目前，随着世界人口的不断增长，人们对动物源性食物需求量不断增加，传统的饲料已供不应求，所以替代饲料被广泛关注[1]。而替代饲料想要达到传统饲料的各项要求，其各种生物质成分需达到一定条件，如作为饲料的必要条件是营养丰富，能提供动物所需要的蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质等同时，还要具有经济适用、易于吸收等特点。因藻类具有生长快、分布广、适应力强等优点，所以其作为饲料的一种替代产品在众多植物中脱颖而出[2-3]。有超过70% 的水覆盖在地球表面，为很多水生植物提供了广泛的栖息地[4]，其中就包括藻类，与很多陆生植物不同，它可大面积生长在河流、湖泊甚至是水坑中，无需额外的水源就可以大面积生长繁殖，这也使其成为一种经济实惠并且来源广泛、可持续的资源，长期以来备受研究者关注。
刚毛藻（Cladophora）属刚毛藻科刚毛藻属，广泛分布于亚洲、非洲等地[5]。它以水华形式成为“生态系统工程师”以及富营养化指标[6-7]，对多种污染物有良好吸附和降解效果[8]。刚毛藻为一年或多年生，是一种绿色的丝状、分支状藻类，分支为互生、对生型。细胞壁厚，无黏鞘膜，叶尖窄小，并且质地粗糙[9]；而且细胞较大，呈圆柱体状。刚毛藻一般附着在其他植物上。刚毛藻因其细胞壁厚，提取难度较高，所以对于刚毛藻蛋白提取纯化的研究较少。破壁方法通常分为两种:物理法和化学法。物理方法一般为机械粉碎破壁法、超声破壁法等，其中机械粉碎破壁法使用率较高，但其在破碎过程中温度升高，可能会导致提取物活性破坏[10]。高压细胞破碎机通过泵吸加压且经过特定工作区域后，物料瞬间失压高速喷出，碰撞在碰撞环上，达到破碎效果，适用于细胞壁厚、物料较浓的样品破碎，该方法相较于其他方法可以较好地保留微藻中蛋白质[11]。泡沫分离法采用界面化学表面吸附，利用泡沫作分离介质分离或富集具有表面活性的物质，向溶液中通入空气产生泡沫，表面活性物质依附在气液界面随泡沫鼓出[12]，然后进行消泡，达到表面活性物质与液相分离的效果，对蛋白质的纯化分离具有显著效果[13]，是一种具有设备简洁、操作简单、耗能低、环保、效率高等优点的分离技术，目前广泛应用于微藻、天然有机产物、矿物等的分离[14-16]。
本文以分离自青海省海东市柳湾湿地公园的刚毛藻为原料，采用泡沫分离提取，以回收率和富集比为参考指标，单因素试验为基础，经响应面法得优化提取条件，并测定刚毛藻蛋白功能特性、结构等，以期为刚毛藻的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
刚毛藻:青海省海东市柳湾湿地公园河道；牛血清白蛋白标准品、考马斯亮蓝G250（分析纯）:上海源叶生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）（分析纯）、大豆油:武汉皓晟商贸有限公司；石油醚、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、磷酸（均为分析纯）:利安隆博华（天津）医药化学有限公司。
1.2 仪器与设备
TUBE-MILL 100 粉碎机、RCT 磁力搅拌器:IKA（广州）仪器设备有限公司；SYN THWARE E104524 索氏提取器、UH-24 高压细胞破碎机:永联生物科技（上海）有限公司；PB-10 酸度计:赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；H1850 高速离心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；VFD-2000 冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司；TU-1901 双光束紫外-可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司；IRSpirit 傅里叶变换红外光谱仪:日本Shimadzu 公司；Biochrom30+氨基酸分析仪:英国百康公司。
泡沫分离装置由青海师范大学天然产物化学研究实验室自制，结构见图1。
图1 泡沫分离装置
Fig.1 Foam separation device
1.3 刚毛藻蛋白泡沫分离
刚毛藻经过清洗、分离、冷冻干燥等处理，采用索氏提取法除去刚毛藻中的脂质，然后对除脂后的刚毛藻进行过筛处理得到刚毛藻粉，再配制不同料液比的刚毛藻液利用高压细胞破碎机（4×107 Pa，2 min）对刚毛藻进行破壁处理，然后碱溶（pH10.0，温度为50 ℃，时间为2 h），离心（8×103 r/min，10 min），调节pH 值后进行泡沫分离，得到刚毛藻蛋白液，冷冻干燥得刚毛藻蛋白粉。刚毛藻蛋白的回收率和富集比计算公式如下。
式中:R 为回收率，%；E 为富集比；V0 为初始蛋白液体积，mL；Vf 为泡沫层蛋白液体积，mL；Vs 为残留蛋白液体积，mL；C0 为初始蛋白液中蛋白质量浓度，g/L；Cf 为泡沫层蛋白液中蛋白质量浓度，g/L；Cs 为残留蛋白液中蛋白质量浓度，g/L。
1.4 单因素试验
1.4.1 pH 值对刚毛藻蛋白泡沫分离的影响
在料液比为10.0∶1 （g/L）、温度为30 ℃、载液量为200 mL 的条件下，以回收率和富集比为指标，探究pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）对刚毛藻蛋白泡沫分离的影响。
1.4.2 料液比对刚毛藻蛋白泡沫分离的影响
在pH 值为5.0、温度为30 ℃、载液量为200 mL的条件下，以回收率和富集比为指标，探究料液比[5.0∶1、7.5∶1、10.0∶1、12.5∶1、15.0∶1 （g/L）]对刚毛藻蛋白泡沫分离的影响。
1.4.3 温度对刚毛藻蛋白泡沫分离的影响
在pH 值为5.0、料液比为10.0∶1 （g/L）、载液量为200 mL 的条件下，以回收率和富集比为指标，探究温度（25、30、35、40、45 ℃）对刚毛藻蛋白泡沫分离的影响。
1.4.4 载液量对刚毛藻蛋白泡沫分离的影响
在pH 值为5.0、料液比为10.0∶1 （g/L）、温度为30 ℃的条件下，以回收率和富集比为指标，探究载液量（200、225、250、275、300 mL）对刚毛藻蛋白泡沫分离的影响。
1.5 响应面试验设计
根据单因素试验结果，设计响应面Box-Behnken优化试验，以回收率和富集比为响应值。试验设计见表1。
表1 响应面因素水平设计
Table 1 Response surface factor level design
水平-1 01因素A pH 值4.5 5.0 5.5 B 料液比/（g/L）5.0∶1 7.5∶1 10.0∶1 C 温度/℃25 30 35 D 载液量/mL 200 225 250
1.6 刚毛藻蛋白功能性测定
1.6.1 刚毛藻蛋白持水量
在离心管中分别准确称量6 份0.05 g 刚毛藻蛋白粉，加5 mL 蒸馏水，在不同温度（20、30、40、50、60、70 ℃）下水浴加热1 h，3 000 r/min 离心15 min，除上清液后称沉淀质量。持水量计算公式如下。
式中:w 为持水量，g/g；m 为样品质量，g；m1 为样品和离心管的总质量，g；m2 为沉淀和离心管的总质量，g。
1.6.2 刚毛藻蛋白持油量
在离心管中分别准确称量6 份0.05 g 刚毛藻蛋白粉，加5 mL 豆油，在不同温度（20、30、40、50、60、70 ℃）下水浴加热1 h，3 000 r/min 离心15 min，除上清液后称沉淀质量。持油量计算公式如下。
式中:O 持油量，g/g；m 样品质量，g；m1 样品和离心管的总质量，g；m2 沉淀和离心管的总质量，g。
1.6.3 刚毛藻蛋白起泡性和泡沫稳定性
准确称量0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 g 刚毛藻蛋白粉并分别加20 mL 蒸馏水，配制成不同质量分数的刚毛藻蛋白溶液，10 000 r/min 均质2 min，均质结束立即测量泡沫体积，起泡性计算公式如下。
式中:t 为起泡性，%；V 为均质前的溶液体积，mL；V1 为均质结束时的泡沫体积，mL。
均质结束后静置30 min 测量泡沫体积，测定泡沫稳定性，计算公式如下。
式中:ts 为泡沫稳定性，%；V1 均质结束时泡沫体积，mL；V2 均质结束静置30 min 后的泡沫体积，mL。
1.6.4 刚毛藻蛋白乳化能力和乳化稳定性
准确称量0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 g 刚毛藻蛋白粉并分别加20 mL 蒸馏水，配制成不同质量分数的刚毛藻蛋白溶液，再分别加入10 mL 大豆油，10 000 r/min 均质2 min。均质结束立即吸取底部乳液20 µL，加5 mL SDS 水溶液（质量分数0.1 %）。以质量分数为0.1% 的SDS 水溶液为空白对照，测其在500 nm 处吸光度。乳化能力计算公式如下。
式中:e 为乳化能力，%；A500 为乳液在500 nm 波长处吸光度。
均质后的乳液静置30 min，测定静置30 min 后的乳液在500 nm 处吸光度。乳化稳定性计算公式如下。
式中:es 为乳化稳定性，%；A30 为乳液在静置30 min 后在500 nm 波长处吸光度；A500 为乳液在500 nm 波长处吸光度。
1.7 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform-infrared spectroscopy，FT-IR）测定
通过傅里叶变换红外光谱仪（KBr 压片法）测定刚毛藻蛋白结构，用Peakfit Version 软件对其进行二级结构分析，然后采用积分面积计算各二级结构的相对含量。
1.8 紫外可见分光光度（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）分析
用0.5 mol/L 醋酸水溶液配制2 g/L 刚毛藻蛋白溶液，以0.5 mol/L 冰醋酸为空白，通过双光束紫外-可见分光光度计在波长为200～400 nm 进行扫描。
1.9 氨基酸测定
采用氨基酸分析仪对刚毛藻蛋白进行测定。缓冲液流速20 mL/h，反应流速10 mL/h，分离柱Na 型阳离子树脂层析柱，长度直径200 mm×4.6 mm，紫外检测波长570、440 nm；柱温:55～65～77 ℃程序升温，反应槽温度138 ℃，进样量50 µL；以柠檬酸钠缓冲液作缓冲体系（pH 值为3.20、4.25、6.45）；0.04 mol/L 氢氧化钠作再生溶液。氨基酸在分离柱分离后与茚三酮反应，生成物可被分光光度计检出，从而得到氨基酸浓度。
1.10 数据处理
试验数据用Office Excel2010 整理分析；采用Design Expert 13 进行响应面设计与回归分析；Origin 2010. Peakfit Version 等软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 不同pH 值的影响
pH 值对刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响见图2。
图2 pH 值对刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响
Fig.2 Effect of pH on recovery rate and enrichment ratio of Cladophora protein
如图2 所示，随着pH 值的升高，回收率先升高后下降，富集比先下降后升高。这是因为在蛋白质达到等电点时，蛋白质分子会展现出良好的起泡性和泡沫稳定性，增加了其吸附能力；而当pH 值偏离等电点时，蛋白质分子带电，使蛋白质分子间静电荷和排斥力增加，溶解度升高，进而造成回收率和富集比的变化[17]。因此，综合考虑选择pH 值为4.5、5.0、5.5 进行下一步研究。
2.1.2 不同料液比的影响
料液比对刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响见图3。
图3 料液比对刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响
Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on recovery rate and enrichment ratio of Cladophora protein
如图3 所示，随着蛋白添加的增加，回收率升高，富集比下降。这是因为蛋白溶液浓度越高，越容易产生大量稳定泡沫，泡沫聚并现象弱，泡沫附带了较多的蛋白溶液，且泡沫上升过程变快，导致蛋白液不易回流，在提升回收率的同时，降低了富集比[18]。因此，综合考虑选择料液比5.0∶1、7.5∶1、10.0∶1 （g/L）进行下一步研究。
2.1.3 不同温度的影响
温度对刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响见图4。
图4 温度对刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响
Fig.4 Effect of temperature on recovery rate and enrichment ratio of Cladophora protein
如图4 所示，随着温度升高，回收率先升高后降低再上升，富集比先降低后升高。这是因为温度在35 ℃以下，溶液的黏度和表面张力极强，回流速度慢，泡沫稳定性不高，但在35 ℃以上，会使泡沫回流加快，泡沫强度降低，进而使泡沫稳定性变差[19]。因此，综合考虑选择温度25、30、35 ℃进行下一步研究。
2.1.4 不同载液量的影响
载液量对刚毛藻蛋白回收率和富集比影响见图5。
如图5 所示，随着载液量增加，回收率和富集比先升高后降低。这是因为载液量低时，泡沫稳定性好，停留时间长，泡沫表面附着了较多的蛋白溶液，导致回收率低富集比高；而载液量逐渐增大泡沫稳定性下降，停留时间缩短，回流速度增加，使回收率升高富集比降低。一般选择回收率较高的，载液量为225 mL 和250 mL 回收率变化较小，富集比变化较为明显[20]。因此，综合考虑选择载液量200、225、250 mL 进行下一步研究。
图5 载液量对刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响
Fig.5 Effect of liquid loading on recovery rate and enrichment ratio of Cladophora protein
2.2 响应面试验结果优化分析
2.2.1 响应面试验结果与方差分析
根据Box-Behnken 析因设计和回归分析的原理，以表1 为基础设计中心组合试验，共进行29 组重复试验，结果如表2 所示。
表2 响应面设计和结果
Table 2 Response surface design and results
序号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A pH 值4.5 5.5 4.5 5.5 5.0 5.0 5.0 5.0 4.5 5.5 4.5 5.5 5.0 5.0 5.0 5.0 4.5 5.5 4.5 5.5 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 B 料液比/（g/L）5.0∶1 5.0∶1 10.0∶1 10.0∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 5.0∶1 10.0∶1 5.0∶1 10.0∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 5.0∶1 10.0∶1 5.0∶1 10.0∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 7.5∶1 C 温度/℃30 30 30 30 25 35 25 35 30 30 30 30 25 25 35 35 25 25 35 35 30 30 30 30 30 30 30 30 30 D 载液量/mL 225 225 225 225 200 200 250 250 200 200 250 250 225 225 225 225 225 225 225 225 200 200 250 250 225 225 225 225 225回收率/%71.32 93.86 89.20 98.62 93.93 94.51 95.37 96.33 83.36 97.20 87.75 97.83 83.15 96.22 86.76 96.99 82.97 96.11 84.18 97.45 89.48 96.76 86.90 97.17 91.94 92.37 93.56 92.85 92.98富集比1.81 1.25 1.38 1.16 1.30 1.28 1.20 1.26 1.48 1.19 1.40 1.17 1.55 1.21 1.40 1.21 1.40 1.16 1.54 1.22 1.40 1.21 1.50 1.26 1.29 1.25 1.31 1.30 1.23
利用Design-Expert 13 软件对表2 数据拟合，得二项式拟合方程:回收率=92.74+6.86A+5.29B+0.705 8C+0.509 2D-3.28AB+0.032 5AC-0.940 0AD-0.710 0BC+0.747 5BD+0.095 0CD-2.78A2-1.96B2+0.233 7C2+1.81D2（P<0.000 1，R2=0.978 2）；富 集 比=1.28-0.155 0A-0.123 3B+0.007 5-0.005 8D+0.085 0AB-0.020 0AC+0.015 0AD+0.037 5BC-0.012 5BD+0.020 0CD+0.051 2A2+0.073 7B2-0.002 6C2-0.012 6D2（P<0.000 1，R2=0.929 1）。
表3 和表4 为回收率和富集比方差分析。
表3 回收率的方差分析
Table 3 Variance analysis of recovery rate
注:*表示影响显著，P<0.05 ；**表示影响极显著，P<0.01。
来源模型A pH 值B 料液比C 温度D 载液量AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失误项纯误差总和平方和1 072.41 564.30 335.92 5.98 3.11 43.03 0.004 2 3.53 2.02 2.24 0.036 1 50.18 24.89 0.354 4 21.28 23.94 22.42 1.52 1 096.36自由度14 111111111111111 4 10 4 28均方值76.60 564.30 335.92 5.98 3.11 43.03 0.004 2 3.53 2.02 2.24 0.036 1 50.18 24.89 0.354 4 21.28 1.71 2.24 0.379 8 F 值44.79 329.96 196.42 3.50 1.82 25.16 0.002 5 2.07 1.18 1.31 0.021 1 29.34 14.55 0.207 2 12.44 5.90 P 值<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.082 6 0.198 8 0.000 2 0.961 1 0.172 5 0.295 9 0.272 1 0.886 6<0.000 1 0.001 9 0.655 9 0.003 3 0.050 9显著性***********
表4 富集比的方差分析
Table 4 Variance analysis of enrichment ratio
注:*表示影响显著，P<0.05 ；**表示影响极显著，P<0.01。
来源模型A pH 值B 料液比C 温度D 载液量AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失误项纯误差总和平方和0.565 2 0.288 3 0.182 5 0.000 7 0.000 4 0.028 9 0.001 6 0.000 9 0.005 6 0.000 6 0.001 6 0.017 0 0.035 2 0.000 0 0.001 0 0.043 1 0.038 4 0.004 7 0.608 3自由度14 111111111111111 4 10 4 28均方值0.040 4 0.288 3 0.182 5 0.000 7 0.000 4 0.028 9 0.001 6 0.000 9 0.005 6 0.000 6 0.001 6 0.017 0 0.035 2 0.000 0 0.001 0 0.003 1 0.003 8 0.001 2 F 值13.11 93.62 59.28 0.219 2 0.132 6 9.38 0.519 6 0.292 3 1.83 0.203 0 0.519 6 5.51 11.43 0.014 1 0.335 5 3.25 P 值<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.646 9 0.721 2 0.008 4 0.482 9 0.597 3 0.198 0 0.659 2 0.482 9 0.034 1 0.004 5 0.907 3 0.572 8 0.133 4显著性*********
由表3、表4 可知，两个模型P 值均小于0.000 1，F 值均大于0.05，代表此回归模型可行性强，可用于模型内预测[21]。对于回收率模型，其相关系数R2=0.978 2，代表响应值变化为97.82%，调整后相关系数R2Adj=0.956 3，此数据表明该模型拟合度较好，误差较小，并由表3 进一步可知，影响因素大小顺序为pH 值>料液比>温度>载液量。对于富集比模型，其相关系数R2=0.929 1，代表响应值变化为92.91%，调整后相关系数R2Adj=0.858 3，此数据表明该模型拟合度较好，误差较小，并由表4 进一步可知，影响因素大小顺序为pH 值>料液比>温度>载液量。
2.2.2 响应面分析
图6 反映了各因素相互作用对泡沫分离刚毛藻蛋白回收率的影响。
图6 各因素对刚毛藻蛋白回收率影响响应曲面
Fig.6 Response surface of effect of experimental factors on recovery rate of Cladophora protein
由图6 可知，刚毛藻蛋白回收率随pH 值与料液比的变化而发生显著变化，pH 值、料液比越大刚毛藻蛋白回收率越大，其相互作用较强；而刚毛藻蛋白回收率随着温度与载液量变化其变化幅度小，并且其相互作用不大。
图7 反映了各因素相互作用对泡沫分离刚毛藻蛋白富集比的影响。
由图7 可知，刚毛藻蛋白富集比随pH 值与料液比的变化而发生较大变化，pH 值、料液比越小刚毛藻蛋白富集比越大，其相互作用较强；而刚毛藻蛋白回收率随着温度与载液量变化其变化幅度小，并且其相互作用不大[22]。
图7 各因素对刚毛藻蛋白富集比影响响应曲面
Fig.7 Response surface of effect of experimental factors on enrichment ratio of Cladophora protein
综合分析以上结果并结合回归模型，以回收率和富集比为指标，得到最佳优化条件:pH 值为4.88、料液比为5∶1 （g/L）、温度为35 ℃、载液量为 249.9 mL，在此条件下刚毛藻蛋白回收率为86.37%，富集比为1.518。为验证此优化结果，并考虑到实际情况，选用pH 值为4.9、料液比为5∶1 （g/L）、温度为35 ℃、载液量为 250 mL，结果为回收率87.74 %，富集比1.46。接近预测值，证明此工艺可行，该模型可用于泡沫分离刚毛藻蛋白。
2.3 刚毛藻蛋白功能分析
2.3.1 刚毛藻蛋白持水性分析
温度对刚毛藻蛋白持水性影响见图8。
由图8 可知，刚毛藻蛋白持水量整体随温度升高而降低，在20 ℃时其持水性最强，为3.32 g/g。产生这种情况的原因可能是，适当的温度会引起蛋白质一定的热变性，更有利于蛋白质分子的伸展，增强了蛋白质分子与水的作用力，而随温度升高，则增加了蛋白质分子间的作用力，附着水的能力下降，导致持水性下降[23]。
图8 温度对刚毛藻蛋白持水性影响
Fig.8 Effect of temperature on water holding capacity of Cladophora protein
2.3.2 刚毛藻蛋白持油性分析
温度对刚毛藻蛋白持油性影响见图9。
图9 温度对刚毛藻蛋白持油性影响
Fig.9 Effect of temperature on oil holding capacity of Cladophora protein
由图9 可知，刚毛藻蛋白持油量随温度升高先升高后降低，在50 ℃时其持油量最高，为9.27 g/g。产生这种情况的原因可能是，随着温度升高，蛋白质分子空间结构不断伸展，疏水基团部分暴露，使其持油性增强，而当温度超过50 ℃后，油的流动性不断增加，持油性降低[24]。
2.3.3 刚毛藻蛋白乳化能力和乳化稳定性分析
刚毛藻蛋白质量分数对乳化能力和乳化稳定性影响见图10。
图10 刚毛藻蛋白质量分数对乳化能力和乳化稳定性影响
Fig.10 Effect of mass fraction on emulsifying property and emulsion stability of Cladophora protein
由图10 可知，当刚毛藻蛋白质量分数为1.0%时，乳化能力和乳化稳定性达到最高，分别为68.8% 和75.73%，说明刚毛藻蛋白具有良好的乳化能力和乳化稳定性，且在质量分数为1.0%时最优。刚毛藻蛋白乳化能力和乳化稳定性随蛋白质质量分数的增加先升高后降低，产生这种情况的原因可能是，当蛋白质在一定范围浓度时，浓度越高，大豆油分布越广泛，并且在一定程度上黏性增强，而超过这个范围后，黏性的增强破坏了乳化能力和乳化稳定性的平衡，导致其开始降低[25]。
2.3.4 刚毛藻蛋白起泡性和起泡稳定性分析
刚毛藻蛋白质量分数对起泡性和泡沫稳定性影响见图11。
图11 刚毛藻蛋白质量分数对起泡性和泡沫稳定性影响
Fig.11 Effect of mass fraction on foaming property and foam stability of Cladophora protein
由图11 可知，起泡性和泡沫稳定性随质量分数增加呈先上升后下降的趋势，且在蛋白质量分数为0.8%时起泡性和泡沫稳定性达到最高。产生这种情况的原因可能是蛋白质在一定的浓度范围时，随蛋白浓度的增加，蛋白溶液黏性增加，泡沫容易形成且稳定；而当超过此浓度范围，黏度过大破坏其平衡，导致泡沫不易形成且不稳定[26]。
2.4 FT-IR 光谱结果
刚毛藻蛋白FT-IR 谱图见图12。使用Peakfit Version 软件对FT-IR 谱图中酰胺Ⅰ带分析并得出拟合图谱，结果见图13。
图12 刚毛藻蛋白FT-IR 谱图
Fig.12 FT-IR spectrum of Cladophora protein
图13 刚毛藻蛋白的酰胺Ⅰ带拟合谱图
Fig.13 Fitting spectrum of amide I band of Cladophora protein
如图12 所示，刚毛藻蛋白有许多特征峰，2 980～2 850 cm-1 为饱和碳C—H 伸缩振动，1 700～1 600 cm-1为酰胺Ⅰ带（C O 伸缩振动），1 600～1 500 cm-1 为酰胺Ⅱ带（C—N 伸缩振动和N—H 变形振动），1 420～1 350 cm-1为C—OH 振动，1 350～1 200 cm-1为酰胺Ⅲ带（C—O 和C—O—C 振动），1 100～1 060 cm-1 为P O或P—O—C 对称伸缩振动[27]。如图13 所示，每个峰代表FT-IR 谱图中1 700 ～1 600 cm-1 的二阶导数拟合，积分面积计算各二级结构的相对含量，结果如表5 所示。
表5 刚毛藻蛋白二级结构相对含量
Table 5 Relative content of secondary structure in Cladophora protein%
β-折叠28.92无规则卷曲20.30 α-螺旋17.30 β-转角33.48
由表5 可知，刚毛藻蛋白二级结构以β-转角为主，可达33.48%，β-折叠可达28.92%，无规则卷曲可达20.30%，α-螺旋可达17.30%，β-折叠和α-螺旋是较为有序的蛋白二级结构，有较高稳定性，β-转角和无规则卷曲是无序结构[28]。
2.5 UV-Vis 光谱测定
刚毛藻蛋白UV-Vis 吸收光谱见图14。
图14 刚毛藻蛋白UV-Vis 吸收光谱
Fig.14 UV-Vis absorption spectra of Cladophora protein
如图14 所示，刚毛藻蛋白在280 nm 左右达到最大吸收，这是因为蛋白中含有具有共轭双键的芳香族氨基酸（如色氨酸、酪氨酸等）。由于肽键中的羰基电子跃迁，在230 nm 处有吸收峰，符合Ⅰ型胶原蛋白三股螺旋结构的紫外吸收特征[29]。
2.6 氨基酸测定
刚毛藻蛋白氨基酸组成见表6。
表6 刚毛藻蛋白氨基酸组成
Table 6 Amino acid composition of Cladophora protein
注:*为必需氨基酸；疏水氨基酸有丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸。
氨基酸名称天冬氨酸苏氨酸*丝氨酸谷氨酸甘氨酸丙氨酸胱氨酸缬氨酸*蛋氨酸*异亮氨酸*含量/（mg/g）49.734 21.546 20.193 63.479 20.966 22.422 8.194 22.526 10.671 15.866占比/%11.77 5.10 4.78 15.03 4.96 5.31 1.94 5.33 2.53 3.76氨基酸名称亮氨酸*酪氨酸苯丙氨酸*组氨酸*赖氨酸精氨酸脯氨酸必需氨基酸疏水氨基酸总氨基酸含量/（mg/g）29.158 21.837 22.084 10.568 32.816 30.281 20.112 132.419 164.680 422.453占比/%6.90 5.17 5.23 2.50 7.77 7.17 4.76 31.35 38.98 100
如表6 所示，刚毛藻蛋白中氨基酸总量可达422.453 mg/g，其中谷氨酸含量最高，可达63.479 mg/g，占总氨基酸含量的15.03%；必需氨基酸为132.419 mg/g，占总氨基酸含量的31.35%；疏水氨基酸为164.680 mg/g，占总氨基酸含量的38.98%[30]。
3 结论
通过泡沫分离法对刚毛藻蛋白进行提取，以回收率和富集比作为指标，通过单因素试验确定了料液比、载液量、温度、pH 值的最佳条件，并通过响应面法对提取工艺进行优化，同时对刚毛藻蛋白的理化性质进行了分析，采用傅里叶变换红外光谱仪、双光束紫外分光光度计对蛋白结构进行分析，并对其进行氨基酸测定。结果表明，泡沫分离法提取刚毛藻蛋白最佳条件为料液比5∶1 （g/L）、载液量 250 mL、温度35 ℃、pH4.9，在此条件下刚毛藻蛋白回收率为87.74%，富集比为1.46。刚毛藻蛋白持水性和持油量分别在20 ℃和50 ℃时最大，为3.32 g/g 和9.27 g/g。刚毛藻蛋白乳化能力和乳化稳定性呈先上升后下降趋势，在质量分数为1.0 %时最佳；起泡性和泡沫稳定性呈先上升后下降趋势，在质量分数为0.8 %时最佳。FT-IR 和UV-Vis 图谱显示，刚毛藻蛋白在230 nm 和280 nm 处有蛋白特征峰，二级结构β-转角相对含量最大，可达33.48%。蛋白中氨基酸总量可达422.453 mg/g，谷氨酸含量最高，可达63.479 mg/g，占15.03%；必需氨基酸占31.35%；疏水氨基酸占38.98%。研究表明泡沫分离是一种操作简单、可行性强的方法，此工艺优化为刚毛藻蛋白的后续研究提供依据。
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