食用菌多糖是一类从食用菌菌丝体、子实体或发酵液中提取得到的天然高分子聚合物,具有多种功能活性和应用价值[1]。研究表明,食用菌多糖具有增强免疫力[2]、抑制肿瘤生长[3]、降低血糖[4]、调节肠道菌群[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]等多种功效,是一种重要的药用和保健原料。此外,食用菌多糖还在食品工业领域得到广泛应用,在食品中添加食用菌多糖,可以有效增强其营养价值和健康功效[8]。随着人们对健康饮食和保健意识的不断增强,食用菌多糖受到越来越多的关注。对于食用菌多糖的研究和应用将会更加深入和广泛,展现出广阔的前景。
胶状鳞伞菌是一种从南洞庭湖畔芦苇荡里筛选、驯化、培育的本地特色食用菌品种[9],其子实体一般呈黄色或黄褐色,直径为4~17 cm,菌盖上附有一层黏性胶状物质,因而被称为胶状鳞伞菌[10]。胶状鳞伞菌具有较高的营养价值,除了含有丰富的蛋白质和多种必需氨基酸以及维生素、矿物质等营养成分,还含有多糖、多酚、生物碱等生物活性成分,且该食用菌味道鲜美、风味独特,是一种优质的药食两用食用菌[11],具有一定的研究开发价值。目前,关于胶状鳞伞菌的研究报道甚少,特别是关于胶状鳞伞菌多糖的提取及其活性的研究未见报道。
本研究以胶状鳞伞菌为原料,采用水提醇沉法制备多糖,并对胶状鳞伞菌多糖的理化性质进行分析,明确其基本化学成分及结构,最后探究其体外抗氧化活性、对肿瘤细胞增殖的作用、降血糖活性,以期为胶状鳞伞菌多糖的深入开发以及综合应用提供参考,为胶状鳞伞菌多糖更好地应用于食品、药品等领域提供理论支持,实现胶状鳞伞菌价值及经济效益的最大化。
胶状鳞伞菌粉:沅江市芦小妹食品有限公司;葡萄糖标准品(纯度≥98%):北京索莱宝科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;α-淀粉酶(3 700 U/g)、阿卡波糖、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]细胞增殖试剂盒、考马斯亮蓝(Bradford)蛋白浓度测定试剂盒:北京索莱宝科技有限公司;超氧阴离子、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]自由基清除能力检测试剂盒:苏州科铭生物技术有限公司;DMEM 高糖培养基、RPMI-1640 培养基、青霉素-链霉素、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS):以色列Biological Industries(BI)公司;HepG2 细胞、BGC-823 细胞、Caco-2 细胞:湖南丰晖生物科技有限公司;三氯甲烷、硫酸亚铁、正丁醇、浓硫酸(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司。
真空冷冻干燥机(LGJ-18C):北京四环科学仪器厂有限公司;全波长酶标仪(Multiskan GO):赛默飞世尔科技(中国)有限公司;傅里叶变换红外光谱仪(FTIR-8400S):日本岛津公司;纳米粒度仪(Nano-ZS):英国Malvern 公司;高效液相色谱仪(Agilent 1100):美国安捷伦科技有限公司;凝胶渗透色谱仪:美国Waters 公司;倒置显微镜(CKX41):奥林巴斯(中国)有限公司;二级生物安全柜(BHC-1000IIA/B3):苏州市华宇净化设备有限公司。
1.3.1 胶状鳞伞菌基本成分测定
水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸的含量分别采用GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法、GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中的灼烧法、GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法、GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法、GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中的方法进行测定。
1.3.2 胶状鳞伞菌多糖的制备
将胶状鳞伞菌粉末按照料液比1∶80 (g/mL)加入蒸馏水,沸水浴提取2 h 后离心10 min(9 500 r/min、10 ℃);沉淀加入蒸馏水进行二次浸提离心,合并两次滤液加入其3 倍体积的无水乙醇,4 ℃醇沉12 h,离心10 min(9 500 r/min、4 ℃)收集沉淀后加入适量无水乙醇脱色,再次离心将沉淀复溶于蒸馏水中。在多糖溶液中加入其1/4 体积现配的Sevage 试剂(三氯甲烷与正丁醇的体积比为4∶1),剧烈振荡30 min,10 000 r/min离心15 min,弃去蛋白层,重复上述步骤多次,将溶液再次剧烈振荡30 min 后于分液漏斗中静置6 h,取上层水相。将多糖水溶液转移至透析袋4 ℃透析72 h,每12 h 换超纯水,冷冻干燥3 d 后得胶状鳞伞菌多糖。
1.3.3 胶状鳞伞菌多糖理化性质测定
1.3.3.1 基本成分测定
水分含量的测定同1.3.1;总糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定;蛋白质含量按照Bradford 蛋白浓度测定试剂盒进行测定;还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法进行测定。
1.3.3.2 红外光谱测定
称取胶状鳞伞菌多糖1.00 mg 以及150 mg 干燥KBr 混合,研磨均匀,压制成薄片,在4 000~400 cm-1范围内进行红外光谱扫描。
1.3.3.3 单糖组成测定
参照文献[12]的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)柱前衍生化高效液相色谱法进行胶状鳞伞菌多糖的单糖组成测定。高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器)色谱柱C18 柱(250 mm×4.6 mm,5 µm);流动相A 为100 mmol/L 磷酸钠缓冲液(pH6.7);流动相B 为乙腈;检测波长250 nm;柱温30 ℃;流速1 mL/min;进样量5 µL。
1.3.3.4 分子量测定
将 不 同 分 子 量(5.8、19.0、51.5、185.0、591.0、1 214.0 kDa)的聚乙二醇分子量标准品及胶状鳞伞菌多糖用超纯水配制成5 mg/mL 的溶液,过0.22 µm 水相膜备用。凝胶渗透色谱仪(gel permeation chromatography,GPC):Waters 1525 型色谱仪配Waters 2414 示差折光检测器;检测条件为色谱柱:PL aquagel-OH MIXED(7.8 mm×300 mm,8 µm);流 动 相0.2 mol/L NaNO3、0.01 mol/L NaH2PO4(pH7);流速1 mL/min;进样量10 µL;温度30 ℃。
1.3.3.5 粒径和电位测定
称取5 mg 胶状鳞伞菌多糖,加入超纯水配制成1 mg/mL 的多糖溶液,检测粒径及电位,重复扫描3 次。
1.3.4 体外生物活性测定
1.3.4.1 抗氧化活性
1)DPPH 自由基清除能力的测定
参照文献[13]的方法,进行胶状鳞伞菌多糖DPPH自由基清除能力的测定。配制与胶状鳞伞菌多糖质量浓度梯度相同的抗坏血酸溶液作为对照,将1 mL 胶状鳞伞菌多糖溶液或对照溶液与等量100 µmol/L DPPH溶液(使用无水乙醇溶解)加入棕色试管中,混匀后于暗处静置30 min,取出后8 000 r/min 离心10 min,取上清液,测定各组OD517 nm 值。按下式计算胶状鳞伞菌多糖的DPPH 自由基清除率(Y1,%)。
式中:A1 为试验组吸光度;A2 为对照组吸光度度(无水乙醇代替DPPH 溶液);A0 为试验组空白吸光度(蒸馏水代替样品)。
2) 羟自由基清除能力的测定
参照严尚隆[14]的方法,进行胶状鳞伞菌多糖羟自由基清除能力的测定。按下式计算胶状鳞伞菌多糖的羟自由基清除率(Y2,%)。
式中:A1 为样品吸光度;A2 为蒸馏水代替水杨酸吸光度;A0 为蒸馏水代替样品吸光度。
3)ABTS+自由基清除能力的测定
采用ABTS+自由基清除能力检测试剂盒检测胶状鳞伞菌多糖溶液的ABTS+自由基清除率(Y3,%)。
式中:A0为蒸馏水代替样品吸光度;A1为样品吸光度。
4)超氧阴离子自由基清除能力的测定
采用超氧阴离子自由基清除能力检测试剂盒检测胶状鳞伞菌多糖溶液的超氧阴离子自由基清除率(Y4,%)。
式中:A0 为蒸馏水代替样品吸光度;A1 为样品吸光度。
5)还原力的测定
参照向瑞琪等[15]的测定方法,进行胶状鳞伞菌多糖还原力的测定,以吸光度的大小表示胶状鳞伞菌多糖的还原力(Y5)。
式中:A0 为蒸馏水代替样品吸光度;A1 为样品吸光度。
1.3.4.2 抗肿瘤活性的测定
将活化后的肿瘤细胞(BGC-823 细胞、HepG2 细胞、Caco-2 细胞)通过消化、计数、稀释等步骤调节细胞浓度为1×105 个/mL,将肿瘤细胞按1×104 个/孔的密度接种于96 孔板,每孔加入对应的培养液,培养24 h 细胞贴壁后,弃培养液;试验组加入含不同质量浓度胶状鳞伞菌多糖的培养液100 µL、阴性对照组加等量培养液于细胞孔中、空白组加等量培养液于无细胞空白孔中,每组设5 个平行,培养24 h 后吸取上清液,使用MTT 细胞增殖试剂盒测定细胞增殖率[16]。按下列公式计算细胞增殖的抑制率(Y6,%)。
式中:A1 为试验组吸光度;A2 为空白组吸光度;A3为阴性对照组吸光度。
1.3.4.3 α-淀粉酶抑制活性的测定
参照文献[17]的方法并稍作修改,往96 孔板中每孔加入100 µL 的α-淀粉酶溶液以及50 µL 不同质量浓度的胶状鳞伞菌多糖溶液,37 ℃孵育10 min 后再加入50 µL 的1% 淀 粉 溶 液,37 ℃孵 育10 min,加 入100 µL 的3,5-二硝基水杨酸,100 ℃下孵育5 min,测定其A540 nm,阿卡波糖做阳性对照。按下列公式计算胶状鳞伞菌多糖对α-淀粉酶的抑制率(Y7,%)。
式中:A1 为试验组吸光度;A2 为磷酸盐缓冲盐液(pH7.4)代替α-淀粉酶的本底组吸光度;A0 为磷酸盐缓冲盐液(pH7.4)代替样品的空白对照组吸光度。
采用Excel 2021 软件进行数据整理与统计分析,以SPSS Statistics 22 进行试验方差分析,包括单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)和最小显著性差异法(least significant difference,LSD)多重比较;使用Origin 2022 软件绘制结果图。
胶状鳞伞菌基本成分测定结果见表1。
表1 胶状鳞伞菌基本化学成分测定结果
Table 1 Content of basic nutrients in colloidal scale umbrella fungus%
水分含量12.05±0.05灰分含量11.02±0.08蛋白质含量20.25±0.31粗脂肪含量1.43±0.02氨基酸含量13.50±0.05
由表1 可知,胶状鳞伞菌的水分含量(12.05±0.05)%,灰分含量为(11.02±0.08)%,粗脂肪含量为(1.43±0.02)%,氨基酸含量为(13.50±0.05)%。其中,胶状鳞伞菌的蛋白质含量为(20.25±0.31)%,按照GB 28050—2011《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》中提到的蛋白质营养素参考值(nutrient reference values,NRV)等于60 g 计,每100 g 食品中蛋白质的含量≥20% NRV 的可以声称“高”蛋白或“富含”蛋白质。因此,胶状鳞伞菌属于高蛋白质食品,有较高的营养价值。
胶状鳞伞菌的氨基酸结果见图1。
图1 胶状鳞伞菌氨基酸含量
Fig.1 Content of amino acids in colloidal scale umbrella fungus
由图1 可知,胶状鳞伞菌含有16 种氨基酸(色氨酸未测,不含胱氨酸),其中7 种必需氨基酸(essential amino acid,EAA)(赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸)总含量为5.10%,9 种非必需氨基酸(nonessential amino acid,NEAA)总含量为8.40%,总氨基酸含量(total amino acid,TAA)为13.50%。根据联合国粮食和农业组织/联合国世界卫生组织提出的理想蛋白质中EAA/TAA 为40% 左右,EAA/NEAA在60% 以上的要求,胶状鳞伞菌的蛋白质模式(EAA与TAA 的比值为37.80%,EAA 与NEAA 的比值为60.72%)接近理想蛋白模式[18]。鲜味氨基酸主要是谷氨酸与天门冬氨酸2 种[19],胶状鳞伞菌的谷氨酸与天门冬氨酸含量均高于其他氨基酸,赋予了其独特的鲜味,因此,以胶状鳞伞菌为原料开发一系列产品的潜力很大。
2.2.1 胶状鳞伞菌多糖的基本成分分析
胶状鳞伞菌多糖的基本成分测定结果见表2。
表2 胶状鳞伞菌多糖基本化学成分
Table 2 Content of basic nutrients in the polysaccharide from colloidal scale umbrella fungus%
总糖含量80.92±0.56蛋白质含量4.17±0.49水分含量9.76±0.34还原糖含量0.09±0.00
由表2 可知,胶状鳞伞菌多糖总糖含量为(80.92±0.56)%,蛋白质含量为(4.17±0.49)%,水分含量为(9.76±0.34)%,还原糖含量为(0.09±0.00)%。
2.2.2 胶状鳞伞菌多糖的红外光谱分析
胶状鳞伞菌多糖的红外光谱图见图2。
图2 胶状鳞伞菌多糖红外光谱图
Fig.2 Infrared spectrum of polysaccharide from colloidal scale umbrella fungus
由图2 可知,在3 389 cm-1 处显示出宽而强的吸收峰是由于胶状鳞伞菌多糖中存在大量羟基(O—H)键的伸缩振动造成的[20];在2 929 cm-1 附近的吸收峰是由C—H 伸缩振动引起的[21],这两种吸收峰为多糖的典型吸收峰[22],证明该样品为多糖。在1 651 cm-1处出现的强吸收峰通常是羰基的伸缩振动,在1 412 cm-1 附近出现的吸收峰是伸缩振动引起的[23],表明胶状鳞伞菌多糖含有糖醛酸。在1 243 cm-1与1 073 cm-1 处的吸收峰应为C—O—C 与C—O—H的弯曲振动[24-25],是吡喃糖苷的特征吸收峰,表明胶状鳞伞菌多糖中吡喃糖环的存在。
2.2.3 胶状鳞伞菌多糖的单糖组成分析
混合单糖标准品与胶状鳞伞菌多糖的PMP 柱前衍生化高效液相色谱图见图3。
图3 混合标准品和胶状鳞伞菌多糖单糖组成高效液相色谱图
Fig.3 High performance liquid chromatogram of mixed monosaccharde standard and monosaccharide composition of polysaccharide from colloidal scale umbrella fungus
A.混合标准品;B.胶状鳞伞菌多糖。1.古洛糖醛酸;2.甘露糖醛酸;3.甘露糖;4.核糖;5.鼠李糖;6.氨基葡萄糖;7.葡萄糖醛酸;8.半乳糖醛酸;9.氨基半乳糖;10.葡萄糖;11.半乳糖;12.木糖;13.阿拉伯糖;14.L-岩藻糖。
由图3 可知,胶状鳞伞菌多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、L-岩藻糖、古洛糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸组成,其摩尔百分比为20.16∶5.17∶1.12∶0.70∶40.80∶12.70∶14.97∶1.88∶0.27∶0.07∶2.05∶0.10。由此可知,胶状鳞伞菌多糖以葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖为主,葡萄糖含量最高,且含有3 种糖醛酸与前面红外光谱分析的结果一致。
2.2.4 胶状鳞伞菌多糖的分子量测定结果分析
胶状鳞伞菌多糖的水相GPC 洗脱曲线见图4。
由图4 可知,胶状鳞伞菌多糖呈单一峰(倒立的峰为溶剂峰),说明胶状鳞伞菌多糖分子量的分布比较均一。经计算可得胶状鳞伞菌多糖的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)和峰值分子量(Mp)分别为29 754、13 120、26 607 Da。
图4 胶状鳞伞菌多糖的GPC 洗脱曲线
Fig.4 GPC elution curve of polysaccharide from colloidal scale umbrella fungus
2.2.5 胶状鳞伞菌多糖的粒径和电位分析
胶状鳞伞菌多糖溶液的粒径及Zeta 电位分布见图5。
图5 胶状鳞伞菌多糖的粒径和Zeta 电位分布图
Fig.5 Particle size and Zeta potential distribution of polysaccharide from colloidal scale umbrella fungus
A.粒径;B. Zeta 电位。
粒径大小与多糖的生物利用率有关。如图5A 所示,胶状鳞伞菌多糖溶液的粒径大小分布呈现出3 个峰,主要集中在500~1 000 nm,少部分分布在20~80 nm。经计算所得,多糖溶液的平均粒径为683.0 nm。有研究表明,带负电荷的多糖比中性糖具有更高的生物活性[26]。如图5B 所示,胶状鳞伞菌多糖溶液表面均以负电荷为主,是一种阴离子多糖,经计算所得Zeta 电位为-14.4 mV。
2.3.1 胶状鳞伞菌多糖的抗氧化活性结果分析
胶状鳞伞菌多糖抗氧化活性结果见表3。
表3 胶状鳞伞菌多糖抗氧化活性
Table 3 Antioxidant capacity of polysaccharide from colloidal scale umbrella fungus
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
多糖质量浓度/(mg/mL)0.10 0.25 0.50 0.75 1.00 2.00 DPPH自由基清除率/%25.07±4.73f 31.72±1.15e 42.76±3.81d 52.62±1.28c 59.98±1.03b 78.27±1.23a ABTS+自由基清除率/%2.45±0.29d 5.17±0.19cd 6.07±1.53bcd 6.44±0.60bc 9.87±0.83b 15.12±0.72a羟自由基清除率/%0.86±0.33d 1.64±0.52cd 3.88±1.31cd 5.43±1.23c 11.58±0.55b 16.93±0.18a超氧阴离子自由基清除率/%20.34±3.36d 33.79±1.20c 39.66±1.79bc 44.75±0.90ab 45.42±2.06ab 48.36±0.85a还原力0.10±0.20d 0.11±0.26d 0.12±0.21c 0.13±0.17c 0.14±1.12b 0.20±0.14a
由表3 可知,多糖质量浓度为0.10~2.00 mg/mL时,胶状鳞伞菌多糖具有不同的DPPH 自由基、ABTS+自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力及还原力,且抗氧化能力及还原力随着多糖质量浓度的提高而提升,呈浓度依赖性。在质量浓度为2.00 mg/mL时,胶状鳞伞菌多糖的DPPH 自由基清除率最高,为78.27%,对ABTS+自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的最大清除率分别为15.12%、16.93%、48.36%;多糖质量浓度为0.10~2.00 mg/mL 时,胶状鳞伞菌多糖的还原力在2.00 mg/mL 时达到最大值,吸光度为0.20。以上结果均表明,胶状鳞伞菌多糖具有一定的抗氧化活性。
2.3.2 胶状鳞伞菌多糖的抗肿瘤活性分析
胶状鳞伞菌多糖对不同肿瘤细胞的抑制作用见图6。
图6 胶状鳞伞菌多糖对不同肿瘤细胞的抑制作用
Fig.6 Inhibition of polysaccharide from colloidal scale umbrella fungus on different tumor cells
A. BGC-823 细胞;B. HepG2 细胞;C. Caco-2 细胞;不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由图6 可知,胶状鳞伞菌多糖对BGC-823 细胞、HepG2 细胞、Caco-2 细胞的增殖均有一定的抑制作用,且抑制效果呈浓度依赖性。其中胶状鳞伞菌多糖对HepG-2 细胞的抑制效果最明显,抑制率最高达到了53.86%;在质量浓度为2.00 mg/mL 时,胶状鳞伞菌多糖对BGC-823 细胞增殖的抑制率为31.38%。胶状鳞伞菌多糖对Caco-2 细胞的抑制作用与其他细胞不同,在质量浓度为0.05~0.25 mg/mL 时其对Caco-2 细胞并无抑制作用,反而促进Caco-2 的增殖;在0.50~2.00 mg/mL 质量浓度范围内,胶状鳞伞菌多糖对Caco-2 细胞的抑制作用逐渐增强,抑制率最高达46.89%,以上在钟瑞芳[27]的研究中也出现了类似的现象。综上,胶状鳞伞菌多糖对肿瘤细胞的增殖有抑制效果,且对不同的肿瘤细胞增殖的抑制作用存在差异。
2.3.3 胶状鳞伞菌多糖对α-淀粉酶的抑制作用分析
胶状鳞伞菌多糖对α-淀粉酶的抑制作用见图7。
图7 胶状鳞伞菌多糖对α-淀粉酶的抑制作用
Fig.7 Inhibition of polysaccharide from colloidal scale umbrella fungus on α-amylase
不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。
由图7 可知,胶状鳞伞菌多糖具有一定的抑制α-淀粉酶活性。随着胶状鳞伞菌多糖质量浓度的增加,阿卡波糖、胶状鳞伞菌多糖对α-淀粉酶的抑制率逐渐升高;在胶状鳞伞菌多糖质量浓度为3.00 mg/mL 时,抑制率最高为49.59%;作为阳性对照的阿卡波糖在此浓度下表现出更高的抑制率,为61.33%,说明胶状鳞伞菌多糖可作为潜在活性物质抑制α-淀粉酶活性。
本研究以胶状鳞伞菌为原料,通过水提醇沉法得到胶状鳞伞菌多糖,对胶状鳞伞菌多糖的组成成分、结构及体外生物活性进行了初步的研究。结果表明,胶状鳞伞菌多糖具有典型的多糖特殊红外光谱吸收峰,含有吡喃糖苷与糖醛酸,是一种阴离子多糖,分子量为29 754 Da。胶状鳞伞菌多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、L-岩藻糖、古洛糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸组成,葡萄糖含量最高。抗氧化结果表明胶状鳞伞菌多糖对DPPH自由基、羟自由基、ABTS+自由基以及超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力,也具有还原力。抗肿瘤结果表明胶状鳞伞菌多糖对肿瘤细胞BGC-823、HepG2、Caco-2 的增殖活性均有抑制作用。降血糖结果表明,胶状鳞伞菌多糖对α-淀粉酶有抑制效果,具有一定的降血糖活性。上述研究结果可为胶状鳞伞菌及其多糖的开发和应用提供参考,关于胶状鳞伞菌多糖的理化性质、结构等与其生物活性之间的构效关系还有待进一步研究。
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