长期大量饮酒可使全身多脏器的正常功能受到破坏，肝脏作为酒精代谢主要场所，可因长期大量饮酒导致酒精性肝病，也称为酒精性肝损伤[1]。研究表明，1990～2019 年，中国酒精性肝病全人群粗发病率已经由3.2/10 万增长至4.9/10 万，标化发病率总体呈上升趋势，其中男性标化发病率增长了7.8%[2]。因此，寻找能够安全有效防治酒精性肝损伤的功能成分成为重点。
法尼醇X 受体（farnesoid X receptor，FXR）是核受体超家族的一名成员，在肝脏以及肠道内高度表达。在肝脏中，胆汁酸过多可激活肝FXR，抑制胆汁酸合成酶[胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）]的转录，减少肝脏中胆汁酸的合成，维持胆汁酸稳态；在肠道中，胆汁酸可激活肠FXR，诱导成纤维细胞生长因子15（fibroblast growth factor 15，FGF15）表达，通过门静脉进入肝脏与成纤维细胞生长因子受体第4 号（fibroblast growth factor receptor 4，FGFR4）结合，抑制CYP7A1 的转录，进而抑制胆汁酸合成[3]。目前研究显示，FXR 在酒精性肝损伤发生发展中起重要作用[4]。Xue 等[5]通过研究发现，酒精摄入可使FXR 表达降低，谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）水平显著增高，肝脏出现明显病变。Kong 等[6]通过FXR 基因敲除（FXR-/-）小鼠研究发现，酒精摄入能够使FXR-/-小鼠ALT、AST、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）进一步升高，肝脏脂肪变性更加明显，病变更为严重。因此，FXR 通路有望成为防治酒精性肝损伤的一个新靶点。
近年来，对酒精性肝损伤的保护作用研究可见于多糖、黄酮类等存在于植物（如葛根、甘草、枸杞等药食同源植物）中的活性成分，其毒副作用小，可通过抗氧化、抗炎、调节肠道菌群等方式改善酒精性肝损伤[7]。沙棘作为药食同源植物，又名醋柳、黑刺等，其富含的黄酮类、萜类化合物等活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、保肝等作用[8]。研究显示，沙棘果实中熊果酸含量可达0.411%[9]。熊果酸是一种五环三萜羧基酸类化合物，能够改善肠道菌群，减轻肝纤维化[10]。有研究发现，熊果酸可激活FXR 通路，能够增加HepG2 细胞中的FXR mRNA 和蛋白表达[11-12]。前期研究发现，沙棘熊果酸可以通过抑制炎症因子释放、调控Toll 样受体4 通路等方式改善酒精性肝损伤[13]，但关于熊果酸是否能够通过调节FXR 通路改善酒精性肝损伤的研究鲜见。
本研究通过建立酒精性肝损伤小鼠模型，选用双歧杆菌四联活菌片作为阳性干预组，从肠FXR-FGF15通路视角，探讨沙棘熊果酸拮抗酒精性肝损伤中的作用及其可能机制，以期为沙棘熊果酸在酒精性肝损伤的防治研究中提供参考，为沙棘熊果酸的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘果于内蒙古呼和浩特市和林县境内野生沙棘林采取，由内蒙古农业大学鉴定。沙棘熊果酸经由内蒙古科技大学分离、纯化及鉴定，分子式为C30H48O3，相对分子质量为456.68，含量93.8%。
10 周龄雄性C57BL/6 小鼠:斯贝福（北京）生物技术有限公司，24 只，体质量23～25 g，许可证号为SCXK（京）2019-0010。
双歧杆菌四联活菌片:杭州远大生物制药有限公司；ALT、AST 检测试剂盒:北京索莱宝科技有限公司；总胆汁酸（total bile acids，TBA）检测试剂盒:南京建成生物工程研究所；胆盐水解酶（bile salt hydrolase，BSH）检测试剂盒、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）检测试剂盒:泉州市九邦生物科技有限公司；D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）检测试剂盒:江苏酶免实业有限公司；电化学发光（electochemiluminescence，ECL）试剂、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗:北京中杉金桥生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜:美国Millipore 公司；抗FXR、FGFR4 抗体:武汉三鹰生物技术有限公司；抗FGF15 抗体:美国ABCAM 公司；抗CYP7A1 抗体:美国Affinity 公司。
1.2 仪器与设备
TDZ4-WS 自动平衡台式离心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Synergy HT/SIAFRTI 酶标仪:美国伯腾仪器有限公司；WSE-4040 半干转膜仪系统:日本ATTO 公司；DYCZ-24DN 电泳仪:北京六一生物科技有限公司；ChemiDoc 超高灵敏度免染型化学发光成像系统:美国BIO-RAD 公司；BX43 光学显微镜:日本OLYMPUS 公司；KZ-II 研磨仪:武汉赛维尔生物科技有限公司。
1.3 动物分组及处理
将24 只小鼠适应性喂养一周，按体质量排序，并根据随机数字表进行随机分组，分为4 组，每组6 只，各组通过灌胃给予药物，小鼠灌胃试剂与剂量见表1。
表1 小鼠灌胃试剂与剂量
Table 1 Reagents and dosages for gavage in mice
分组正常对照组酒精模型组熊果酸干预组益生菌组试剂与剂量给予生理盐水灌胃，前两周10 mL/（kg·d），后4 周12 mL/（kg·d）给予50%（体积分数）酒精灌胃，前两周10 mL/（kg·d），后4 周12 mL/（kg·d）先给予150 mg/（kg·d）沙棘熊果酸灌胃，1 h 后再给予酒精（剂量同酒精模型组）先给予900 mg/（kg·d）双歧杆菌四联活菌片，1 h 后再给予酒精（剂量同酒精模型组）
给药持续6 周，实验期间小鼠自由进水摄食。每周末监测每组实验小鼠的体质量，根据小鼠体质量调整给药剂量。小鼠饲养在湿度50%～60%、温度（23±2） ℃的动物房中，12 h 昼/夜交替照明。实验结束后，注射3%戊巴比妥钠使小鼠麻醉，然后进行摘眼球取血。从血液中分离出血清，4 ℃、3 000 r/min 离心10 min，取上清液储存在-80 ℃冰箱。保留小肠和肝脏组织，取部分肝、肠组织于4%多聚甲醛固定液中固定，其余部分置于-80 ℃冰箱保存，备用。
1.4 指标检测方法
1.4.1 小鼠肝、肠组织病理学观察
取出浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定至少24 h 的小鼠肝脏和小肠组织，进行常规脱水，石蜡包埋，随后进行组织切片，用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin staining，HE）染色，在光学显微镜下观察肝脏和小肠的病理变化。
1.4.2 血清ALT、AST 活性及TBA 含量的测定
对血清中AST、ALT 活性及TBA 含量严格按照试剂盒说明书的要求，用酶标仪测定505 nm 波长下的吸光度。
1.4.3 血清LPS、D-LA 含量及BSH 浓度的测定
应用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测血清LPS、D-LA 含量及BSH 浓度，严格按照试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450 nm 波长下的吸光度。
1.4.4 蛋白质印迹法测定肠FXR 通路关键蛋白
分别取小鼠肝脏、肠道组织样本50 mg，加入500 µL裂解液，剪碎并用研磨仪研磨。在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min。取上清液，测定样本中蛋白浓度。根据结果，加入5 倍蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，在95 ℃下变性10 min 后插入冰块备用。将样品缓慢加入凝胶孔中开始电泳。染料通过电泳被移动到分离凝胶上的适当位置，电泳结束。然后通过转移电泳将蛋白带转移到PVDF 膜上，然后分别用非标记的一抗FXR、FGF15、FGFR4、CYP7A1（体积比1∶1 000）和用辣根过氧化物酶染色的二抗进行处理和检测。蛋白相对表达量=样品蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值。
1.5 统计学分析
数据采用SPSS 22.0 软件统计分析，数据以平均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），两两比较采用最小显著差数（least significant difference，LSD）法的t 检验，检验水准为α=0.05（双侧检验）。
2 结果与分析
2.1 各组小鼠肝组织病理学观察
沙棘熊果酸对各组小鼠肝组织病理结构的影响见图1。
图1 沙棘熊果酸对各组小鼠肝组织病理结构的影响（×200）
Fig.1 Effect of ursolic acid in Hippophae rhamnoides L. on the pathological structure of liver tissue of mice in each group （×200）
A.正常对照组；B.酒精模型组；C.熊果酸干预组；D.益生菌组。
由图1 可知，正常对照组小鼠的肝细胞分布均匀，以中央静脉为中心延伸的肝索，肝小叶的界限和结构明确。酒精模型组与正常对照组小鼠相比，酒精模型组肝小叶的界限和结构相对模糊，可以看到水肿的肝细胞，有大量炎症细胞浸润。益生菌组小鼠肝脏损伤较酒精模型组有所减轻，肝小叶边缘相对明显，炎症细胞数量相对减少。而熊果酸干预组小鼠肝脏损伤明显改善，相较益生菌组肝索排列、肝小叶结构更为清晰，炎症细胞数量明显减少。
2.2 各组小鼠肠组织病理学观察
沙棘熊果酸对各组小鼠肠组织病理结构的影响见图2。
图2 沙棘熊果酸对各组小鼠肠组织病理结构的影响（×200）
Fig.2 Effect of ursolic acid in Hippophae rhamnoides L. on the pathological structure of intestinal tissue of mice in various groups（×200）
A.正常对照组；B.酒精模型组；C.熊果酸干预组；D.益生菌组。
由图2 可知，小鼠肠道组织经HE 染色后，正常对照组小鼠的小肠绒毛排列整齐，致密饱满，连接牢固，纹理清晰，未出现水肿以及炎性细胞浸润；而酒精模型组小肠脱落大量绒毛，表现出相当大的肿胀、萎缩或缩短，并且有很多炎症细胞浸润黏膜层。与酒精模型组相比，熊果酸干预组和益生菌组的小肠绒毛明显改善，紧密连接处水肿减少，炎症细胞浸润不明显，其中熊果酸干预组改善效果更为突出。
2.3 沙棘熊果酸对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性及TBA 含量的影响
各组小鼠血清ALT、AST 活性及TBA 含量见表2。
表2 各组小鼠血清ALT、AST 活性及TBA 含量
Table 2 Serum ALT，AST activity，and TBA content of mice in each group
注:*表示与正常对照组相比，差异显著（P<0.05）；#表示与酒精模型组相比，差异显著（P<0.05）。
组别正常对照组酒精模型组熊果酸干预组益生菌组ALT 活性/（U/mL）0.70±0.24 1.88±0.18*1.15±0.30*#1.26±0.42*#AST 活性/（U/mL）2.22±0.42 3.74±0.24*3.17±0.29*#3.37±0.17*#TBA 含量/（µmol/L）5.34±1.42 9.94±1.49*5.76±1.43#6.24±1.43#
由表2 可知，与正常对照组相比，酒精模型组小鼠的血清AST、ALT 活性显著增加（P<0.05）；与酒精模型组小鼠相比，熊果酸干预组和益生菌组小鼠血清AST、ALT 活性显著降低（P<0.05）。与正常对照组小鼠相比，酒精模型组的小鼠血清中TBA 含量显著增加（P<0.05）；与酒精模型组相比，熊果酸干预组和益生菌组的小鼠血清中TBA 含量显著减少（P<0.05），但数值上熊果酸干预组各项指标更接近于正常对照组。
2.4 沙棘熊果酸对酒精性肝损伤小鼠血清LPS、D-LA含量及BSH 浓度的影响
各组小鼠血清LPS、D-LA 含量及BSH 浓度见表3。
表3 各组小鼠血清LPS、D-LA 含量及BSH 浓度
Table 3 Content of LPS，D-LA content，and BSH concentration in serum of mice in each group
注:*表示与正常对照组相比，差异显著（P<0.05）；#表示与酒精模型组相比，差异显著（P<0.05）。
组别正常对照组酒精模型组熊果酸干预组益生菌组LPS 含量/（EU/L）4.19±0.39 4.85±0.15*4.29±0.46#4.34±0.16#D-LA 含量/（µmol/mL）0.83±0.26 1.20±0.22*0.89±0.12#0.91±0.05#BSH 浓度/（ng/mL）5.74±0.23 4.75±0.29*5.08±0.17*#5.08±0.35*#
由表3 可知，酒精模型组小鼠的血清D-LA、LPS含量显著高于正常对照组（P<0.05），而熊果酸干预组、益生菌组小鼠的血清D-LA、LPS 含量相较酒精模型组出现显著降低（P<0.05）。酒精模型组小鼠血清BSH浓度相较正常对照组出现显著下降（P<0.05），而熊果酸干预组和益生菌组与酒精模型组相比，小鼠血清BSH 浓度显著增加（P<0.05）。
2.5 沙棘熊果酸对酒精性肝损伤小鼠肠FXR 通路关键蛋白的影响
前期研究发现沙棘熊果酸可以通过调节肝FXR通路改善酒精性肝损伤[14]。为了进一步探究沙棘熊果酸对肠FXR-FGF15 信号通路的影响，检测了该通路上的关键蛋白表达水平，结果如图3 所示。
图3 沙棘熊果酸对各组小鼠肠组织FXR、FGF15 及肝组织FGFR4、CYP7A1 蛋白表达量的影响
Fig.3 Effect of ursolic acid in Hippophae rhamnoides L. on expression levels of FXR and FGF15 proteins in intestinal tissue and FGFR4 and CYP7A1 proteins in liver tissue of mice in different groups
A 表示正常对照组；B 表示酒精模型组；C 表示熊果酸干预组；D 表示益生菌组。*表示与正常对照组相比，差异显著（P<0.05）；#表示与酒精模型组相比，差异显著（P<0.05）。
由图3 可知，与正常对照组小鼠相比，酒精模型组小鼠肠组织FXR、FGF15 蛋白表达水平显著降低（P<0.05），肝 脏 中FGFR4 表 达 显 著 降 低（P<0.05），CYP7A1 表达显著增加（P<0.05）。相对于酒精模型组，熊果酸干预组及益生菌组均显著上调了肠组织FXR、FGF15 以及肝脏中FGFR4 的表达（P<0.05），显著抑制了肝脏内CYP7A1 的表达（P<0.05）。
3 讨论
本研究以沙棘熊果酸为干预物，建立小鼠酒精性肝损伤模型，通过对各组小鼠肝、肠病理学观察、血清ALT、AST 活性、TBA 含量以及LPS、D-LA 含量、BSH浓度检测，可知沙棘熊果酸对酒精性肝损伤小鼠具有保护作用。进一步测定肠FXR-FGF15 通路关键蛋白，发现沙棘熊果酸能够改变酒精肝损伤小鼠肠FXRFGF15 通路关键蛋白表达，提示沙棘熊果酸可能通过肠FXR-FGF15 通路对酒精肝损伤小鼠发挥保护作用。
本研究显示，酒精摄入能够使小鼠肝小叶结构模糊，肝脏出现细胞水肿和大量炎症细胞，肠组织小肠绒毛肿胀脱落，黏膜层大量炎症细胞浸润，这与已有研究结果一致[15-16]。而沙棘熊果酸和益生菌干预后肝脏损伤均得到明显改善，且病理学观察可见沙棘熊果酸的改善效果要优于益生菌组，表明沙棘熊果酸对酒精引起的肝损伤保护作用更强。
血清转氨酶ALT、AST 是临床常见的肝功能指标，能够反映肝脏的受损程度。当出现肝脏受损时，常见ALT、AST 活性升高[17]。本实验结果显示，酒精摄入使ALT、AST 活性升高，沙棘熊果酸和益生菌干预均可使ALT、AST 活性下降，说明其能够改善肝脏功能。TBA也是反映肝脏疾病的重要指标，胆汁酸由肝脏合成后排入胆汁，经肠道吸收代谢后通过门静脉返回肝脏形成循环，生理状态下血液中胆汁酸含量极低[18]。当酒精摄入后，肝脏出现损伤，机体内胆汁酸的代谢出现紊乱，导致胆汁酸入血，从而使TBA 含量升高[19]。本实验结果显示，沙棘熊果酸和益生菌能够降低酒精摄入小鼠的TBA 含量，说明两者均能够通过调节小鼠胆汁酸代谢，进而改善酒精性肝损伤。但沙棘熊果酸改善酒精性肝损伤的能力优于益生菌组。
酒精大量摄入可以通过破坏肠道菌群及肠黏膜屏障进而造成肝脏损伤[20]。LPS 是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，D-LA 是肠道微生物代谢产物，两者均存在于肠道内，能够反映肠黏膜屏障的功能[21]。BSH 是肠道菌群的代谢产物，能够水解结合胆汁酸，在胆汁酸代谢中有着不可忽视的作用[22]。研究发现，酒精摄入可使肠黏膜屏障受损，肠道菌群紊乱，D-LA、LPS 大量释放入血，加重肝脏损伤[23]，当肠道菌群紊乱时其代谢产物BSH 浓度降低，导致肠道内胆汁酸代谢失衡[15]。益生菌能够通过调节肠道菌群紊乱，保护肠黏膜屏障从而改善酒精性肝损伤，例如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等[24-25]。且有研究发现，益生菌可以通过调节FXR 通路改善肝脏炎症[26]。目前益生菌类药物如思连康（双歧杆菌四联活菌片）已用于临床调节肠道菌群平衡[27-28]。因此本研究通过选用双歧杆菌四联活菌片作为阳性干预组，对比观察沙棘熊果酸对酒精造成的肝、肠损伤的改善效果。结果显示，酒精摄入能够引起DLA、LPS 含量增加，BSH 浓度降低，沙棘熊果酸干预后D-LA、LPS 含量明显降低，BSH 浓度升高，与益生菌组结果相一致。但总体而言，益生菌组对酒精性肝损伤的改善效果弱于熊果酸干预组，这可能与沙棘熊果酸还可通过抗氧化、抑制肝细胞凋亡、减轻炎症反应等途径改善酒精诱导的肝脏损伤有关[29-31]。
FXR 是一种胆汁酸受体，在胆汁酸肝肠循环中起到重要作用。现有研究表明，酒精摄入可使胆汁酸代谢出现紊乱，肠道内FXR 表达降低，进而导致肠FGF15、肝脏FGFR4 表达降低，无法抑制肝脏内胆汁酸合成酶CYP7A1，使胆汁酸合成增加，造成胆汁淤积，出现肝脏损伤[32]。通过使用肠道特异性FXR 基因敲除小鼠进行研究发现，酒精摄入使小鼠相较正常小鼠的肠道FGF15 水平进一步降低，肝脏炎症和脂肪变性进一步加重，提示酒精可通过影响肠FXR-FGF15 通路对肝脏造成损伤[33]。本实验结果显示，酒精摄入明显降低了小鼠肠组织中FXR 蛋白表达，进而FGF15、FGFR4 表达降低，无法抑制肝内CYP7A1 的过度表达，胆汁酸合成增加，小鼠胆汁酸稳态被破坏，表现出TBA 含量显著升高，肝脏出现损伤。经沙棘熊果酸干预后，可见小鼠肠FXR 蛋白表达明显上调，使得FGF15、FGFR4 表达升高，进而抑制了CYP7A1 的过表达，TBA 含量相对于酒精模型组也有所降低，胆汁酸恢复平衡，最终起到保肝护肝的作用，益生菌组的变化趋势与熊果酸干预组相一致。
4 结论
综上所述，沙棘熊果酸能够有效改善小鼠酒精性肝损伤，机制可能与其调节肠内FXR 蛋白表达、诱导肠FGF15 与肝FGFR4 受体相结合，抑制肝脏内CYP7A1 过度表达，进而维持胆汁酸稳态有关。而基于肠FXR-FGF15 通路分析沙棘熊果酸对酒精性肝损伤的保护作用，能够为探索沙棘熊果酸的保肝、护肝作用提供一个新的方向和途径，也为今后沙棘熊果酸的开发利用提供新思路。
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