。
式中:C 为将色谱图中化合物峰面积代入标准曲线后求得的浓度，µg/mL；n 为稀释倍数；V 为粗提物溶液的总体积，mL；m 为桦褐孔菌粉末质量，g。
1.7 数据统计与分析
标准曲线图采用Origin 2018 软件制作，提取率、精密度、稳定性、重复性、加标回收率由3 次重复试验获得，数据均由Office Excel 2021 软件处理。
2 结果与分析
2.1 方法学评价
2.1.1 精密度
计算得到原儿茶酸、原儿茶醛、紫萁酮3 种化合物峰面积的RSD 分别为0.14%、0.06%、0.20%，表明仪器精密度良好。
2.1.2 稳定性
计算得到原儿茶酸、原儿茶醛、紫萁酮3 种化合物峰面积的RSD 分别为0.20%、0.61%、0.25%，表明粗提物样品在24 h 内粗提物样品稳定性较好。
2.1.3 重复性
计算上述3 种化合物峰面积的RSD 分别为1.67%、1.98%、2.22%，表明该提取方法重复性良好。
2.1.4 加标回收率
桦褐孔菌中3 种化合物加标回收率计算结果如表1 所示。
表1 桦褐孔菌中3 种化合物加标回收率试验结果
Table 1 Spiked recovery test of three compounds in Inonotus obliquus
化合物原儿茶酸原儿茶醛紫萁酮样品含有量/ng 87.655 8 85.031 5 85.670 9 84.476 0 84.103 3 248.349 8 238.632 9 235.665 5 240.811 4 243.593 6 201.466 7 213.503 2 210.207 5 209.761 0 208.782 7加标量/ng 87.500 0 87.500 0 87.500 0 87.500 0 87.500 0 231.250 0 231.250 0 231.250 0 231.250 0 231.250 0 237.500 0 237.500 0 237.500 0 237.500 0 237.500 0检测量/ng 176.124 9 173.299 8 172.380 6 172.460 0 172.624 2 496.532 3 490.030 8 489.138 3 493.030 3 494.715 0 388.391 4 399.522 9 392.663 8 393.977 4 393.862 3加标回收率/%101.11 100.88 99.10 100.55 101.17 107.32 108.71 109.61 109.07 108.59 78.71 78.32 76.82 77.56 77.93回收率平均值/%100.56 108.67 77.87 RSD/%0.85 0.78 0.93
由表1 可知，3 种化合物峰面积的RSD 分别为0.85%、0.78%、0.93%，加标回收率平均值分别为100.56%、108.67%、77.87%。
2.2 3 种化合物标准曲线的绘制
以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。
图1 3 种化合物的标准曲线
Fig.1 Standard curves of three compounds
a.原儿茶酸；b.原儿茶醛；c.紫萁酮。
由图1 可知，3 种化合物的标准方程为原儿茶酸:y=83 014x-115 383，r=0.999 6；原儿茶醛:y=190 043x+470 804，r=0.998 3；紫 萁 酮:y=95 935x-90 765，r=0.999 8。3 种化合物的线性范围均为6.25～200 µg/mL。
2.3 不同提取方法对3 种化合物含量的影响
不同方法的桦褐孔菌粗提物经HPLC 分析得到的谱图如图2 所示。
图2 桦褐孔菌4 种不同方法提取物的HPLC 结果
Fig.2 HPLC plots of the extracts of four different methods of Inonotus obliquus
a.原儿茶酸；b.原儿茶醛；c.紫萁酮。
由图2 可以看出，所检测的桦褐孔菌中3 种主要成分均得到较好地分离，能够进一步定量分析。
通过回归3 种化合物的标准曲线方程计算得到4 种提取方法中主要活性成分的含量如表2 所示。
表2 4 种提取方法所得化合物含量比较
Table 2 Comparison of the content of compounds obtained by four extraction methods
提取方法超声辅助提取法回流提取法微波辅助提取法酶解提取法超声时间1 h重复3 次回流时间1.5 h重复3 次微波时间60 s重复3 次酶解时间1 h超声时间1 h重复1 次样品质量/mg 5.000 7 4.997 7 5.000 0 4.999 9含量/%原儿茶酸0.011 0.010 0.011 0.007原儿茶醛0.021 0.022 0.024 0.015紫萁酮0.017 0.017 0.020 0.013
由表2 可知，对于原儿茶酸的含量，微波辅助提取法和超声辅助提取法差别不大，二者含量均较高，为0.011%，约是酶解提取法的1.6 倍，回流提取法的1.1 倍；对于原儿茶醛，微波辅助提取法测得含量最高，为0.024%，是酶解提取法的1.6 倍，回流提取法与超声辅助提取法的1.1 倍；对于紫萁酮，微波辅助提取法得到的含量最高，为0.020%，是酶解提取法的1.6 倍，回流提取法和超声辅助提取法的1.2 倍。
综上所述，微波辅助提取与超声辅助提取所得到的原儿茶酸、原儿茶醛和紫萁酮的含量相近，相较于其他两种方法，均能更加快速、高效地提取目标化合物。超声辅助提取会产生空化作用，而微波产生的电磁波可以引起分子的高频振动，均促使有效成分从物料中快速分离，二者相较于回流法都能加速目标化合物分离。酶解提取法所得到的提取物中，目标化合物含量最低，推测原因可能是由于酶解液的存在，在加入100 mL 甲醇后，甲醇被稀释，导致所测含量下降；另一种可能是酶解提取法需严格控制条件（温度、时间、pH值、酶添加量等），当条件不合适时，对所测含量影响较大，从而导致测得含量低。
3 结论
本研究建立了可以同时定量测定桦褐孔菌粗提物中原儿茶酸、原儿茶醛、紫萁酮3 种化合物含量的高效液相色谱法。采用超声辅助提取法、微波辅助提取法、回流提取法和酶解提取法4 种方法，以甲醇为溶剂提取桦褐孔菌子实体中有效成分，并用所建立的HPLC法比较评价4 种不同提取方法对粗提物中原儿茶酸、原儿茶醛、紫萁酮含量的影响。结果表明，采用微波辅助提取法和超声辅助提取法得到的目标化合物产量相近且较高，相较于另外两种方法操作简便易行，因此微波辅助提取和超声辅助提取更加适用于提取桦褐孔菌，但超声辅助提取比微波辅助提取安全性更高，且仪器价格较低，适合于大规模的提取，因此超声辅助提取更加适用于提取桦褐孔菌。在后续研究中，将以主要活性成分的含量为指标，采用响应面方法对提取工艺优化。因此，本研究所建立的HPLC 法操作简便，精密度、重复性较好，回收率较高，样品的稳定性较好，可为桦褐孔菌质量标准提供参考。
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