食源性疾病作为全球范围内备受瞩目的公共卫生问题之一，其严重性不容小觑。据世界卫生组织数据显示，全球每年约有6亿人因食用受污染的食物而患病，其中约42万人死亡，而病因多数是由食品中食源性致病菌污染所引起的[1]。常见的食源性致病菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌等，其中以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌引发的疾病最为高发[2-6]。
在食品工业领域，针对食源性致病菌的控制主要依赖于防腐剂的应用，这些防腐剂可分为化学防腐剂和天然防腐剂两类。脱氢乙酸钠（sodium dehydroacetate，SDA）作为一种高效化学防腐剂，可以通过干扰细胞膜功能[7]、抑制酶活性、干扰DNA复制与转录以及诱导活性氧生成[8]等多重机制，有效抑制微生物的生长繁殖，显著延长食品保质期。然而，随着对食品安全风险评估的深入研究，其潜在的健康风险逐渐受到人们关注，如长期摄入脱氢乙酸钠可能对肝脏、肾脏及中枢神经系统造成损害[9]。
根据GB 2760—2024《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[10]，脱氢乙酸钠（SDA）在肉制品中的使用受到严格限制。GB 2760—2024删除了其在预制肉制品、肉罐头中的使用规定，并将熟肉制品中的最大使用量限制为0.5 g/kg。这些修订旨在降低消费者长期摄入的风险，同时推动食品行业寻找更安全的替代防腐剂。
葡萄糖发酵物（glucose fermentation products，GF）是一种符合“清洁标签”概念的天然抑菌物质，其安全性已获得广泛认可。它主要以食品级葡萄糖和酵母抽提物为原料，经国家规定的可食用益生菌定向分段发酵制备而成，是一种天然抑菌物质。GF富含聚氨基酸、多肽和有机酸，其中有机酸和小分子肽可有效抑制微生物活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌等食源性致病菌均有抑制作用。GF符合消费者对“清洁标签”健康食品理念的追求，且可与SDA复配使用，实现降低SDA添加量的目的。本研究旨在系统探究GF与SDA复配后的抑菌特性，以期为食品工业中安全、高效防腐体系构建提供理论依据和实践参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠杆菌ATCC2592：宁波泰斯拓生物技术有限公司；葡萄糖发酵物：山东元泰食品科技有限公司；脱氢乙酸钠：河南奥凯食品科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Hirayama HVR-50高压灭菌锅：上海土森视觉科技有限公司；YJ-1340洁净工作台：苏州市苏信净化设备厂；DHP-9080欧莱博电热恒温培养箱：山东博科再生医学有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 单因素试验
分别考察葡萄糖发酵物添加量（0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%）和脱氢乙酸钠添加量（0.002 5%、0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）对浓度均为105 CFU/mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌率的影响。
1.3.2 均匀设计试验
基于1.3.1的试验结果，确定均匀设计试验中葡萄糖发酵物及脱氢乙酸钠的添加量的梯度范围。在该范围内，选取7个不同添加量作为试验因素。以菌液浓度分别为105、106、107 CFU/mL的金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌率作为考察指标，开展均匀设计试验。同时，设置不添加葡萄糖发酵物和脱氢乙酸钠的空白组作为阴性对照组，以单独添加脱氢乙酸钠0.05%的组作为阳性对照组，以全面评估不同添加量对目标菌株的抑菌效果。
均匀试验设计的因素水平见表1。
表1 U7（72）均匀设计试验
Table 1 U7（72）uniform design
1.3.3 抑菌率的测定
将葡萄糖发酵物及脱氢乙酸钠用LB液体培养基稀释至对应梯度，按照均匀试验设计表进行复配，取100 µL复配液加入96孔板中，对应加入100 µL不同浓度菌液，每个浓度设置3个重复孔，并设置生长对照组（100 µL菌液+100 µL LB液体培养基）、对照组（100 µL复配液+100 µL LB液体培养基）、空白对照组（200 µL LB液体培养基）。于恒温摇床中以37 ℃、200 r/min的条件下振荡培养24 h后，使用酶标仪测定各孔的吸光度。抑菌率的计算公式如下。
式中：Y 为抑菌率，%；Asz 为生长对照组吸光度；Akb为空白对照组吸光度；Asy 为试验组吸光度；AGF 为葡萄糖发酵物对照组吸光度。
1.4 数据处理
数据分析采用SPSS 16.0软件进行多重比较和回归分析，采用MATLAB7.0软件和qtiplot软件进行图形说明。试验重复3次，结果以平均值±标准差的形式表示。
2 结果与分析
2.1 不同GF添加量和SDA添加量对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌率的影响
将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的浓度均调控为105 CFU/mL，随后分别添加不同添加量梯度的抑菌剂观察其抑菌效果。不同GF添加量和SDA添加量对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌率的影响见图1和图2。
图1 葡萄糖发酵物添加量对菌液浓度105 CFU/mL金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌率的影响
Fig.1 Effect of glucose fermentation products addition level on the inhibition rate of Staphylococcus aureus and Escherichia coli with a bacterial concentration of 105 CFU/mL
图2 脱氢乙酸钠添加量对菌液浓度105 CFU/mL金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌率的影响
Fig.2 Effect of sodium dehydroacetate addition level on the inhibition rate of Staphylococcus aureus and Escherichia coli with a bacterial concentration of 105 CFU/mL
由图1和图2可知，随着葡萄糖发酵物添加量的增加，抑菌率呈现明显上升趋势。当GF添加量为0.8% 时，对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到100%；而当 GF添加量增至1.6% 时，对大肠杆菌的抑菌率达到100%。然而，当 GF添加量低于0.025% 时，对两种菌株均无抑菌效果。在采用脱氢乙酸钠进行试验时，其抑菌率与GF的抑菌效果整体趋势相似。当SDA添加量为0.05%时，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为78.3%，对大肠杆菌的抑菌率为 37.93%。进一步分析表明，当SDA添加量低于0.03%时，其对大肠杆菌丧失抑菌活性；当SDA添加量低于0.002 5%时，对金黄色葡萄球菌无抑制效果。
基于上述试验结果，确定GF添加量为0.025%～1.6%、SDA添加量为0.002 5%～0.05% 用于后续均匀设计试验，以便更系统、全面地深入探究这两种物质的复配抑菌特性。
2.2 葡萄糖发酵物部分替代脱氢乙酸钠对抑菌率的影响
2.2.1 葡萄糖发酵物部分替代脱氢乙酸钠对金黄色葡萄球菌抑菌率的影响
2.2.1.1 不同处理对不同浓度金黄色葡萄球菌的抑菌率比较
不同处理对不同浓度金黄色葡萄球菌抑菌率的影响见图3。
图3 不同处理对金黄色葡萄球菌抑菌率的影响
Fig.3 Effect of different treatments on the inhibition rate of Staphylococcus aureus
不同小写字母表示不同处理存在显著性差异（p<0.05）；不同大写字母表示不同菌液浓度间存在显著性差异（p<0.05）。处理1.SDA 0.05%+GF 0.8%；处理2.SDA 0.04%+GF 0.2%；处理3.SDA 0.03%+GF 0.05%；处理4.SDA 0.02%+GF 1.6%；处理5.SDA 0.01%+GF 0.4%；处理6.SDA 0.005%+GF 0.1%；处理7.SDA 0.002 5%+GF 0.025%；阳性对照.SDA 0.05%。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的革兰氏阳性球菌，广泛存在于空气、土壤、水以及人和动物的皮肤、鼻腔和咽喉等部位[11]。该菌在适宜的温度（7.0～48.5 ℃）和pH值（6～7）环境下能够迅速生长繁殖，并产生多种外毒素，如肠毒素、溶血素和剥脱毒素等。其中金黄色葡萄球菌肠毒素是引发食物中毒的主要因素 [12]。
由图3可知，金黄色葡萄球菌的初始浓度与其对SDA和GF的敏感性呈负相关，这表明较高浓度的细菌群体对这两种抑菌剂具有更强的耐受性。在微生物学中，高浓度的细菌群体可能通过形成生物膜、产生耐药性相关酶或代谢产物等方式增强对抑菌剂的耐受性[13]。研究表明，在高浓度细菌群体中，细菌可能通过群体感应机制调节基因表达，从而增强对环境胁迫的适应能力[14]。不同抑菌剂的化学结构和作用机制对金黄色葡萄球菌的抑制效果有显著差异。其中，处理1在各浓度下均保持较高的抑菌率（整体抑菌率均超过95%），而处理3、处理6、处理7的抑菌效果相对较低。以0.05% SDA处理组作为阳性对照组，试验结果显示，当金黄色葡萄球菌的浓度为105 CFU/mL时，处理1的抑菌率与阳性对照组相当，且该条件下SDA最低添加量可降至0.01%。当菌液浓度提升至106 CFU/mL和107 CFU/mL时，该处理1的抑制率均达 到100%，显著高于阳性对照组；处理2的抑菌率也明显高于阳性对照组。综合抑菌率和添加剂用量等多维度评估，处理5在抑制金黄色葡萄球菌方面表现最优。
2.2.1.2 不同处理对不同浓度金黄色葡萄球菌的抑菌率回归分析
以脱氢乙酸钠添加量及葡萄糖发酵物添加量为自变量，进行回归分析，回归方程如下。
式中：Z1 为对107 CFU/mL金黄色葡萄球菌的抑菌率，%；Z2 为对106 CFU/mL金黄色葡萄球菌的抑菌率，%；Z3 为对105 CFU/mL金黄色葡萄球菌的抑菌率，%；x 为脱氢乙酸钠添加量，%；y 为葡萄糖发酵物添加量，%。
不同浓度金黄色葡萄球菌抑菌率随SDA添加量和GF添加量变化的直观图见图4。
图4 脱氢乙酸钠和葡萄糖发酵物对不同浓度金黄色葡萄球菌抑菌率影响的回归分析曲面
Fig.4 Regression analysis surfaces of the inhibitory effects of sodium dehydroacetate and glucose fermentation products on Staphylococcus aureus at different concentrations
A.菌液浓度107 CFU/mL；B.菌液浓度106 CFU/mL；C.菌液浓度105 CFU/mL。
由图4可知，在较高初始菌液浓度（107 CFU/mL）条件下，两种添加剂的联合应用相比于单独使用未能显著提升抑菌效果，这可能归因于较高浓度细菌群体对防腐剂的耐受性增强。在107 CFU/mL的菌液浓度下，所有处理的抑菌率均低于106 CFU/mL和105 CFU/mL的菌液浓度，表明在较高初始菌液浓度下，脱氢乙酸钠与葡萄糖发酵物的联合抑菌作用受到限制。
进一步分析结果表明，在脱氢乙酸钠添加量较低时，增加葡萄糖发酵物的添加量能够显著提升抑菌率，两者之间存在正向的协同作用。这种协同作用可能与两种添加剂在不同机制上干扰细菌代谢有关。脱氢乙酸钠可以通过抑制细菌的酶活性发挥作用[15]，而葡萄糖发酵物可能通过改变细菌的代谢环境来增强抑菌效果。
此外，由图4可知，葡萄糖发酵物与脱氢乙酸钠之间存在交互作用。当两者添加量均处于最低水平时，曲面上的抑菌率最低；而当两者添加量均达到最高水平时，曲面上的抑菌率最高。在不同菌液浓度条件下，抑菌率均出现饱和平台（抑菌率达到100%），这种现象可能与细菌的耐受性极限有关，即高浓度防腐剂可完全抑制细菌生存能力，此时，继续增加防腐剂添加量不会显著提高抑菌效果[16]。因此在实际应用中，将添加量控制在饱和平台以上即可实现100% 的抑菌效果。由回归方程Z1 推算可知，在葡萄糖发酵物最佳添加量为0.4%的条件下，脱氢乙酸钠浓度高于0.03%时，即可对菌液浓度为107 CFU/mL的金黄色葡萄球菌实现100% 抑制；浓度高于0.027% 时，即可对菌液浓度为106 CFU/mL的金黄色葡萄球菌实现100%抑制；而浓度高于0.02%时，即可对菌液浓度为105 CFU/mL的金黄色葡萄球菌实现完全抑制。
综上，脱氢乙酸钠与葡萄糖发酵物的协同作用能够显著提高抑菌效果，且在不同菌液浓度下表现出良好的剂量-效应关系，综合抑菌效果与添加剂用量优化分析，处理5（0.01%脱氢乙酸钠、0.4%葡萄糖发酵物）为最优组合。
2.2.2 葡萄糖发酵物部分替代脱氢乙酸钠对大肠杆菌抑菌率的影响
2.2.2.1 不同处理对不同浓度大肠杆菌的抑制效果比较
不同处理对不同浓度大肠杆菌抑菌率的影响见图5。
图5 不同处理对不同浓度大肠杆菌抑菌率的影响
Fig.5 Effect of different treatments on the inhibition rate of Escherichia coli at various concentrations
不同小写字母表示不同处理存在显著性差异（p<0.05）；不同大写字母表示不同浓度存在显著性差异（p<0.05）。处理1.SDA 0.05%+GF 0.8%；处理2.SDA 0.04%+GF 0.2%；处理3.SDA 0.03%+GF 0.05%；处理4.SDA 0.02%+GF 1.6%；处理5.SDA 0.01%+GF 0.4%；处理6.SDA 0.005%+GF 0.1%；处理7.SDA 0.002 5%+GF 0.025%；阳性对照.SDA 0.05%。
大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于人和温血动物肠道中的革兰氏阴性杆菌，多数菌株呈为非致病性，但部分特定血清型的大肠杆菌具有致病性，可引发多种食源性疾病。其生长温度适应范围为4～45 ℃，显示出较强的环境适应性[17]。在食品领域，大肠杆菌污染主要源于受污染的水源[18]、不洁的食品加工环境及生熟食品交叉污染等途径。常见受污染载体包括未充分热处理肉类、未经巴氏杀菌的乳制品[19]，以及受污染的新鲜果蔬等。因此，加强食品生产过程中的卫生管理、严格遵守食品加工操作规范以及确保食品的充分烹饪和妥善保存，对于预防大肠杆菌食物中毒具有重要意义。
由图5可知，在所有处理条件下，随着大肠杆菌初始浓度的增加，抑菌率普遍降低，这表明较高浓度的大肠杆菌对脱氢乙酸钠和葡萄糖发酵物的耐受性更强。葡萄糖发酵物其中含有的有机酸、醛类等物质具有抗菌特性，可通过改变细菌的代谢环境或抑制其生长来增强抑菌效果[20]。而脱氢乙酸钠则通过抑制细菌的酶活性实现抑菌效果。两种抑菌剂联合使用时，可能通过不同的作用机制实现协同抑菌效果。例如葡萄糖发酵物通过降低细菌的代谢活力，从而增强脱氢乙酸钠的抑菌效果。在相同菌液浓度下，不同处理条件的抑菌效果表现出显著差异。特别是处理4在105 CFU/mL和106 CFU/mL菌液浓度下表现出较高的抑菌效果。试验结果显示，当大肠杆菌的浓度为105 CFU/mL时，处理4的抑菌率达到100%，显著优于阳性对照组。当菌液浓度提升至106 CFU/mL时，处理4、处理5的抑菌率达到了阳性对照组的水平。当菌液浓度达到107 CFU/mL时，处理1、处理2、处理4、处理5的抑菌率高于阳性对照组，综合抑菌效能与添加剂使用剂量等多因素评估，处理 4在大肠杆菌抑制方面展现出最优的综合性能。
2.2.2.2 不同处理对不同浓度大肠杆菌的抑菌率回归分析
以脱氢乙酸钠添加量及葡萄糖发酵物添加量为自变量，进行回归分析，得到下列回归方程。
式中：Z4 为对107 CFU/mL大肠杆菌的抑菌率，%；Z5 为对106 CFU/mL大肠杆菌的抑菌率，%；Z6 为对105 CFU/mL大肠杆菌的抑菌率，%；x 为脱氢乙酸钠添加量，%；y 为葡萄糖发酵物添加量，%。
不同浓度大肠杆菌抑菌率随SDA添加量和GF添加量变化结果见图6。
图6 脱氢乙酸钠和葡萄糖发酵物对不同浓度大肠杆菌抑菌率影响的回归分析曲面
Fig.6 Regression analysis surfaces of the inhibitory effects of sodium dehydroacetate and glucose fermentation products on Escherichia coli at different concentrations
A.菌液浓度107 CFU/mL；B.菌液浓度106 CFU/mL；C.菌液浓度105 CFU/mL。
由图6可知，在不同浓度的大肠杆菌条件下，脱氢乙酸钠与葡萄糖发酵物复配使用后的协同抑菌效应呈现出与金黄色葡萄球菌类似的特定趋势。抑菌率与菌液浓度呈负相关模式，即随着大肠杆菌初始浓度的增加，抑菌率普遍降低。这表明较高浓度的大肠杆菌对脱氢乙酸钠和葡萄糖发酵物的耐受性更强。根据回归分析方程Z4、Z5、Z6 推算可知，当葡萄糖发酵物添加量为1.6%，脱氢乙酸钠添加量为0.050 0% 时，对浓度105 CFU/mL的大肠杆菌抑菌率为82.343%，对浓度106 CFU/mL的大肠杆菌抑菌率为47.78%，对浓度107 CFU/mL的大肠杆菌抑菌率为41.31%。
进一步分析结果表明，对于浓度106 CFU/mL以上的大肠杆菌脱氢乙酸钠在添加量0.05%以下时基本没有抑制作用。这说明在高浓度细菌条件下，单一防腐剂的抑菌效果有限，需要更高的添加量或协同作用来增强抑菌效果。
此外，试验数据还显示，葡萄糖发酵物与脱氢乙酸钠之间存在交互作用。当两者添加量均处于最低水平时，抑菌率最低；而当两者添加量均达到最高水平时，抑菌率最高。
综合考虑，处理4在所测试的条件下显示出最佳的大肠杆菌抑制效果，这为优化食品防腐剂的配方提供了科学依据，并可能有助于开发更有效的天然防腐剂组合。
3 结论
本研究通过均匀设计试验和回归分析，系统探究葡萄糖发酵物部分替代脱氢乙酸钠对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性能。试验结果表明，在不同初始浓度条件下，葡萄糖发酵物与脱氢乙酸钠的复配体系均表现出显著的协同抑菌效应。通过构建回归模型，揭示了抑菌率与添加剂量之间的非线性关系，在一定添加剂量范围内，两种添加剂的联合使用能够显著提高抑菌效果，但存在饱和平台效应，实际应用中应将添加量控制在饱和平台范围内的最低浓度。综合来看，脱氢乙酸钠添加量为0.01%、葡萄糖发酵物添加量为0.4%时，该复配体系抑菌效果最佳。这一发现为食品防腐剂的优化提供了重要理论依据，尤其是在减少化学防腐剂用量方面具有重要意义。此外，葡萄糖发酵物作为一种天然来源防腐物质，与脱氢乙酸钠联合使用不仅增强了抑菌效果，也符合消费者对“清洁标签”健康食品的需求。后续研究可进一步拓展葡萄糖发酵物与其他天然防腐物质的联合应用，为开发更安全、高效的食品防腐剂配方提供更丰富的技术支撑。
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