中国白酒作为历史悠久的蒸馏酒之一，其酒精含量范围十分广泛，酒精度为30% vol～72% vol [1，2]。白酒中含有510种酯类化合物，其中乙酯类占总量的46.29%，其他酯类（甲酯、丙酯、丁基酯、戊酯、己酯和内酯）共占44.14%，这些酯类对于白酒的风味贡献具有重要作用[3，4]。白酒中短链脂肪酸酯是多种微生物共同发酵的结果[5-6]。混合发酵体系能够提高酒类中短链脂肪酸酯的含量，从而改善酒的品质[7-9]。在白酒中，酯类化合物的合成过程是在原料含水量为53%～58% 的水相体系中进行的[2，10]。大多数酯化酶催化酯合成的最合适的反应体系是有机相反应体系，而一些酶在水相体系中负责酯化，这与经典的酶催化酯化反应有明显的区别[11-12]。但是，发酵过程中微生物组成和丰度的不稳定导致产品品质波动，是浓香型白酒行业面临的瓶颈问题之一。虽然白酒的主要成分是乙醇（38%～65%，体积分数）和水，但少量（约2%）的挥发性和非挥发性化合物可以决定不同类型白酒的风味特征。根据其浓度和香气强度，烈性白酒的特征风味化合物包括己酸、丁酸、乙酸和乳酸及其对应的乙基酯；己酸乙酯和己酸对其典型风味的贡献最大，己酸乙酯浓度是我国国家标准（GB/T 10781.1—2006《白酒质量要求 第1部分：浓香型白酒》）中重要的质量指标。将筛选出的优良突变株与产酸菌构建二元混菌产酯发酵体系，制备酯化液，可以为白酒品质提升提供相关技术的依据，促进白酒质量和产量的发展。
本研究从微生物组成、群落OD600 nm值、微生物群落与风味化合物的结合3个方面考察微生物组合对酯化液发酵的影响。通过组合高产短链脂肪酸菌株和高产酯化酶突变株，构建二元混菌发酵体系，利用气相色谱质谱联用仪定性定量分析二元混菌体系中的主要风味化合物（己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯），从而建立发酵生产白酒主要风味化合物的功能微生物组，以期为提升浓香型白酒品质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 菌种来源
产酸菌：四川轻化工大学浓香型白酒源微生物与大数据应用研究组前期筛选保存的Clostridium beijerincki G3-1[13]、Clostridium beijerincki G3-5[13]、Clostridium beijerincki BRM001[14]、Rummeliibacillus suwonensis 3B-1[15]、Clostridium butyricum GD1-1[16]、Enterococcus Casseliflavus BF - 1[17]、Staphylococcus epidermidis KR - 2、Staphylococcus epidermidis KR-3、Clostridium guangxiense WZ-1[18]。
产酯化酶菌株：突变株Sphingomonas paucimobilis ARUV3-2[19]、突变株Sphingomonas paucimobilis ARUV3-26、原始菌株Lactococcus garvieae S5-4[20]。
1.1.2 培养基
产酸菌活化培养基：葡萄糖5 g/L、氯化钠5 g/L、酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、乙酸钠3 g/L、牛肉膏10 g/L、可溶性淀粉1 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，pH6.8。
产酯化酶菌株种子培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，自然pH。
产脂肪酸乙酯培养基：葡萄糖20 g/L、氯化钠5 g/L、酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L、乙酸钠3 g/L、淀粉1 g/L、1% 生物素2%、乙醇5%，pH6.8。
以上培养基均在121 ℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min，固体培养基为对应的培养基加入2%琼脂粉。
1.1.3 材料和设备
三丁酸甘油酯、聚乙烯醇、制霉菌素、丁酸、己酸（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉、葡萄糖、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸氢二甲、硫酸铵、乙醇（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；乙酸正丁酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限责任公司。
TSQ8000气相色谱质谱联用仪：美国Thermo Fisher公司；XY-85-158L超低温冰箱：上海欣谕仪器有限公司；V-1000紫外可见分光光度计：翱艺仪器有限公司；HZ150L恒温培养摇床：武汉瑞华仪器设备有限责任公司； MJ-250恒温培养箱：四川蜀科仪器有限公司；LS-50HJ立式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；HH-6D数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司；TG-16医用离心机：四川蜀科仪器有限公司；SW-CJ2D超净工作台：上海苏净实业有限公司；DHG-9023A电热干燥箱：上海琅歼实验设备有限公司；JE2002电子天平：上海欧普特有限公司； PHS-3C酸度计：成都世纪方舟科技有限公司；Vortex-2旋涡混匀仪：上海沪析实业有限公司；0.22 μm有机相滤膜：尤尼柯（上海）科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 种子液制备
产酸菌种子液：将斜面保存的产酸菌在平板上连续划线两次后，接种于产酸菌活化培养基中，35 ℃条件下培养18 h，连续活化两次后备用。
产酯化酶菌株种子液：将斜面保存的产酯化酶菌株在平板上划线，连续划线2次后，接种于种子液培养基中，37 ℃，180 r/min活化12 h，连续活化两代后备用。
1.2.2 拮抗性检测
为研究不同菌株在混合培养条件下是否存在竞争抑制关系，对不同的产酸菌和产酯化酶菌株进行混合培养试验。将以上产酸菌和产酯化酶菌株活化后分别接种5% 于产酯培养基中厌氧发酵1 d后，得到发酵液。用紫外可见分光光度计测定发酵液的OD600 nm值，以单株发酵作为对照，接种无菌水的培养基作为空白，每组做3组平行，结果取平均值。
1.2.3 二元混菌发酵体系的建立
将产酸菌和产酯化酶菌株分别按5%的接种量同时接种于产脂肪酸乙酯培养基中，以产酯化酶单菌发酵为对照，接种等量无菌水为空白，35 ℃厌氧发酵12 d，分别测定其发酵液成分及含量。
1.2.4 产酯化酶菌株接种时间的确定
分别在产酸菌接入产酯培养基的第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天时接种5%的产酯化酶菌株种子液，在接入产酯化酶菌株种子液的5 d后取样测定发酵液成分及含量。以己酸乙酯的含量为指标，确定产酯化酶菌株种子液的最佳接种时间。
1.2.5 产酯化酶菌株接种量的确定
在产酯化酶菌株接种时间确定以后，设置产酯化酶菌株的接种量为1%、3%、5%、7%、9%，在接入产酯化酶菌株种子液的5 d后取样测定发酵液成分及含量。以己酸乙酯的含量为指标，确定产酯化酶菌株种子液的最佳接种时间。
1.2.6 二元混菌体系发酵时间的确定
在产酯化酶菌株接种时间及接种量确定以后，将接入产酯化酶菌株后的二元混菌发酵体系于35 ℃、厌氧发酵第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天后，分别测定发酵液成分及含量，以己酸乙酯含量为指标，确定接入产酯化酶菌株后的二元混菌发酵体系的最佳发酵时间。
1.2.7 响应面设计优化二元混菌发酵体系发酵条件
在单因素试验的基础上，根据响应面中心组合试验设计原理，运用Design-Expert 13对产酯化酶菌株接种时间（A），产酯化酶菌株接种量（B）、二元混菌发酵时间（C）为自变量，以己酸乙酯含量为响应值（Y），设计三因素三水平的响应面试验，如表1所示，以确定二元混菌发酵体系产己酸乙酯最佳的发酵时间[21]。
表1 Box-Behnken 试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
因素水平-1 B 产酯化酶菌株接种量/%C 二元混菌发酵时间/d 0 1 A 产酯化酶菌株接种时间第7 天第9 天第11 天3 5 7 3 5 7
1.2.8 酯化液前处理
将二元混菌产酯发酵体系终止发酵，用5 mL注射器吸取适量发酵液过0.22 μm有机相滤膜，滤液即为酯化液。
1.2.9 酯化液中酯类化合物含量测定
移取1 mL酯化液装入气相色谱瓶中，加入10 μL的乙酸正丁酯，混匀后，采用气相色谱质谱联用仪测定酯化液中酯类化合物的含量。
1.3 统计分析
所有试验均为3个重复，所有检验数据均以平均值±标准差表示。使用Origin 2021软件对相关图像进行绘制和单因素方差分析（P＜0.05）。响应曲面法根据Box-Benhnken中心组合设计方案，以Design-Expert 13进行分析。
2 结果与分析
2.1 拮抗性检测
为研究所构建的二元混菌体系的不同发酵元之间是否存在明显的竞争抑制关系，以单菌发酵为对照，两个不同的发酵元构建的二元混菌体系为试验组，测定其OD600 nm值[22]。不同发酵体系混合培养生物量试验结果如图1所示。
图1 不同发酵体系混合培养生物量
Fig.1 Mixed culture biomass of different fermentation systems
由图1可知，GD1-1+ARUV3-2、GD1-1+ARUV3-26、WZ-1+ARUV3-26、GD1-1+S5-4、WZ-1+S5-4共计5个二元混菌体系的OD600 nm高于单菌培养时的OD600 nm值，分 别 为1.88±0.01、7.93±0.01、1.97±0.04、1.56±0.01；而单菌GD1-1发酵后的OD600 nm值为1.63±0.02、WZ-1发酵后的OD600 nm值为0.35±0.05、ARUV3-2发酵后的OD600 nm值为2.65±0.01、ARUV3-26发酵后的OD600 nm值为4.13±0.01、S5-4发酵后的OD600 nm值为3.75±0.01。虽然上述二元混菌体系中的某一菌株的OD600 nm值可能会低于单菌单独发酵的OD600 nm值，但是总体生物量是高于单菌发酵的OD600 nm值，这证明上述二元混菌体系各菌株可以较为协同地生长。二元混菌体系的OD600 nm值高于单菌生长时的OD600 nm值，表明上述两种菌株具有较好的协同能力，但在酯类化合物的合成上是否存在协调作用还需要进一步研究证明，因此以单菌发酵为对照，对上述二元混菌体系的发酵液成分和含量进行测定。
2.2 二元混菌体系功能菌株的选择
不同发酵体系发酵液成分及含量如表2所示。
表2 不同发酵体系发酵液成分及含量
Table 2 Components and their content in fermentation liquids of different fermentation systems g/L
注：-表示空值。
菌株ARUV3-2 ARUV3-26 S5-4 GD1-1 WZ-1 GD1-1+ARUV3-2 GD1-1+ARUV3-26 WZ-1+ARUV3-26 GD1-1+S5-4 WZ-1+S5-4乙酸丁酸乳酸己酸丁酸乙酯己酸乙酯戊酸乙酯--------1.770 0---乙酸乙酯-0.170 0 0.097 0乳酸乙酯-0.360 0 0.290 0 0.920 0 1.740 0 0.730 0 0.540 0 1.770 0 1.730 0 1.390 0 2.560 0 1.350 0 1.470 0 1.350 0 1.360 0 4.470 1.320 0---3.430 0.590 0苯乙醇-0.017 0 0.002 5 5.000 0--------------------2.570 0.620 0 1.360 0 1.470 0-----正丙醇0.014 0 0.021 0 0.011 0 0.030 0-0.061 0 0.250 0 0.023 0 0.047 0 0.013 0 0.014 0 0.015 0 0.002 3 0.002 4 1.440 0.027 0 1.320 0.023 0 1.320 0-1.050-1.170 0.150 0 0.980 0 0.130 0 1.040-0.810 0-----------庚酸乙酯0.003 0 0.001 7 0.000 9-0.003 3-0.001 3 0.004 5 0.001 2 0.004 3
由表2可知，使用通过ARTP-UV复合诱变的高产酯化酶的突变株ARUV3-26与本实验室之前保存的丁酸梭菌（Clostridium butyricum） GD1-1能够与乙醇发生酯化反应，而不需要任何辅助因子和有机试剂就可以产生乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和庚酸乙酯，且含量分别为1.440 0、1.320 0、1.170 0、1.040 0、0.001 3 g/L。格氏乳球菌 （Lactococcus garvieae） S5-4在产酯培养基中产乙酸1.77 0 g/L、正丙醇0.011 0 g/L、乙酸乙酯0.097 0 g/L、乳酸乙酯0.290 0 g/L、庚酸乙酯0.000 9 g/L，突变株ARUV3-26在产酯培养基中产正丙醇0.021 0 g/L、乙酸乙酯0.170 0 g/L、乳酸乙酯0.290 0 g/L、庚酸乙酯0.001 7 g/L。可见，L. garvieae S5-4及其突变株ARUV3-26在产酯培养基中单菌发酵时具备产乳酸、正丙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯和庚酸乙酯的功能特性。C. butyricum GD1-1在产酯培养基中产乙酸0.920 0 g/L、丁酸2.560 0 g/L、己酸3.430 0 g/L。
有研究发现酯化酶利用其他底物生产酯，如通过酯交换作用产生醇和乙酰辅酶A，通过氧化产生酮[11]。虽然这些反应有助于酯类化合物的合成，但酯化酶仅在胞内起作用，并且需要辅因子[23]，而研究构建的二元混菌体系解除这些限制。这使得经过常压室温等离子体紫外线复合诱变的高产酯化酶突变株L. garvieae ARUV3-26和高产短链脂肪酸C. butyricum GD1-1的使用更加实际。
2.3 产酯化酶菌株接种时间的确定
已确定二元混菌发酵体系的发酵元为产酯化酶突变株S. paucimobilis ARUV3-26与C. butyricum GD1-1。C. butyricum GD1-1是由本实验室前期筛选保藏的一株高产短链脂肪酸的功能菌株[16]。为提升二元混菌发酵体系产酯化液的功能特性，以浓香型白酒当中的主体风味物质己酸乙酯含量为指标[24]，确认产酯化酶菌株的最佳接种时间，结果如图2所示。
图2 产酯化酶菌株接种时间对己酸乙酯含量的影响
Fig.2 Effect of inoculation time point of the esterase-producing strain on ethyl caproate content
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图2可知，产酯化酶菌株在第9天接种时产脂肪酸乙酯的培养基中时己酸乙酯的含量最高，为（1.07±0.02） g/L，与其他接种时间发酵后的己酸乙酯含量相比，差异显著。因此，选择在脂肪酸乙酯培养基发酵第9天时接入产酯化酶菌株进行后续响应面试验。
2.4 产酯化酶菌株接种量的确定
产酯化酶菌株接种量对己酸乙酯含量的影响如图3所示。
图3 产酯化酶菌株接种量对己酸乙酯含量的影响
Fig.3 Effect of inoculation amount of the esterase-producing strain on ethyl caproate content
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图3可知，随着产酯化酶菌株接种量的增加，己酸乙酯的含量先升高后降低，当设置产酯化酶菌株的接种量在5%时，己酸乙酯的含量最高，为（1.36±0.01）g/L，与7% 接种量的己酸乙酯含量差异不显著，但是在节约成本的基础上，选择5% 的接种量进行后续试验。龚虎程等[25]将3株产酯化菌株与异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus） JM-4协同发酵，发现最优发酵条件为接种量6%，与本研究结果相似。因此，选择5% 的产酯化酶菌株接种量进行后续响应面试验。
2.5 二元混菌发酵时间的确定
在添加对应的产酯化酶菌株后，构建的二元混菌发酵体系的发酵时间将会直接影响己酸乙酯的含量，以二元混菌发酵时间为自变量，测定二元发酵体系中己酸乙酯的含量，结果如图4所示。
图4 二元混菌发酵时间对己酸乙酯含量的影响
Fig.4 Effect of fermentation time of the system with binary mixed bacteria on ethyl caproate content
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4可知，在二元混菌体系发酵第5天时，己酸乙酯的含量最高，为（1.41±0.02） g/L，与其他发酵时间后所产生的己酸乙酯含量差异显著。 混菌体系发酵的最佳时间在5～7 d，己酸乙酯的含量达到最优，这与何宏魁等[26]研究结果相似。因此，选择混菌发酵体系时间为5～7 d进行后续响应面试验。
2.6 响应面试验设计及结果
选取对试验结果影响较大的前三梯度，设计响应面试验，结果见表3。
表3 Box-Behnken 试验设计及结果
Table 3 Box-Behnken design and test results for optimization
试验编号A 产酯化酶菌株接种时间1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 0-C 二元混菌发酵时间1-1 1 0 0 0 1 0-B 产酯化酶菌株接种量0-1 1-1 0 0 0 0 0-0 1 0 0-11 12 13 14 15 16 17 1 1 1 0 0 0-1 1 1 1 1 0-1 0 1 0 0 1--1 0 1 0 0 1 0 0-1 0己酸乙酯含量/（g/L）1.37 0.97 1.19 1.23 1.48 1.47 1.35 1.45 1.33 1.17 1.35 1.31 1.19 1.44 0.93 0.95 1.43
2.7 模型方程的建立与显著性检验
用Design Expert 13软件对表3中的数据进行多项拟合回归，得到的二次回归方程预测模型如下。
回归模型方差分析结果见表4。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of the regression model
注：* 表示影响显著，P＜0.05；** 表示影响极显著，P＜0.01。
来源模型自由度A B C A B显著性********AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总和平方和0.527 0 0.088 2 0.068 5 0.076 1 0.001 6 0.032 4 0.004 9 0.050 5 0.143 3 0.037 6 0.004 4 0.002 7 0.001 7 0.531 4 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6均方0.058 6 0.088 2 0.068 5 0.076 1 0.001 6 0.032 4 0.004 9 0.050 5 0.143 3 0.037 6 0.000 6 0.000 9 0.000 4 F 值92.73 139.68 108.40 120.44 2.53 51.31 7.76 79.95 226.99 59.55 P 值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.155 4 0.000 2 0.027 1＜0.000 1＜0.000 1 0.000 1*********2.09 0.243 9
由表4可知，模型的P＜0.000 1，失拟项P=0.243 9＞0.05，不显著，说明本试验所得二次回归方程拟合度良好，能够很好地对响应面进行预测。决定系数R2=0.991 7，调整系数R2=0.991 0，预测系数R2=0.913 6，调整系数与预测系数两个值接近，表明拟合程度良好，可以采用此模型预测突变株的己酸乙酯含量。由F值可以看出，3个因素对己酸乙酯含量影响的大小顺序为A＞C＞B。
2.8 各因素交互作用
两个因素之间的相互作用通过响应面来表达，图5显示了三维响应面和二维等高线。各因素交互作用对己酸乙酯含量影响的响应面图和等高线图如图5所示。
图5 各因素交互作用对二元混菌体系产己酸乙酯含量影响的响应面和等高线图
Fig.5 Response surface and contour plots of the interactions between factors on the production of ethyl hexanoate by the fermentation system with binary mixed bacteria
由图5可知，3个因素对应的曲面图中，响应面图最陡峭、等高线图最接近椭圆的是产酯化酶菌株接种量的变化曲线，其次是产酯化酶菌株接种时间，最后是二元混菌发酵体系的发酵时间。产酯化酶菌株接种时间和接种量对混菌发酵时间作用较为显著，与方差分析结果一致。
2.9 模型验证试验
经Design-Expert 13软件分析，显示二元混菌体系中产酯化酶菌株的最佳条件参数：产酯化酶菌株接种时间为第3.4天、产酯化酶菌株的接种量5.335%、二元混菌发酵时间为第5.3天，此条件下己酸乙酯含量预测值为1.493 g/L。根据实际条件，调整二元混菌体系中产酯化酶菌株的接种时间为第3.4天、产酯化酶菌株的接种量为5.3%、二元混菌发酵时间为5.3 d，进行模型预测值验证试验，做3次平行，二元混菌体系所产己酸乙酯的含量为（1.48±0.11） g/L，与预测OD600 nm的偏差为0.87%，说明该模型能够很好地预测二元混菌发酵体系的己酸乙酯的含量。相比于单因素和响应面优化前的二元混菌体系产己酸乙酯1.04 g/L，己酸乙酯含量提升了29.73%。Lai等[27]筛选鉴定出3株具有酯化能力的产香新菌株，分别为哈萨克酵母（Kazachstania exigua）、假丝酵母（Candida humilis）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其中酿酒酵母S5为新的优势菌株，在响应面优化后的培养基中产生161.88 mg/L的乙酸乙酯。而本次验证试验的己酸乙酯实际含量为（1.48±0.11） g/L，与预测含量1.493 g/L较为接近，且此时发酵液中乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和庚酸乙酯的含量分别为（0.87±0.02）、（0.91±0.03）、（1.16±0.05）、（0.005 4±0.000 3） g/L。综上，表明方程拟合性好，模型准确，说明本试验设计的优化方案合理，得到的发酵条件可以有效提高二元混菌体系合成己酸乙酯的能力。与龚虎程等[25]的研究结果相比，在混菌发酵体系下己酸乙酯的含量提高了1.26 g/L。本研究与其它的混菌发酵体系相比在己酸乙酯和丁酸乙酯的含量都有所提升[28-29]，这对酯化液的生产具有较高应用价值。
3 结论
本研究以产酸菌和产酯化酶菌株构建二元混菌发酵体系，OD600 nm为指标确立无竞争抑制作用的二元混菌体系。测定无竞争抑制作用的二元混菌体系的发酵液成分及含量，产物为脂肪酸乙酯等风味物质。结果显示以产酯化酶突变株S. paucimobilis ARUV3-26与C. butyricum GD1-1为发酵元构建的二元混菌发酵体系中的脂肪酸乙酯含量最高，其中乙酸乙酯1.44 g/L、丁酸乙酯1.32 g/L、乳酸乙酯1.17 g/L和己酸乙酯1.04 g/L。以产酯化酶菌株接种时间、产酯化酶菌株接种量和二元混菌发酵时间为自变量，设计单因素和响应面试验，己酸乙酯含量为响应值。结果表明，优化后二元混菌体系中产酯化酶菌株的接种时间为第3.4天、产酯化酶菌株的接种量为5.3%、混菌二元体系的发酵时间为5.3 d，二元混菌体系所产己酸乙酯的含量为（1.48±0.11） g/L。本研究构建的二元混菌产酯发酵体系中的各功能菌可以协同生长，缩短了发酵时间，提高了原材料、设备等利用率，且酯化液中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯以及己酸乙酯的含量较高，具有良好前景。
[1] FAN W L, QIAN M C. Identification of aroma compounds in Chinese ′Yanghe Daqu′ liquor by normal phase chromatography fractionation followed by gas chromatography [sol] olfactometry[J]. Flavour and Fragrance Journal, 2006, 21(2): 333-342.
[2] XU Y Q, SUN B G, FAN G S, et al. The brewing process and microbial diversity of strong flavour Chinese spirits: A review[J]. Journal of the Institute of Brewing, 2017, 123(1): 5-12.
[3] QIAN Y L, AN Y Q, CHEN S, et al. Characterization of Qingke liquor aroma from Tibet[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(50): 13870-13881.
[4] XU Y Q, ZHAO J R, LIU X, et al. Flavor mystery of Chinese traditional fermented Baijiu: The great contribution of ester compounds[J]. Food Chemistry, 2022, 369: 130920.
[5] ZHENG X W, Han B Z. Baijiu, Chinese liquor: History, classification and manufacture[J]. Journal of Ethnic Foods, 2016, 3: 19-25.
[6] DENG Y H, XIONG A Y, ZHAO K, et al. Mechanisms of the regulation of ester balance between oxidation and esterification in aged Baijiu[J]. Scientific Reports, 2020, 10(1): 17169.
[7] SUN N, GAO Z Y, LI S Q, et al. Assessment of chemical constitution and aroma properties of kiwi wines obtained from pure and mixed fermentation with Wickerhamomyces anomalus and Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2022, 102(1): 175-184.
[8] LIN X Q, ZHANG X, ZHANG J, et al. Effects of different inoculation methods and strains on glycerol, acetic acid, ethanol, and esters in mixed fermentation of Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae[J]. AIP Conference Proceedings, 2021, 2350(1):020001.
[9] MORALES M L, FIERRO-RISCO J, RÍOS-REINA R, et al. Influence of Saccharomyces cerevisiae and Lachancea thermotolerans coinoculation on volatile profile in fermentations of a must with a high sugar content[J]. Food Chemistry, 2019, 276: 427-435.
[10] 林良才, 梁梦帆, 杜荣菲, 等. 水相条件下合成短链脂肪酸酯霉菌角质酶的筛选与催化特性研究[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(7): 1-8.LIN Liangcai, LIANG Mengfan, DU Rongfei, et al. Screening and characterization of fungal cutinases for synthesis of short chain fatty esters in aqueous phase[J]. Food and Fermentation Industries,2024, 50(7): 1-8.
[11] KRUIS A J, BOHNENKAMP A C, PATINIOS C, et al. Microbial production of short and medium chain esters: Enzymes, pathways,and applications[J]. Biotechnology Advances, 2019, 37(7): 107407.
[12] SUN J C, YU B, CURRAN P, et al. Optimisation of flavour ester biosynthesis in an aqueous system of coconut cream and fusel oil catalysed by lipase[J]. Food Chemistry, 2012, 135(4): 2714-2720.
[13] ZOU W, YE G B, LIU C J, et al. Comparative genome analysis of Clostridium beijerinckii strains isolated from pit mud of Chinese strong flavor Baijiu ecosystem[J]. G3, 2021, 11(11): jkab317.
[14] KOU H, ZHENG J, YE G B, et al. Optimization of Clostridium beijerinckii semi-solid fermentation of rape straw to produce butyric acid by genome analysis[J]. Bioresources and Bioprocessing, 2024,11(1): 24.
[15] LIU C J, DU Y F, ZHENG J, et al. Production of caproic acid by Rummeliibacillus suwonensis 3B-1 isolated from the pit mud of strong-flavor Baijiu[J]. Journal of Biotechnology, 2022, 358: 33-40.
[16] LI M, LI T, ZHENG J, et al. Genome analysis and optimization of caproic acid production of Clostridium butyricum GD1-1 isolated from the pit mud of nongxiangxing Baijiu[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2023, 33(10): 1337-1350.
[17] LUO H, LI T, ZHENG J, et al. Isolation, identification, and fermentation medium optimization of a caproic acid-producing Enterococcus casseliflavus strain from pit mud of Chinese strong flavor Baijiu ecosystem[J]. Polish Journal of Microbiology, 2022, 71(4): 563-575.
[18] 田雨思, 衡小成, 邹伟, 等. 浓香型白酒窖泥中梭菌的分离、鉴定及产丁酸性能的比较研究[J]. 食品与发酵工业, 2019, 45(23):60-65.TIAN Yusi, HENG Xiaocheng, ZOU Wei, et al. Isolation and identification of clostridia from the pit mud of Strong-flavor Baijiu and comparative study on butyric acid production[J]. Food and Fermentation Industries, 2019, 45(23): 60-65.
[19] 汤秀娟, 吴成泽, 陈聪, 等. 高产酯酶细菌的筛选、鉴定及复合诱变选育[J]. 中国酿造, 2023, 42(12): 87-92.TANG Xiujuan, WU Chengze, CHEN Cong, et al. Screening, identification and compound mutation breeding of high-yield esterase bacteria[J]. China Brewing, 2023, 42(12): 87-92.
[20] 陈聪, 邹伟, 汤秀娟, 等. 产酯酶格氏乳球菌的筛选、鉴定与基因组注释[J]. 食品科学, 2024, 45(8): 87-95.CHEN Cong, ZOU Wei, TANG Xiujuan, et al. Screening, identification and genome annotation of esterase-producing Lactococcus garvieae[J]. Food Science, 2024, 45(8): 87-95.
[21] 周静, 黄文茂, 秦利军, 等. 四株PGPR 菌株混菌发酵体系的构建及促生效应评价[J]. 生物技术通报, 2021, 37(4): 116-126.ZHOU Jing, HUANG Wenmao, QIN Lijun, et al. Construction of mixed fermentation system of four PGPR strains and evaluation of its promoting effect[J]. Biotechnology Bulletin, 2021, 37(4): 116-126.
[22] 王晗, 朱颖男, 高远, 等. 两株乳酸菌的发酵特性及在发酵驴肉肠中的应用[J]. 食品工业科技, 2020, 41(1): 171-179.WANG Han, ZHU Yingnan, GAO Yuan, et al. Fermentation characteristics of two kinds of lactic acid bacteria and their application in fermented donkey sausage[J]. Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(1): 171-179.
[23] ARANDA J, CERQUEIRA N A, FERNANDES P A, et al. The catalytic mechanism of carboxylesterases: A computational study[J].Biochemistry, 2014, 53(36): 5820-5829.
[24] LIU H L, SUN B G. Effect of fermentation processing on the flavor of Baijiu[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(22): 5425-5432.
[25] 龚虎程, 王宇, 罗静, 等. 窖泥中酯化菌的筛选鉴定及协同发酵条件优化[J]. 中国酿造, 2023, 42(12): 81-86.GONG Hucheng, WANG Yu, LUO Jing, et al. Screening and identification of esterifying bacteria from pit mud and conditions optimization of synergistic fermentation[J]. China Brewing, 2023, 42(12):81-86.
[26] 何宏魁, 曹润洁, 周庆伍, 等. “增己降乳” 组合菌制剂在浓香型白酒中的应用研究[J]. 酿酒科技, 2021(9): 87-93, 106.HE Hongkui, CAO Runjie, ZHOU Qingwu, et al. Application of mixed bacteria preparation in the production of Nongxiang Baijiu to increase the content of ethyl caproate and reduce the content of ethyl lactate[J]. Liquor-Making Science & Technology, 2021(9): 87-93, 106.
[27] LAI Y T, CHENG K C, LAI C N, et al. Isolation and identification of aroma producing strain with esterification capacity from yellow water[J]. PLoS One, 2019, 14(2): e0211356.
[28] 郭燕, 邓杰, 任志强, 等. 响应面优化酿酒酵母与窖泥酯化细菌协同发酵产丁酸乙酯和己酸乙酯[J]. 食品科学, 2021, 42(10):209-217.GUO Yan, DENG Jie, REN Zhiqiang, et al. Optimization of the production of ethyl hexanoate and ethyl butyrate by cofermentation of Saccharomyces cerevisiae and esterifying bacteria from pit mud of Chinese Baijiu using response surface methodology[J]. Food Science, 2021, 42(10): 209-217.
[29] GAO J J, QIN J J, YE F P, et al. Constructing simplified microbial consortia to improve the key flavour compounds during strong aroma-type Baijiu fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2022, 369: 109594.