微生物胞外多糖（exopolysaccharides，EPS） 是一类具有丰富结构和功能的天然高分子化合物，广泛存在于微生物（如细菌、真菌等）的细胞外环境中[1]。由于其特殊的生物活性和优异的功能性质，成为了近年来的研究热点。在食品工业中，EPS 可作为天然的增稠剂和凝胶剂[2-3]，在食品加工过程中起到调节和保持食品结构、改善产品的质地和口感的作用[4]；其次，EPS 具有出色的乳化性能，因其可以稳定油水混合物，所以广泛应用于乳制品、面包、糕点等食品中[5]；另外，EPS 还具有抗氧化、抗菌和免疫调节等生物活性，可延长食品的保质期，提高产品的品质和安全性[6]。随着人们对健康产品需求的不断增长，EPS 在功能性食品领域也表现出较大的应用潜力，其具有调节血糖、降低胆固醇、增强免疫力等保健功能，可应用于功能性饮料、膳食补充剂等产品中[7-9]。尽管微生物胞外多糖具有缓解炎症、抗氧化、乳化性、保湿性等多方面的功能，但是，其在食品工业中的应用也面临着一些挑战和难题。如何提高产率并高效提取微生物胞外多糖，如何开发其应用工艺和优化稳定性，以及微生物胞外多糖与其他食品成分相容性等问题都需要进一步研究和探索[10]。
本试验以一株环境分离的波茨坦短芽孢杆菌为目标菌株，从生长条件、培养基成分等关键工艺因素进行优化，探究细菌产胞外多糖的最佳条件，进一步将提取的EPS与不同疏水底物混合，探究EPS 的乳化性，以期为EPS 的工业生产方法提供理论基础，并为其后续利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源波茨坦短芽孢杆菌S8:分离来源于土壤，由四川农业大学资源学院微生物实验室提供。
1.1.2 试剂
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基:青岛海博生物公司；果糖、蔗糖、葡萄糖、水溶性淀粉、乳糖、吐温80、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉（分析纯）:北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸（分析纯）:成都科隆化学品有限公司；橄榄油、大豆油、菜籽油、芝麻油、汽油:市售。
1.2 仪器与设备
GHP-9270D 恒温培养箱:上海齐欣科学仪器有限公司；5810R 冷冻离心机:艾本德（上海）国际贸易有限公司；SP-726 酶标仪:上海沛欧分析仪器有限公司；SP-176 紫外分光光度计:上海美谱达仪器有限公司；MLS-3030H 高压蒸汽灭菌锅:上海拜格生物科技发展有限公司；F6/10 高速匀浆机:上海净信实业发展有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌株S8 胞外多糖的提取
参考李兴恺等[11]的方法提取菌株EPS。将活化后的S8 菌液以2%添加量接种于TSB 培养基中，37 ℃、180 r/min 条件下培养36 h 后，与预冻完全的95% 乙醇混合，于4 ℃下放置过夜。在10 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min 后收集沉淀，并加入适量超纯水使其完全溶解，加入等体积10% 三氯乙酸，将其混匀后于4 ℃条件下沉淀静置过夜。待蛋白沉淀完全后，在10 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，保留上清液。加入3 倍体积的95% 乙醇与上清液混合，于4 ℃条件下，静置过夜。收集沉淀后，置于截留量为14 000 Da的透析袋中，在4 ℃的超纯水中透析48 h，每隔2 h 更换UP 水，透析完成后，将样品冷冻干燥，所得粉体即为胞外多糖粗品。
1.3.2 EPS 的分离纯化
参考彭嘉屹等[12]的方法对EPS 进一步纯化，配制浓度为10 mg/mL 的EPS 溶液，上样于DEAE-52 层析柱中（10 mm×60 cm，填充高度40 cm），以0.5 mL/min流速的UP 水洗脱。收集纯化后的EPS，冷冻干燥后测定多糖含量。
1.3.3 多糖含量测定
采用苯酚硫酸法[13]测定多糖含量。
1.3.4 单因素试验
为确定最适产糖条件，进行单因素优化试验。探究菌株最适产糖培养基成分时，以TSB 为基础培养基的条件下进行成分的添加以及变量控制，试验方案设计以文献[14-17]的试验方案为基础，试验设计见表1、表2。
表1 最适产糖培养条件单因素试验设计
Table 1 Single factor design for optimizing the culture conditions for EPS production
培养时间/h 12、24、36、48、60 36 36 36培养温度/℃35 25、30、35、40、45 40 40接种量/%22 2、4、6、8、10 4初始pH 值777 5、6、7、8、9
表2 最适产糖培养基成分单因素试验设计
Table 2 Single factor design for optimizing the medium composition for EPS production
氮源胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨+牛肉膏（1∶1，质量比）、蛋白胨+酵母浸粉（1∶1，质量比）、牛肉膏+酵母浸粉（1∶1，质量比）TSB 基础上无额外添加蛋白胨+酵母浸粉TSB 基础上无额外添加碳源TSB 基础上无额外添加果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖TSB 基础上无额外添加蔗糖添加量/（g/L）2 10 2、4、6、8、10 10、20、30、40、50
1.3.5 Plackett-Burman （P-B）试验
在单因素试验基础上，选用试验次数为12 的P-B设计，以培养时间、培养温度、接种量、初始pH 值以及氮源、碳源添加量6 个因素进行评价，选出主响应因子，每个因素取最高（1）和最低（-1）两个水平[18]。
1.3.6 最陡爬坡试验
最陡爬坡试验是根据各因素的效应大小和变化方向确定爬坡步长和方向。根据P-B 试验的结果，选择对EPS 产量有显著影响的因素作为响应面试验的中心点开展试验，由此逼近最大响应值区域[19]。
1.3.7 Box-Behnken （B-B）试验
在PB 试验和最陡爬坡试验结果的基础上，选择A接种量、B 培养时间、C 碳源添加量3 个因素，建立三因素三水平模型对产糖量（Y）进行优化，其余因素条件固定为单因素试验所得产糖最优条件。因素与水平见表3。
表3 Box-Benhnken 设计因素与水平
Table 3 Factors and levels of Box-Benhnken design
水平-1 01 A 接种量/%34 5 B 培养时间/h 36 40 44 C 碳源添加量/（g/L）25 30 35
1.3.8 模型验证
对B-B 试验得出的模型进行显著性检验，并按照所得出的最佳产糖培养条件培养菌株后，将产糖量的实际值与模型预测值相比较，判断模型是否有偏差。
1.3.9 EPS 乳化性探究
乳化率通常指乳化层体积与溶液总体积的比值。参照杨棒棒等[20]的方法并进行调整，将胞外多糖配制成5 g/L 的溶液，以吐温80 作为阳性对照。分别选择橄榄油、大豆油、菜籽油、芝麻油、汽油作为疏水性底物，与EPS 以3∶2 体积比混合。接着使用高速匀浆机剧烈振荡2 min，在室温下静置，在12、24、36、48、60 h取样测定乳化率。乳化率（Y，%）计算公式如下。
式中:V1 为乳化层体积，mL；V2 为底物总体积，mL。
1.4 数据处理
所有试验均进行3 次重复试验，所得数据经过IBM SPSS Statistics 27 的单因素ANOVA 进行显著性分析（P<0.05），使用Origin 2022 进行绘图，使用DE 13进行P-B 试验、最陡爬坡试验、B-B 试验的试验设计及分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 菌株生长、产糖曲线及葡萄糖标准曲线的绘制
根据苯酚硫酸法绘制葡萄糖标准曲线，得到方程为y=0.005 5x+0.006，R2=0.992 4。培养时间是影响EPS 产生的重要条件之一[21]，根据单因素探究最适产糖培养时间所得结果绘制产糖曲线见图1。
图1 葡萄糖标准曲线及菌株生长和产糖曲线
Fig.1 Glucose standard curve，strain growth curve，and EPS production curve
由图1 可知，在培养时间为36 h 时，菌株产糖量达到最高42.3 mg/L，此时菌液的OD600 也处于最高点。
2.1.2 环境条件对菌株产糖量的影响
环境温度影响微生物EPS 的合成。在较低温度下，微生物的代谢活性减弱，导致胞外多糖的合成速率慢，产量少；过高的温度则可能破坏细胞结构，也会影响胞外多糖的产生[22]。不同的微生物菌株对环境温度的适应能力有所差异。因此，进行单因素试验探究菌株的最适环境条件，结果见图2。
由图2A 可知，在40 ℃条件下培养，菌株产糖量达到最高点55.14 mg/L，继续升高培养温度，产糖量呈下降趋势，因此40 ℃为菌株最适培养温度，与Khanal等[23]所得结果相符，因此选择培养温度为40 ℃进行后续试验。
图2 环境条件对菌株产糖能力的影响
Fig.2 Effects of different culture conditions on EPS production
A.培养温度；B.接种量；C.初始pH 值。不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
菌株在培养过程中需要足够的营养物质和空间来生长和繁殖，从而提高产糖能力，但过高的接种量会导致菌株之间的竞争以及加快营养物质的消耗，从而降低EPS 的产量[24]。由图2B 可知，菌株S8 最适产糖接种量为4%，此时，产糖量为62.02 mg/L，继续增大接种量时，随着接种量的增加产糖量逐渐减小，因此选择接种量为4%进行后续试验。
由图2C 可知，初始pH 值为6 时，菌株的产糖量达到最大值，为68.22 mg/L。随着初始pH 值的增加，菌株的产糖量呈现出缓慢下降的趋势。因此，初始pH值为6 时是菌株产糖的最佳pH 值条件，与杨棒棒等[25]的研究结果相似，因此选择初始pH 值为6 进行后续试验。
2.1.3 最适产糖氮源及其添加量结果分析
氮源种类的选择是微生物次级代谢产物合成的重要影响因素[26]，氮源种类及其添加量对菌株产糖能力的影响见图3。
由图3A 可知，在控制其他条件相同的情况下，不同氮源种类中，混合氮源蛋白胨+酵母浸粉（1∶1，质量比）的产糖量最高，为53.9 mg/L。由图3B 可知，当混合氮源蛋白胨+酵母浸粉添加量为4 g/L 时，菌株的产糖量达到最高值，为72.02 mg/L，之后随着添加量的增加，产糖量逐渐减少，因此选择4 g/L 蛋白胨+酵母浸粉（1∶1，质量比）作为氮源进行后续试验。
图3 氮源种类及其添加量对菌株产糖能力的影响
Fig.3 Effects of nitrogen sources and their addition amounts on EPS production
A.氮源种类对产糖量的影响；B.氮源添加量对产糖量的影响。不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
2.1.4 最适产糖碳源及其添加量结果分析
碳源种类及其添加量对菌株产糖能力的影响结果见图4。
图4 碳源种类及其添加量对菌株产糖能力的影响
Fig.4 Effects of carbon sources and their addition amounts on EPS production
A.碳源种类对产糖量的影响；B.碳源添加量对产糖量的影响。不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图4A 可知，当选择蔗糖作为唯一碳源时，产糖量最高，达到58.34 mg/L，因此，进一步对其进行最适添加量探究。由图4B 可知，蔗糖添加量为10～20 g/L时，产糖量缓慢增加，当添加量为30 g/L 时，产糖量达到最高（70.14 mg/L），之后随着添加量的增加，产糖量逐渐降低，因此选择30 g/L 左右的蔗糖作为碳源进行后续试验。
2.2 响应面优化菌株产糖条件
2.2.1 P-B 试验结果分析
P-B 试验的结果见表4。
表4 P-B 试验结果
Table 4 Results of P-B design
序号1234567891 0 11 12培养时间/h 24 24 48 24 48 48 48 48 24 48 24 24培养温度/℃35 45 45 45 35 35 45 45 35 35 35 45接种量662626622622 pH 值577557555777氮源添加量/（g/L）626666222226碳源添加量/（g/L）40 20 40 40 20 20 20 40 20 40 40 20产糖量/（mg/L）40.7 40.6 54.1 50.3 48.3 50.2 57.2 52.3 54.6 39.8 50.4 55.3
由表4 可知，影响菌株产胞外多糖能力的环境因素主要有培养时间、培养温度、初始pH 值、接种量、氮源添加量及碳源添加量，根据表4 所得结果，利用Design-Expert 13 推断出各因素的效应系数。P-B 试验各因素水平及效应评价见表5。
表5 P-B 试验各因素水平及效应评价
Table 5 Factor effect evaluation of P-B design
因素培养时间培养温度菌液接种量pH 值氮源添加量碳源添加量效应系数4.70 3.57-3.66 1.7-1.91-3.77影响顺序143652
由表5 可知，根据效应系数大小选取3 个因素，即接种量、培养时间和碳源添加量，因此选择这3 个因素进行后续试验，并根据单因素试验结果保持其他因素为最适产糖值。
2.2.2 最陡爬坡试验结果分析
通过P-B 试验的筛选，确定了对菌株产酶能力最显著的3 个因素，分别是培养时间、菌液接种量以及碳源添加量。为确定响应面试验的中心点，选择上述3 个因素进行最陡爬坡试验。根据接种量和碳源添加量的效应系数为负值，选择从低水平进行爬坡试验。而培养时间的效应系数为正值，因此选择高水平进行爬坡试验。最陡爬坡试验结果见表6。
由表6 可知，第4 组试验的产糖量最高。因此，选择接种量4%、培养时间40 h、碳源添加量30 g/L 作为B-B 试验的中心点。
表6 最陡爬坡试验结果
Table 6 Result of steepest ascent experiments
编号12345接种量/%12345培养时间/h 54 48 44 40 36碳源添加量/（g/L）15 20 25 30 35产糖量/（mg/L）35.53 56.26 75.23 106.13 82.47
2.2.3 B-B 试验结果
B-B 试验设计方案及结果见表7。
表7 B-B 设计优化方案及结果
Table 7 B-B design and results
编号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 A 接种量/%35353535444444444 B 培养时间/h 36 36 44 44 40 40 40 40 36 44 36 44 40 40 40 40 40 C 碳源添加量/（g/L）30 30 30 30 25 25 35 35 25 25 35 35 30 30 30 30 30 Y 产糖量/（mg/L）78.33 77.89 71.61 77.76 82.47 70.65 71.40 73.37 81.92 76.18 76.44 76.99 110.34 108.75 106.87 107.31 107.30
由表7 可知，使用Design Expert 13 软件对B-B 试验的结果进行回归分析，所得的模型方程为Y=108.11-0.517 5A-1.5B-1.63C+1.65AB+3.45AC+1.57BC-17.56A2-14.15B2-16.08C2。
回归模型方差分析见表7。
表7 产糖条件优化模型方差分析
Table 7 Analysis of variance for optimization model of EPS production conditions
注:*表示影响显著（P<0.05）；**表示影响极显著（P<0.01）。
来源模型A 接种量B 培养时间C 碳源添加量AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和平方和3 716.40 2.14 18.12 21.19 10.86 47.54 9.89 1 298.81 843.43 1 088.46 40.52 32.30 8.22 3 756.92自由度9.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 7.00 3.00 4.00 16.00均方412.93 2.14 18.12 21.19 10.86 47.54 9.89 1 298.81 843.43 1 088.46 5.79 10.77 2.05 F 值71.34 0.37 3.13 5.66 1.88 8.21 1.71 224.39 145.71 188.05 5.24 P 值<0.000 1 0.560 0 0.120 0 0.040 0 0.210 0 0.020 0 0.230 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.07显著性**** ******
由表7 可知，该模型的F 值为71.34，P<0.01，表明模型极显著，失拟项F 值为5.24，P>0.05，则失拟项不显著。模型的决定系数R2=0.989 2，证明模型具有良好的相关性，矫正决定系数为0.975 3，与R2 较为接近，说明模型拟合度高，此外，碳源添加量对菌株产糖量影响显著（P<0.05）；AC 对产糖量影响显著（P<0.05）；二次项A2、B2、C2 影响极显著（P<0.01），综上所述，表明模型对菌株产糖情况拟合程度较好。
Design-Expert 13 绘制不同组合因素之间的响应面结果及分析图见图5。
图5 各因素对产糖量交互作用的响应面和等高线
Fig.5 Response surfaces and contour plots of the effects of interactions between factors on EPS production
等高线表示越接近圆形则两因素之间交互作用不显著，反之，越接近椭圆形则表示交互作用越显著[27-28]。由图5 和方差分析可知，菌液接种量和碳源添加量的交互作用对菌株S8 产糖量影响显著，而培养时间和接种量的交互作用、碳源添加量和培养时间的交互作用对产糖量影响不显著。随着各因素数值的增加，菌株产糖量呈现先增加后减少的趋势。
2.2.4 模型验证试验
利用Design-Expert 13 软件分析，对菌株产糖最优培养条件参数进行预测。得到的工艺条件为接种量4.56%、培养时间39.9 h、碳源添加量30.04 g/L。在此条件下进行3 次重复试验，测得菌株产糖量的平均值为（107.81±1.47） mg/L。与预测值102.29 mg/L 相比，误差仅为5.12%，这表明该模型能够对菌株产糖量的实际情况进行预测。与其他产多糖菌株相比，低于杨棒棒等[20]的菌株产糖量（140.49 mg/L），远低于吴寒月等[29]的菌株产糖量（261.56 mg/L）。
2.3 多糖乳化性探究结果
菌株S8 产EPS（5 g/L）的乳化性探究结果见表9。
表9 菌株S8 产EPS（5 g/L）的乳化性探究结果
Table 9 Emulsification rates of EPS to different hydrophobic substrates
疏水底物橄榄油大豆油菜籽油芝麻油汽油12 h 乳化率/%EPS 100.00 100.00 94.80 98.67 100.00吐温80 83.47 81.63 74.32 78.65 79.83 24 h 乳化率/%EPS 92.34 95.61 79.89 94.65 82.34吐温80 77.46 73.62 74.12 74.33 70.64 36 h 乳化率/%EPS 87.52 90.97 62.11 92.17 71.46吐温80 73.79 68.36 72.03 68.73 66.67 48 h 乳化率/%EPS 81.31 88.26 43.68 89.82 65.21吐温80 72.24 67.14 70.86 68.08 65.97
由表9 可知，菌株S8 产的EPS 对部分疏水性底物具有乳化作用，混合12 h 时，EPS 对各疏水底物的乳化率均高于吐温80；混合24 h 时，EPS 对疏水底物的乳化率有所下降，但仍高于吐温80；混合36 h 后，EPS 对菜籽油的乳化率为62.11%，稍低于吐温80 的72.03%，其余底物乳化率均高于吐温80；混合48 h 后，EPS 对橄榄油、大豆油、芝麻油的乳化率高于吐温80，分别为81.31%、88.26%、89.82%，而对菜籽油和汽油的乳化率则低于吐温80。与其他研究相比，发现不同微生物产生的EPS 间乳化性存在一定的差异，如Niknezhad 等[30]研究发现胞外多糖对汽油和橄榄油的乳化率分别为44.70%和57.80%，低于本研究菌株S8 产生的EPS 乳化率。
3 结论
目前对于微生物胞外多糖的研究主要集中在乳酸菌和部分芽孢杆菌。关于波茨坦短芽孢杆菌产胞外多糖的研究相对较少。本研究通过对波茨坦短芽孢杆菌产胞外多糖培养条件进行优化和研究，为工业生产EPS 提供新的菌种资源。
通过单因素和响应面试验结果，确定了菌株S8 的最佳产糖培养条件为菌液的接种量4.56%，培养时间39.9 h，碳源的添加量30.04 g/L，在此条件下，菌株S8的EPS 产量可达到（107.81±1.47） mg/L。这些结果为进一步研究EPS 的应用提供了依据。此外，波茨坦短芽孢杆菌S8 的EPS 对部分疏水底物具有乳化性，乳化性探究试验中发现波茨坦短芽孢杆菌S8 产生的EPS 于不同疏水底物混合12、24 h 时，对各底物乳化率均高于吐温80。这些特性使其在后续有一定的开发应用潜力。未来还需针对S8 菌株产生的EPS 食用安全性及生物活性进行后续探究，为食品工业胞外多糖的应用提供更多新方案。
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