甜菜碱学名为三甲基甘氨酸，是一种生物碱，分子结构与氨基酸类似，属季铵碱类物质[1]。甜菜碱广泛存在于哺乳动物、禽类与植物的根、茎、叶中，是一种能够调节生物体内部环境、增强机体活性的天然物质[2-3]。甜菜碱在动物体内主要以转甲基供体的形式调节机体营养物质的代谢[4]。甜菜碱具有维持细胞渗透压[5-6]、转甲基[7-8]、调节脂肪代谢[9-10]的功能，可以增强机体免疫力与抗氧化能力[11-12]，同时，还具有预防肝损伤和抑制癌症的作用[13-14]。目前测定甜菜碱含量的方法主要有比色法[15]、酸碱滴定法[16]、薄层色谱法[17]、紫外分光光度法[18]、离子色谱法[19]、高效液相色谱法[20]、高效液相色谱-串联质谱法[21]。其中，比色法对仪器要求低，适于方法的推广，但前处理繁琐，对人员操作要求高，结果的准确度和重复性较低，限制了方法的使用；酸碱滴定法成本低，但滴定过程中受样品中色素等杂质的干扰，测定终点不易判断，结果准确度较低；薄层色谱法操作方便、设备要求简单，但是方法检测灵敏度较低、重现性较差，不适用于含量较低的甜菜碱样品的测定；紫外分光光度法使用较为普遍，具有操作简单、快速灵敏和应用范围广的特点，但容易受到复杂的食品基质的影响，检测精度相对较低；离子色谱法灵敏度较高、重复性好且分析速度快，但对仪器要求较高，不利于方法的推广；高效液相色谱-串联质谱法分析速度快、准确性和灵敏度高，但是溶剂难挥发、本底效应高，对基质复杂的样品检测难度较大，且仪器昂贵，限制了方法的推广；高效液相色谱法具有高效、准确和应用范围广的特点，且流动相可选择性范围宽、色谱柱可反复使用，目前已广泛应用于食品中营养功能成分的检测，也是国家标准和行业标准常用的仲裁方法。
国外测定甜菜碱的方法是《美国药典/国家处方集》（U.S. Pharmacopeia/National Formulary，USP/NF），该方法是唯一由美国食品药品监督管理局强制执行的法定标准，方法采用红外/紫外分光光度法对甜菜碱进行鉴别，高氯酸滴定法对甜菜碱进行检验。国内测定甜菜碱的标准方法有行业标准、地方标准和团体标准，主要采用比色法和高效液相色谱法，适用于甜菜、枸杞及植物源性食品中甜菜碱的测定。目前，尚未建立食品中甜菜碱测定的国家标准方法。本试验通过单因素试验分析提取试剂、提取时间、提取温度、料液比和提取方式对红甜菜中甜菜碱提取得率的影响，在单因素试验结果的基础上，以甲醇体积分数、提取温度、提取时间为考察因素，甜菜碱含量为评价指标，采用正交试验设计对红甜菜中甜菜碱的提取方法进行优化。通过优化甜菜碱的色谱柱和流动相，得到峰形对称的甜菜碱液相色谱条件，以期建立食品中甜菜碱测定的高效液相色谱法，为食品中甜菜碱含量的测定方法提供数据基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
红甜菜、干枸杞、藜麦、菠菜、橙子、白心火龙果、西红柿、甜瓜、豌豆荚、香蕉、西兰花、红心火龙果、土豆、黄豆、糙米、红豆粉、纳豆冻干粉、茯苓红豆薏米粉、多种莓果麦片、豆浆粉：市售；甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈（均为色谱纯）：美国Fisher公司；甜菜碱标准品（≥98%）：美国Sigma化学公司。
GM 200粉碎机：德国Retsch公司；BS224S型分析天平：德国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；ZHWY-110X30往复式恒温水浴摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；IKA VORTEX 3涡旋振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；1260高效液相色谱仪：美国Aglient公司。
1.2 试验方法
1.2.1 试样制备
取试样可食部分用粉碎机（1 000 r/min、3 min）粉碎，混匀后储存于样品瓶中待测。
1.2.2 单因素试验
1.2.2.1 提取试剂的选择
称取1.0 g红甜菜于150 mL具塞三角瓶中，分别加入20 mL 60% 甲醇溶液、70% 甲醇溶液、80% 甲醇溶液、无水甲醇、三氯甲烷∶甲醇溶液=1∶1（体积比）、二氯甲烷∶甲醇溶液=1∶1（体积比）和超纯水7种提取试剂，置于45 ℃往复式恒温水浴摇床中120 r/min振荡提取10 min，冷却至室温，将7种提取溶液提取后的样品转入25 mL容量瓶中，分别用上述7种提取试剂洗涤锥形瓶，将洗液全部转移至容量瓶中，用相应溶剂定容后，过0.45 μm滤膜，供高效液相色谱仪测定样品中的甜菜碱含量。
1.2.2.2 提取时间的选择
称取1.0 g红甜菜于150 mL具塞三角瓶中，按料液比1∶25（g/mL）加入无水甲醇，置于45 ℃往复式恒温水浴摇床中120 r/min振荡提取10、20、30、40、50、60、70 min，其他操作步骤同1.2.2.1，测定不同提取时间样品中的甜菜碱含量。
1.2.2.3 提取温度的选择
称取1.0 g红甜菜于150 mL具塞三角瓶中，按料液比1∶25（g/mL）加入无水甲醇，分别置于25、35、45、55、65、75、85、100 ℃往复式恒温水浴摇床中120 r/min振荡提取10 min，其他操作步骤同1.2.2.1，测定不同提取温度样品中的甜菜碱含量。
1.2.2.4 料液比的选择
称取1.0 g红甜菜于150 mL具塞三角瓶中，分别以料液比为1∶15、1∶25、1∶35、1∶45（g/mL）加入无水甲醇，置于45 ℃往复式恒温水浴摇床中120 r/min振荡提取10 min，其他操作步骤同1.2.2.1，测定不同料液比样品中的甜菜碱含量。
1.2.2.5 提取方式的选择
称取1.0 g红甜菜于150 mL具塞三角瓶中，按料液比1∶25（g/mL）加入无水甲醇，分别进行10 min的超声提取、涡旋振荡提取、45 ℃往复式恒温水浴摇床120 r/min振荡提取，其他操作步骤同1.2.2.1，测定不同提取方式样品中的甜菜碱含量。
1.2.3 正交试验
在单因素结果的基础上，以甲醇体积分数、提取温度、提取时间为考察因素，甜菜碱含量为指标，采用L9（34）正交试验设计对红甜菜中甜菜碱的提取方法进行优化。正交试验因素和水平见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Orthogonal experimental factors and levels
水平因素1 2 3 A 甲醇体积分数/%100 80 70 B 提取温度/℃35 45 55 C 提取时间/min 10 20 30
1.2.4 测定条件的选择
1.2.4.1 色谱柱的选择
将1.00 mg/mL甜菜碱标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，选择SB-Aq色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）、NH2色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）、亲水作用色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；乙腈∶水=80∶20（体积比）等度洗脱；流速1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长196 nm；进样量10 μL；根据甜菜碱峰形对称性确定最佳色谱条件。
1.2.4.2 流动相的选择
将1.00 mg/mL甜菜碱标准工作液注入高效液相色谱仪中，选择亲水作用色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流动相为乙腈与水体积比50∶50、60∶40、70∶30、80∶20，分别进行等度洗脱；流速1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长196 nm；进样量10 μL；根据甜菜碱峰形对称性确定最佳色谱条件。
1.2.5 方法学验证
1.2.5.1 方法的线性范围
准确称取甜菜碱标准品25.0 mg，用超纯水溶解并定容至25 mL，即为1.0 mg/mL标准储备溶液。分别吸 取 标 准 储 备 溶 液0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL于10 mL容量瓶，用超纯水配制成浓度为0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/mL的标准工作溶液。将标准工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.5.2 方法的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）
红甜菜样品按照本试验优化的方法处理，上机测定观察信噪比，稀释至甜菜碱浓度为0.001 mg/mL和0.003 mg/mL，检出限和定量限分别以3倍和10倍的信噪比计算。
1.2.5.3 方法的精密度
分别称取干枸杞、藜麦和菠菜样品，按照试验优化的提取工艺处理，平行测定6次，考察方法的精密度。
1.2.5.4 方法的回收率
分别称取干枸杞、藜麦和菠菜样品，向干枸杞和菠菜中添加1.00、2.00、4.00 mg甜菜碱标准品，向藜麦中添加0.45、0.90、1.80 mg甜菜碱标准品，进行加标回收试验，计算甜菜碱的回收率和相对标准偏差。
1.2.6 样品测定
选取橙子、白心火龙果、西红柿、甜瓜、豌豆荚、香蕉、西兰花、红心火龙果、土豆、黄豆、糙米、红豆粉、纳豆冻干粉、茯苓红豆薏米粉、多种莓果麦片、豆浆粉16种样品。按试验建立的方法进行测定，计算不同样品中甜菜碱的含量和相对标准偏差。
1.2.7 甜菜碱含量的计算
样品中的甜菜碱含量按以下公式计算。
式中：X为样品中甜菜碱含量，mg/100 g；c为由标准曲线得到的甜菜碱质量浓度，mg/mL；f为样品溶液稀释倍数；V为样品溶液的定容体积，mL；m为样品质量，g；100为单位转换系数。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2016进行数据统计。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 提取试剂的确定
甜菜碱的提取多采用溶剂浸提法，甜菜碱易溶于水和甲醇，溶于乙醇，难溶于乙醚[22]，通常采用超纯水或一定比例的甲醇提取甜菜碱。目前国内也有研究表明采用三氯甲烷-甲醇溶液提取甜菜碱效果较好，参考国内外标准和文献[23-24]方法，选取不同提取试剂提取红甜菜中的甜菜碱含量，结果见表2。
表2 不同提取试剂红甜菜中的甜菜碱含量
Table 2 Betaine content in red sugar beet extracted with different solvents
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
甜菜碱含量/（mg/100 g）181.62±6.27c 195.18±3.48c 203.64±3.98b 222.63±5.76a 182.70±8.48c 186.87±11.83c 193.42±7.30bc提取试剂60%甲醇溶液70%甲醇溶液80%甲醇溶液无水甲醇三氯甲烷∶无水甲醇=1∶1（体积比）二氯甲烷∶无水甲醇=1∶1（体积比）超纯水
由表2可知，随着甲醇溶液浓度的增加，甜菜碱含量呈上升趋势，当采用无水甲醇提取时，甜菜碱含量最高，其次为80%甲醇溶液、70%甲醇溶液，60%甲醇溶液提取效果最差。因此，选择无水甲醇、70%甲醇溶液和80%甲醇溶液作为正交试验的提取试剂。
2.1.2 提取时间的选择
不同提取时间红甜菜中的甜菜碱含量见表3。
表3 不同提取时间红甜菜中的甜菜碱含量
Table 3 Betaine content in red sugar beet extracted for different time periods
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
提取时间/min 10 20 30 40 50 60 70甜菜碱含量/（mg/100 g）202.97±7.62ab 203.18±2.56a 204.14±1.29a 192.75±7.58b 190.84±5.72b 190.66±6.92b 191.40±3.05b
由表3可知，提取时间为10～30 min时，甜菜碱含量相近，提取30 min后，甜菜碱含量降低，这可能是因为甜菜碱易溶于无水甲醇，在无水甲醇中的释放速度较快。提取时间为10 min时甜菜碱可以从红甜菜基本完全释放至甲醇中，随着提取时间的延长，可能有部分甜菜碱降解，所以甜菜碱含量略微下降。因此，选择提取时间10、20、30 min进行后续正交试验。
2.1.3 提取温度的选择
不同提取温度红甜菜中的甜菜碱含量见表4。
表4 不同提取温度红甜菜中的甜菜碱含量
Table 4 Betaine content in red sugar beet extracted at different temperatures
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
提取温度/℃25 35 45 55 65 75 85 100甜菜碱含量/（mg/100 g）183.28±5.26c 199.96±5.80b 219.92±8.58a 202.25±8.94b 199.28±2.37b 193.03±8.68b 195.02±7.37b 193.10±3.48bc
由表4可知，随着提取温度的升高，甜菜碱含量呈上升趋势，提取温度45 ℃时，甜菜碱含量最高，这可能是由于提取温度升高分子运动速率加快，促进了甜菜碱的溶解和扩散，提取温度由45 ℃升高至100 ℃时，甜菜碱含量呈下降趋势，这可能是因为随着提取温度的升高，部分甜菜碱降解，导致样品中甜菜碱含量下降。因此，选择提取温度35、45、55 ℃进行后续正交试验。
2.1.4 料液比的选择
不同料液比红甜菜中的甜菜碱含量见表5。
表5 不同料液比红甜菜中的甜菜碱含量
Table 5 Betaine content in red sugar beet extracted with different solid-to-liquid ratios
注：同列相同字母表示差异不显著，P＞0.05。
料液比/（g/mL）1∶15 1∶25 1∶35 1∶45甜菜碱含量/（mg/100 g）217.16±5.78a 218.26±10.00a 220.96±11.19a 216.56±4.72a
由表5可知，不同料液比红甜菜中的甜菜碱含量无显著差异。选择适宜的料液比是为了保证甜菜碱与溶剂充分接触并扩散[25]，当料液比达到临界值时，随着溶剂添加量的增加，目标物不能全部转移到提取溶液中，导致提取不完全，可能是因为甜菜碱易溶于无水甲醇，且食品中甜菜碱是常规含量，因此，料液比不是影响甜菜碱提取的主要因素。综合考虑，选择料液比1∶25（g/mL）进行后续试验。
2.1.5 提取方式的选择
不同提取方式红甜菜中的甜菜碱含量见表6。
表6 不同提取方式红甜菜中的甜菜碱含量
Table 6 Betaine content in red sugar beet extracted by different methods
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
提取方式超声提取涡旋振荡提取45 ℃恒温水浴振荡提取甜菜碱含量/（mg/100 g）190.54±2.18b 195.31±11.00b 218.26±10.00a
由表6可知，45 ℃恒温水浴振荡提取测定的甜菜碱含量最高，超声辅助提取测定的甜菜碱含量最低。因此，选择45 ℃恒温水浴振荡提取的方式进行后续试验。
2.2 正交试验结果
正交试验结果分析如表7所示，方差分析结果如表8所示。
表7 正交试验结果
Table 7 Results of orthogonal experiments
序号因素A 甲醇体积分数B 提取温度C 提取时间1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2甜菜碱含量/（mg/100 g）209.32 209.25 205.09 199.10 199.97 193.76 197.41 196.78 194.45 k2 k3 R 207.89 197.61 196.21 35.02 201.94 202.00 197.77 12.52 199.95 200.93 200.82 2.94
表8 方差分析结果
Table 8 Analysis of variance results
注：P＜0.05 表示影响显著。
变异来源自由度A B C误差平方和243.87 35.38 1.72 2.09 2 2 2 2均方121.94 17.69 0.86 1.05 F 值127.95 18.56 P 值＜0.05＜0.05
由表7可知，各因素对甜菜碱含量影响程度的结果排序为A＞B＞C，即甲醇体积分数＞提取温度＞提取时间。由表8方差分析结果可知，甲醇体积分数和提取温度对甜菜碱含量存在显著性影响（P＜0.05），提取时间对甜菜碱含量无显著性影响（P＞0.05）。综合考虑极差分析和方差分析结果，确定最优工艺为A1B2C2。由于提取时间对甜菜碱含量无显著性影响，为进一步验证其对结果的影响，在A1B2C1、A1B2C2、A1B2C3工艺下进行3次平行试验验证，结果如表9所示。
表9 正交试验验证结果
Table 9 Validation of orthogonal experiment results
注：同列相同字母表示差异不显著，P＞0.05。
甜菜碱2测定值/（mg/100 g）1 216.32 213.52 208.53 3 A1B2C1 A1B2C2 A1B2C3 212.13 214.28 213.12 215.23 210.52 214.18平均值/（mg/100 g）214.56±2.17a 212.77±1.99a 211.94±3.00a RSD/%1.01 0.93 1.42
由表9可知，A1B2C1、A1B2C2、A1B2C3工艺条件下测定的甜菜碱含量无显著差异，A1B2C1工艺条件下甜菜碱含量与正交试验最优组结果相近，且均高于正交试验中的其它组别，即无水甲醇45 ℃水浴振荡提取10 min为甜菜碱提取的最优工艺。
2.3 测定条件的选择
2.3.1 色谱柱的选择
甜菜碱是一种季铵型水溶性生物碱，根据甜菜碱的化学结构特点，主要采用氨基柱、亲水性色谱柱，并结合二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器等进行检测[26-27]。由于甜菜碱亲水性较强，在水中极易溶解，在反相C18色谱柱上保留时间较短，因此，C18色谱柱不适于甜菜碱的分离。亲水作用色谱柱固定相是强亲水性的极性吸附剂，具有很强的亲水性，可以较好地保留甜菜碱等高极性化合物，适合于甜菜碱的测定[28]。氨基色谱柱的反相模式可以很好地应用于高极性化合物的分离[29]。亲水作用色谱柱和NH2色谱柱对于甜菜碱均具有无需衍生化和无需加入离子对试剂即可直接检测的优点。通过对比3种色谱柱对甜菜碱的分离效果，结果表明亲水作用色谱柱分离效果优于SB-Aq和NH2色谱柱。由于氨基色谱柱的固定相官能团氨丙基较容易水解，使用寿命不如亲水作用色谱柱色谱柱[30]。考虑甜菜碱的分离效果和色谱柱的使用寿命，试验选择亲水作用色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）。
2.3.2 流动相的选择
甜菜碱标准溶液高效液相色谱图如图1所示。
图1 甜菜碱标准溶液高效液相色谱图
Fig.1 High performance liquid chromatography of betaine standard solution
A.乙腈∶水=50∶50（体积比）；B.乙腈∶水=60∶40（体积比）；C.乙腈∶水=70∶30（体积比）；D.乙腈∶水=80∶20（体积比）。
由图1可知，随着乙腈添加量的增加，甜菜碱的出峰时间后移，乙腈∶水=80∶20（体积比）等度洗脱时，甜菜碱在14.521 min出峰，峰型对称性良好，因此选择乙腈∶水=80∶20（体积比）作为流动相。
2.4 方法学验证
2.4.1 方法的线性范围
甜菜碱标准浓度在0.01～1.00 mg/mL时，线性回归方程为y=2 147.3x-1.664 6，相关系数为0.999 9，可见甜菜碱在0.01～1.00 mg/mL范围内线性关系良好，可以满足检测要求。
2.4.2 方法的检出限与定量限
当样品取样量为5.0 g，定容体积为50 mL时，甜菜碱的检出限为1.0 mg/100 g，定量限为3.0 mg/100 g。
2.4.3 方法的精密度
根据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，被测组分含量大于100 mg/kg（10 mg/100 g）时，实验室内变异系数为3.8%。方法的精密度结果如表10所示。
表10 方法的精密度（n=6）
Table 10 Precision of the method（n=6）
样品干枸杞藜麦菠菜测定值/（mg/100 g）1 772.22 881.65 204.82 2 3 4 5 6 772.74 857.45 202.72 802.52 824.99 203.03 789.01 869.95 199.20 789.86 853.38 195.24 779.67 853.38 199.55平均值/（mg/100 g）784.34 858.59 200.76相对标准偏差/%1.49 2.24 1.72
由表10可知，干枸杞、藜麦和菠菜样品中的甜菜碱6次平行试验测定结果的相对标准偏差均小于3.8%，表明该方法的精密度良好，适合定量分析。
2.4.4 方法的回收率
根据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，被测组分含量大于100 mg/kg（10 mg/100 g）时，回收率范围为95%～105%。方法的回收率结果如表11所示。
表11 方法的回收率（n=6）
Table 11 Recovery rate of the method（n=6）
样品干枸杞本底值/（mg/100 g）784.34加标回收率/%加标量/mg 1.00 2.00 4.00 0.45 0.90 1.80 1.00 2.00 4.00 2 3 4 5 6藜麦858.59菠菜200.76 1 103.65 97.26 102.07 100.24 97.22 104.00 97.50 102.56 95.70 98.57 96.93 102.37 95.74 95.19 102.31 95.42 95.52 96.17 101.68 95.32 101.25 95.58 101.99 99.30 96.89 96.46 100.34 95.82 97.09 98.44 103.28 99.63 101.35 102.88 96.67 100.20 100.18 104.65 104.18 99.86 97.44 95.71 104.20 100.25 104.47 101.13 98.23 102.35 104.37 104.14 101.91 98.13 98.63 95.65平均值100.17 98.25 101.78 99.85 99.27 100.76 99.17 98.35 98.76相对标准偏差/%2.71 3.27 1.89 3.67 3.33 2.90 3.53 2.67 3.15
由表11可知，干枸杞、藜麦和菠菜样品中的甜菜碱平均加标回收率分别为98.25%～101.78%、99.27%～100.76%、98.35%～99.17%，加标回收率的相对标准偏差均小于5.0%，各组分回收率结果满足GB/T 27404—2008的要求，表明在最优提取工艺和测定条件下，样品中的甜菜碱可以被有效分离和高效回收，本试验建立的方法适用于食品中甜菜碱含量的测定。
2.5 实际样品中甜菜碱含量的测定结果
实际样品中甜菜碱含量的测定结果如表12所示。
表12 不同样品中的甜菜碱含量（n=3）
Table 12 Betaine content in different samples（n=3）
样品橙子白心火龙果西红柿甜瓜豌豆荚香蕉西兰花红心火龙果甜菜碱含量平均值/（mg/100 g）31.87 59.20 47.29 7.86 1 245.12甜菜碱含量平均值/（mg/100 g）78.93 133.61 77.71相对标准偏差/%1.72 0.64 0.77 1.46 0.08 1.74 4.69 0.43样品土豆黄豆糙米红豆粉纳豆冻干粉茯苓红豆薏米粉多种莓果麦片豆浆粉19.95 202.34 59.14 237.41 190.01 124.18 65.17 368.02相对标准偏差/%2.01 1.42 5.07 0.69 1.42 3.24 0.62 0.09
由表12可知，各样品在重复性条件下获得的3次独立测定结果的相对标准偏差均小于10%，说明试验建立的方法适用于食品中甜菜碱含量的测定。
3 结论
通过单因素和正交试验优化了甜菜碱的提取试剂、提取时间、提取温度、料液比和提取方式，建立了食品中甜菜碱测定的高效液相色谱方法。试验结果表明最佳提取工艺：以无水甲醇为提取溶剂、料液比1∶25（g/mL）、提取温度45 ℃、提取时间10 min，提取方式为恒温水浴振荡提取。采用亲水作用色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），乙腈∶水=80∶20（体积比）等度洗脱，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长196 nm。方法学验证和实际样品测定结果表明，本试验优化的方法具有灵敏度高、重现性好、准确性高、分析速度快的优点，适用于食品中甜菜碱的定量检测。
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