低乳糖牛乳是将生牛乳通过乳糖酶水解或膜过滤的方式降低其乳糖含量，以适合乳糖不耐症人群食用的一种乳制品[1]。其中，水解法制备的低乳糖牛乳中的乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，在采用巴氏杀菌处理后更易发生美拉德反应，造成其在贮藏过程中发生变色、变味等品质变化[2]。非热杀菌技术指不经过加热处理的方法对食品进行杀菌处理以满足货架期的要求，同时可降低蛋白质的变性程度及美拉德反应的发生[3]。食品中的非热杀菌主要分为物理杀菌和化学杀菌，如超高压杀菌[4-5]、脉冲电场杀菌[6]、超声波杀菌[7]、辐照杀菌[8]、紫外线杀菌[9]等。其中超声波（ultrasound，US）杀菌技术一般采用20～100 000 Hz 的超声频率来进行杀菌[10]。超声波可以应用于乳品工业中的许多方面，如提取、均质、脱气以及灭活微生物等[11]。用超声波处理生牛乳不仅可以灭活微生物、均质，而且还能很好保留牛奶中的蛋白质、脂肪和乳糖等物质，是一种前景广阔的冷杀菌技术[12]。
超声波灭活乳中微生物的原理主要是利用超声波的空化效应[13]。空化效应表现为超声处理过程中，振幅足够大的声波通过液体传播在液体介质内部产生空化泡，由于超声波的压缩、减压使得空化泡迅速崩溃，产生较高的温度和压力并最终导致微生物失活死亡。在超声波处理过程中会引起介质强烈振动，介质分子的运动越来越快、分子之间相互作用力也越来越大，从而导致介质温度升高的现象被称为超声波的热效应[13]。另外，微生物从超声能量中吸收声能并在内部发生热效应，导致细胞内的酶变性而失活，从而影响其新陈代谢，当热效应达到一定程度时微生物的细胞壁及其他组织结构也会遭到破坏，最终使得微生物死亡。
基于超声波杀菌的特点，本文采用不同条件的超声波处理低乳糖牛乳，评价其在4 ℃贮藏21 d 内pH值、酸度、新鲜度、稳定性、功能成分等理化指标和感官指标的变化，以明确超声波处理对低乳糖牛乳品质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生牛乳:市售；乳糖酶（5 000 NLU/g）、亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铵:上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠:天津市致远化学试剂有限公司；硫酸铜:天津市光复精细化工研究所；硫酸钾、硫酸、盐酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、D-乳糖、无水乙醇、硼酸、氯化钠、甲醇、乙腈:天津市科密欧化学试剂有限公司；酚酞试剂:中国精化科技研究所；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA ）蛋白浓度测定试剂盒:上海科艾博生物技术有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
FA2004N 电子天平:美国双杰兄弟有限公司；HH水浴锅:常州市金坛友联仪器研究所；KQ-250DE 超声波:上海蚁霖科学仪器有限公司；S400-K pH 计:上海梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-1200PC 紫外可见分光光度计:上海天美科学仪器有限公司；HGK-55 自动凯氏定氮仪:上海沛欧分析仪器有限公司；BK-VX2 涡旋机:江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Agilent 1260 高效液相色谱仪:美国安捷伦科技公司；HBS-1101 酶标仪:山东莱恩德智能科技有限公司；Allegra X-30 离心机:上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 低乳糖牛乳制备
利用乳糖酶水解生牛乳中乳糖，从而制备低乳糖牛乳[14]。以生牛乳为原料，在水解温度37 ℃、酶添加量0.015 %、水解时间1.5 h 条件下制备低乳糖牛乳，待乳糖水解率在90%左右即水解结束，之后迅速速升温至75 ℃进行30 s 灭酶处理，然后迅速冷却到室温以下，即可得到低乳糖牛乳。
1.3.2 超声波处理方法
1.3.2.1 杀菌流程
将与恒温水槽连接的夹套烧杯用去离子水冲洗3 遍，并用75 ℃以上的烘箱对烧杯进行烘干杀菌，加入300 mL 低乳糖牛乳，设定超声温度，开始进行超声处理（超声设备的频率为25 kHz），然后对低乳糖牛乳进行不同超声功率和超声时间的超声波处理。超声处理的过程中保持温度在20～35 ℃，超声完成后立即取样，测定酸度与pH 值，然后将余下的低乳糖牛乳在4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.2.2 操作要点
准确称取100 mL 低乳糖牛乳，固定超声功率100 W，考察超声时间5、10、15、20 min 对低乳糖牛乳杀菌效果的影响，记为100/5、100/10、100/15、100/20；固定超声功率150 W，考察超声时间5、10、15、20 min对低乳糖牛乳杀菌效果的影响，记为150/5、150/10、150/15、150/20；固定超声功率200 W，考察超声时间5、10、15、20 min 对低乳糖牛乳杀菌效果的影响，记为200/5、200/10、200/15、200/20；固定超声功率250 W，考察超声时间5、10、15、20 min 对低乳糖牛乳杀菌效果的影响，记为250/5、250/10、250/15、250/20。
1.3.3 酸度、pH 值的测定
1.3.3.1 酸度测定
采用滴定法[15]测定酸度。吸取10 mL 样品于150 mL锥形瓶中，加入20 mL 蒸馏水和2 mL 参比溶液混匀作参比颜色；另外于在150 mL 锥形瓶中，加入20 mL 蒸馏水、10 mL 奶样和适量的0.5%的酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定，滴定终点颜色为淡粉色，并保持60 s不变，10 倍消耗的NaOH 溶液体积即为酸度（°T）。
1.3.3.2 pH 值测定
采用电位滴定仪测定pH 值。取25 mL 样品，振荡混匀，测其pH 值，重复3 次，取平均值，测定均在室温下进行。
1.3.4 组织状态稳定性试验
1.3.4.1 热稳定性试验
取10 mL 生牛乳和未经超声处理的低乳糖牛乳以及经过不同条件处理后的低乳糖牛乳于试管中，沸水浴5 min，观察管壁是否有絮状沉淀、凝固等现象，若有絮片、颗粒、沉淀产生，则为阳性反应，用“+”表示；若无絮片、颗粒、沉淀产生，即为阴性反应，用“-”表示。
1.3.4.2 酒精稳定性试验
吸取5 mL 鲜牛乳和未经超声处理的低乳糖牛乳以及经过不同条件处理后的低乳糖牛乳于平皿中，分别加入5 mL 70%酒精，边加边摇，使酒精与样品均匀混合，并观察现象，记录数据及试验现象。若有絮片、颗粒、沉淀产生，则为阳性反应，用“+”表示；若无絮片、颗粒、沉淀产生，即为阴性反应，用“-”表示。
1.3.5 浊度测定
参照Partschefeld 等[16]的方法，用紫外可见分光光度计在860 nm 处测定吸光度。
1.3.6 乳化性质测定
参照Jiang 等[17]的方法略作修改，将低乳糖牛乳制成蛋白含量为0.5%的溶液，用紫外可见分光光度法在500 nm 处测定吸光度。
1.3.7 乳铁蛋白含量测定
低乳糖牛乳中乳铁蛋白含量测定采用酶联免疫法。取新鲜牛乳和低乳糖牛乳置于离心管中，在4 ℃、2 000×g 下离心20 min 后，将上层漂浮乳脂去除。剩余低乳糖牛乳转移至10 mL 高速离心管中，在25 ℃、10 000×g 下离心20 min。然后使用注射器吸取中间透明的乳清3 mL 于洁净的离心管中，根据BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书测定乳铁蛋白含量[18]。并以吸光度为纵坐标，乳铁蛋白含量为横坐标绘制乳铁蛋白含量测定的标准曲线，线性回归方程为Y=0.009 2x+0.056 2，R2=0.995 5。
1.3.8 维生素C 含量测定
低乳糖牛乳中维生素C（抗坏血酸）含量的测定参照陈治明等[19]的方法。
1.3.9 维生素B2 含量测定
参照王艳芳等[20]的方法，采用紫外可见分光光度计在444 nm 处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，牛乳体积为横坐标绘制标准曲线，线性回归方程为Y=0.012 1x+0.001，R2=0.999 6。
1.3.10 感官评定
参考GB 25190—2010《食品安全国家标准 灭菌乳》进行适当修改。取适量经不同超声处理后的低乳糖牛乳置于50 mL 烧杯中，并在室温自然光下观察其色泽和组织状态，嗅闻气味、品尝滋味后，根据评分要求对每个样品进行打分。所有样品平行测定3 次，取其平均值，具体评分标准见表1。
表1 感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
项目色泽（10 分）滋味、气味（10 分）组织状态（10 分）要求不均匀的黄褐色均匀一色，但有黄褐色均匀一致乳白色有明显的酸味乳香味略淡，但无酸味有乳香味且无异味有黏稠、凝块和分层现象均匀流体、有微量絮状物沉淀或脂肪上浮均匀流体、无沉淀、无杂质、无脂肪上浮分值1～<4 4～<8 8～10 1～<4 4～<8 8～10 1～<4 4～<8 8～10
1.4 数据处理
本试验所有数据均为3 重复试验的平均值，试验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 26.0 进行数据处理与分析，采用Origin 2021 作图。
2 结果与分析
2.1 超声波杀菌对低乳糖牛乳酸度及pH 值的影响
2.1.1 超声波杀菌对低乳糖牛乳酸度的影响
相同超声功率不同超声时间条件下制得的低乳糖牛乳在4 ℃下贮藏21 d 的酸度变化见图1。
图1 不同超声波杀菌条件下酸度变化
Fig.1 Changes in acidity of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions
A. 100 W 超声功率；B. 150 W 超声功率；C. 200 W 超声功率；D. 250 W 超声功率。
由图1 可知，本试验中低乳糖牛乳的酸度均在12 °T 以上。随着贮藏时间的延长酸度逐渐上升，超声功率固定时，随着超声时间的延长，酸度先缓慢上升后迅速上升；不同超声处理的低乳糖牛乳贮藏15 d 后差异较大，其中150 W、10 min 和 250 W、15 min 表现较为明显。在贮藏15 d 内，不同杀菌条件处理下，酸度上升缓慢。在超声时间15 min 的条件下，酸度上升较快达到临界值18 °T；在超声时间10 min 条件下，酸度上升较为缓慢，基本在12～15 °T。在贮藏15 d 后，酸度有明显上升，但低乳糖牛乳的酸度上升情况略有不同，在超声时间15 min 条件下，酸度大幅度上升超出12～18 °T，发生酸败情况；在超声时间10 min 条件下，酸度上升缓慢，基本在12～18 °T。这是因为超声波的热效应使得牛乳的温度持续升高，从而导致低乳糖牛乳中的蛋白质受热分解，使得牛乳中的酸度上升。刘媛丽[21]研究表明，超声波处理对抑制牛乳酸败变质有一定的作用。由此可知，低乳糖牛乳贮藏的最适超声波条件为150 W、10 min。
2.1.2 超声波杀菌对低乳糖牛乳pH 值的影响
同一超声功率不同超声时间的低乳糖牛乳pH 值的变化见图2。
图2 不同超声波杀菌条件下pH 值变化
Fig.2 Changes in pH of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions
A. 100 W 超声功率；B. 150 W 超声功率；C. 200 W 超声功率；D. 250 W 超声功率。
由图2 可知，在贮藏过程中低乳糖牛乳的pH 值始终小于7，处于略偏酸性的环境中，且随着贮藏时间的延长pH 值逐渐降低；在贮藏15 d 内，pH 值下降趋势较缓慢。不同超声处理的低乳糖牛乳在贮藏15 d后差异变化较大，其中150 W、10 min 和 250 W、15 min表现较为明显。贮藏后期根据杀菌条件的不同pH 值呈现不同的结果。超声10 min 时，超声功率100、150、200 W 和250 W 条件下均能贮藏18 d 不发生酸败，且150 W 时能贮藏21 d，pH 值为6.4。在贮藏15 d 内，超声功率150 W 时，随着超声时间延长pH 值缓慢下降，pH 值在6.4 以上；在贮藏15 d 后，超声功率150 W，超声10 min 时pH 值下降最缓慢。由此可知，低乳糖牛乳在贮藏期间的最适杀菌条件为150 W、10 min。这是由于超声的热效应，导致蛋白质分解和变性，引起酪蛋白沉淀，使得牛乳酸度增加和pH 值降低。刘媛丽[21]研究表明，超声波处理可以抑制牛乳pH值的下降，与本文研究结果相同。
2.2 超声波杀菌对低乳糖牛乳稳定性的影响
2.2.1 超声波杀菌对低乳糖牛乳热稳定性的影响
低乳糖牛乳在不同超声条件4 ℃下贮藏21 d 的热稳定性变化见表2。
表2 低乳糖牛乳在不同超声条件4 ℃下贮藏21 d 的热稳定性变化
Table 2 Thermal stability of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions and stored at 4 ℃ for 21 days
注:-表示阴性反应；+表示阳性反应。
杀菌条件100/5 100/10 100/15 100/20 150/5 150/10 150/15 150/20 200/5 200/10 200/15 200/20 250/5 250/10 250/15 250/25未杀菌低乳糖牛乳生牛乳0 d------------------3 d------------------6 d------------------9 d----------------++12 d----------------++15 d----------------++18 d++++++++++++++++++21 d++++++++++++++++++
由表2 可以看出，贮藏前6 d，各组均没有出现颗粒物或沉淀。贮藏第9 天开始，生牛乳和未处理低乳糖牛乳有颗粒絮状物生成，而低乳糖牛乳中未出现颗粒物或沉淀。贮藏第18 天，经超声处理的低乳糖牛乳出现颗粒絮状物。表明低乳糖牛乳的稳定体系已经被破坏。这是由于超声波杀菌使蛋白质的空间结构发生改变，使得热稳定性提高。这与王喜波等[22]研究结果相同。
2.2.2 超声波杀菌对低乳糖牛乳酒精稳定性的影响
低乳糖牛乳在不同超声条件4 ℃下中贮藏21 d的酒精稳定性变化见表3。
表3 低乳糖牛乳在不同超声条件4 ℃下中贮藏21 d 的酒精稳定性变化
Table 3 Alcohol stability of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions and stored at 4 ℃ for 21 days
注:-表示阴性反应；+表示阳性反应。
杀菌条件100/5 100/10 100/15 100/20 150/5 150/10 150/15 150/20 200/5 200/10 200/15 200/20 250/5 250/10 250/15 250/25未杀菌低乳糖牛乳生牛乳0 d------------------3 d------------------6 d------------------9 d----------------++12 d----------------++15 d----------------++18 d++++++++++++++++++21 d++++++++++++++++++
由表3 可以看出，贮藏前6 d，均没有出现颗粒物或沉淀。贮藏第9 天，生牛乳和未处理低乳糖牛乳有颗粒絮状物生成，而超声处理低乳糖牛乳中未出现颗粒物或沉淀。贮藏第18 天，经超声处理的低乳糖牛乳出现颗粒絮状物。出现颗粒絮状物说明其酸度较高，新鲜度差，而经过超声波杀菌处理会使蛋白质的空间结构发生改变，稳定性提高，牛乳的新鲜度提高。这与王喜波等[22]研究结果相同，经过杀菌后的牛乳稳定性明显提高。
2.3 超声波杀菌对低乳糖牛乳浊度的影响
不同超声波杀菌条件下浊度变化见图3。
由图3 可知，在150 W 超声功率范围内，随着超声时间的延长，牛乳的浊度小幅下降。但是与150 W 相比，200、250 W 牛乳的浊度较高。张安琪等[23]发现杀菌处理使酪蛋白胶束发生分裂，粒径减小，因此浊度降低。由于超声处理的热效应，低乳糖牛乳温度升高，影响酪蛋白的稳定性，导致其粒径增大，从而减缓浊度的降低。
图3 不同超声波杀菌条件下浊度变化
Fig.3 Changes in turbidity of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions
不同小写字母表示存在显著性差异，P<0.05。
2.4 超声波杀菌对低乳糖牛乳乳化性质的影响
将油和水进行混合处理，酪蛋白分子的亲水性和亲油性使其具有向油水界面扩散的倾向，其中疏水性部分朝向脂质，而亲水性部分则朝向水相，从而降低了油水界面的张力并形成薄膜，从而表现出优异的乳化性能。因此，测定乳状液膜对不同种类物质的乳化能力可以评价其乳化性。蛋白质的乳化性可以通过乳化活力和乳化稳定性两个指标进行表征[24]。不同超声波杀菌条件下乳化性质变化见图4 和图5。
图4 不同超声波杀菌条件下乳化活力指数变化
Fig.4 Changes in emulsifying vitality index of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions
不同小写字母表示存在显著性差异，P<0.05。
由图4 可知，当超声功率在150 W、处理10 min内，低乳糖牛乳乳化活力指数增加，并在10 min 时达到最大，之后缓慢降低。当超声功率超出150 W 时，随着超声时间的延长，低乳糖牛乳乳化活力指数整体降低。由图5 可知，当超声功率在150 W 内，乳化稳定性随超声时间的延长而增大。当超声功率超出150 W 时，超声5 min 内，低乳糖牛乳乳化稳定性显著增加，并在5 min 时达到最大，之后缓慢降低。
图5 不同超声波杀菌条件下乳化稳定性变化
Fig.5 Changes in emulsifying stability of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions
不同小写字母表示存在显著性差异，P<0.05。
超声处理后，乳清蛋白表面疏水性增加，表明超声引起乳清蛋白三级结构发生改变，引起乳清蛋白中聚集体变小，提升了乳清蛋白的乳化性。王喜波等[22]研究表明，经过杀菌处理的原料乳乳化活性和乳化稳定性会得到提升。
2.5 超声波杀菌对低乳糖牛乳中乳铁蛋白含量的影响
乳铁蛋白是一种天然的多功能铁结合糖蛋白。乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有抗菌、抗病毒感染、抑制人体肿瘤细胞等作用；还能调节体内铁的平衡，调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力[25-27]。不同超声波杀菌条件下乳铁蛋白含量变化见图6。
图6 不同超声波杀菌条件下乳铁蛋白含量变化
Fig.6 Changes in lactoferrin content of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions
不同小写字母表示存在显著性差异，P<0.05。
如图6 所示，经过100/10、150/5、150/10 和150/20超声处理后，低乳糖牛乳中的乳铁蛋白的含量变化不大，说明牛乳中的活性物质得到了有效保留，适宜超声处理不会引起乳铁蛋白的严重损失。超声处理虽然会产生热效应，但本研究选择的超声处理强度相对温和，牛乳的实际温度大概在40 ℃以下，所以不会造成明显的蛋白热损伤。任璐[28]研究表明，降低热处理强度，能更好保留牛乳中的活性物质。
2.6 超声波杀菌对低乳糖牛乳中维生素C 的影响
维生素C 又称 L-抗坏血酸，在各类新鲜水果和蔬菜中广泛分布，是一种脂溶性维生素，具有维持细胞膜完整性、调节细胞功能及抗氧化等生理功能，对人体健康有着重要影响。该物质表现出高度的不稳定性，容易在光照和氧气等条件下发生分解，而在酸性环境下则相对稳定，若人体缺乏维生素C，则可能患坏血病。不同超声波杀菌条件下维生素C 含量变化见图7。
图7 不同超声波杀菌条件下维生素C 含量变化
Fig.7 Changes in vitamin C content of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions
不同小写字母表示存在显著性差异，P<0.05。
由图7 可知，低乳糖牛乳中维生素C 的含量为（7.5±1.5）µg/mL。作为一种非热杀菌技术，超声波能够更好地保留热敏性营养成分，并且在超声处理后，低乳糖牛乳中的维生素C 含量高于生牛乳。这是由于超声波所产生的空穴效应可消除溶解氧，从而有效地抑制维生素C 的有氧分解，同时由于底物缺乏，维生素C 的厌氧分解也会受到间接抑制。刘海燕[29]研究表明，热处理导致维生素C 的损失，经7 d 冷藏，维生素C 发生了降解，而超声波处理可使得维生素C 的分解速率降低。
2.7 超声波杀菌对低乳糖牛乳中维生素B2 含量的影响
维生素B2，又称为核黄素，是B 族维生素的一种水溶性维生素，微溶于水，易溶解在碱性溶液中，在强酸溶液中稳定，耐热、耐氧化。维生素B2 广泛存在于各类食品中，一般在动物性食品中的含量高于植物性食物。因此，探究不同超声波杀菌条件下低乳糖牛乳中维生素B2 含量的变化有重要意义。不同超声波杀菌条件下维生素B2 含量变化见图8。
图8 不同超声波杀菌条件下维生素B2 含量变化
Fig.8 Changes in vitamin B2 content of low-lactose milk sterilized under different ultrasonic conditions
相同小写字母表示不存在显著性差异，P>0.05。
由图8 可知，经过超声处理的低乳糖牛乳维生素B2 含量与生牛乳相比无明显变化，与任璐[28]研究结果相同。由此可知，超声处理对低乳糖牛乳中维生素B2的含量几乎没有影响，能够很好地使乳中的维生素B2保持稳定。
2.8 感官评价结果与分析
不同超声波杀菌条件对低乳糖牛乳感官的影响见图9。
图9 不同超声波杀菌条件对低乳糖牛乳感官的影响
Fig.9 Effects of different ultrasonic conditions on the sensory quality of low-lactose milk
A.色泽；B.滋味、气味；C.组织状态；不同小写字母表示存在显著性差异，P<0.05。
如图9 所示，与生牛乳相比，经过不同超声处理的低乳糖牛乳在色泽方面略有改善，但变化并不明显；而在滋味、气味方面有较大改善，与刘飞云等[30]研究结果一致。这可能是由于乳糖水解发生美拉德反应产生了更多的挥发性芳香物质，大大改善了牛乳的香味；另外，当低乳糖牛乳经150 W 的超声处理，其组织状态明显得以改善；当超出150 W 时，随着超声时间的延长，其组织状态反而变差，这可能是由于过高的超声处理可能使低乳糖牛乳中的蛋白和脂肪等降解，从而导致感官品质下降。
3 结论
本文通过不同条件的超声波杀菌处理发现，超声波处理功率为150 W、超声时间10 min 时，低乳糖牛乳贮藏时间可延长至15 d 以上。超声波杀菌这种非热杀菌技术，既可以延长食品货架期，又可降低食品中蛋白质的变性及美拉德反应的发生，而且超声波的热效应、空穴效应等对其功能性成分影响不大。因此，这种非热杀菌技术可以为后续低乳糖牛乳的杀菌条件提供一种参考。
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