近年来，人们越来越意识到饮食在健康中的重要性，中药食补开始在消费者中普及。鹿茸自古以来都是我国的珍贵中药材[1]。鹿茸具有增强免疫力、促进骨修复、抗衰老、抗氧化、抗炎症等作用[2-7]，具有较高的经济价值。鹿茸种类繁多，其中药用价值较高的是梅花鹿茸及马鹿茸。根据国家处方数据库和保健品数据库统计，在传统中药制剂方面，以鹿茸为原料的保健品共275种，其中以马鹿茸为原料的共225种，占80%，以梅花鹿茸为原料的有50种，占20%[8]。但市面上鹿茸种类繁杂，存在以次充好情况[9]。目前鹿茸主要依靠传统鉴定、近红外光谱、指纹图谱、高效液相色谱等方法进行鉴定，可在一定程度上为鹿茸的鉴别提供依据[10]。但传统鉴定方法多依靠经验判断，难以保证准确性，近红外光谱法需使用近红外光谱仪，对环境有要求[11]，指纹图谱[12]和高效液相色谱方法操作复杂，耗时长[13]。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新颖的核酸扩增技术，其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，并在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下，在恒定的温度下即可完成靶DNA的特异性扩增[14-15]。LAMP与传统的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术相比，灵敏性更高，操作更为简便，同时可实现更高的扩增效率，正迅速发展成为临床和环境样本病原体检测的重要工具[16-18]。目前已有试验使用LAMP对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒Ⅱ型进行检测，其敏感性和特异性能达到87.5% 和80.6%[19]。LAMP技术在中药材鉴别领域极具应用推广前景。目前，已有试验使用LAMP技术实现对参环毛蚓、川贝、西洋参、巴戟天的快速鉴别[20-23]。
本方法针对梅花鹿茸及马鹿茸线粒体基因组的特异DNA片段设计LAMP引物，建立一种对于梅花鹿茸及马鹿茸基因检测方法，该方法相较传统的PCR检测方法，具有操作简单、省时省力，并且反应精确度高的特性。本研究旨在为基层实验室及养殖基地提供一种高效、快速、实用的鹿茸快速鉴别方法。
1 材料与方法
1.1 质粒构建
梅花鹿（MHL）鹿茸、马鹿（ML）鹿茸：市售。针对MHL及ML的特异性线粒体基因组片段，采用pUC57质粒为载体，由生工生物工程（上海）股份有限公司构建重组质粒。
1.2 主要试剂与仪器
质粒DNA提取试剂盒、DL 2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix：天根生化科技（北京）有限公司；LAMP试剂盒：苏州江镨健康科技有限公司；荧光定量PCR仪：新羿制造科技（北京）有限公司。
1.3 引物的设计
根据GenBank （MHL：GenBankDQ985076.1；ML：GenBank：KT290948.1KT290948.1）中所登录的梅花鹿和马鹿的线粒体基因组序列，通过LAMP引物设计网站（http：//primerexplorer.jp/e）设计特异性扩增引物，每种鹿茸设计3条特异性引物，其中FIP和BIP为内引物，F3和B3为外引物，LF和LB为环引物。引物由生工生物合成（上海）股份有限公司合成。梅花鹿茸及马鹿茸LAMP引物见表1。
表1 梅花鹿及马鹿茸LAMP 引物
Table 1 LAMP primers for sika deer antler and red deer antler
引物名称MH1-F3 MH1-B3 MH1-FIP MH1-BIP MH1-LB MH2-F3 MH2-B3 MH2-FIP MH2-BIP MH2-LF MH3-F3 MH3-B3 MH3-FIP MH3-BIP MH3-LB ML1-F3 ML1-B3 ML1-FIP ML1-BIP ML1-LB ML2-F3 ML2-B3 ML2-FIP ML2-BIP ML2-LF ML2-LB ML3-F3 ML3-B3 ML3-FIP ML3-BIP ML3-LF引物序列（5′～3′）TTGTGCTTGGTTTTGTAGG GTATTGCTCCGTGGCTAT CCAACTCCACCACTCACAATTAAATTTTCTTCGAAACCTTCGC TGTGGTATTGTGTTAAATTTTGGCG-CCACCATCATTCCTCCCA GTCCTTTCTGGGTTTAATGGTAT TCCTTTCTGGGTTTAATGGTAT AACCCAATCTCCTAATCCAT TCTCAGGGTATTGCTCCGTGTTATTTGGGAGGAATGATGGTG GGCGTTTGTTACTGGTCTGTTTGAAACACAATCTCCACCT GCTATTGCCGTTGTATAACCAA ATGGATTAGGAGATTGGGTTA AATGATATGAAAAACCATCGTTG TCAGGTACCATAACTGTAGAGAGCGGATTCTGGGTTTTTTAGTGAG TGTGACTGGGTGGTCTTTGTTAATTCATTCAACTACAAGAACACTT TGGTGTAGTGGTTATTATGGAAA GCAATTCCTATAGCCTCCTC CCTGAGATTTGGGTGTCT TGTTTCAGTTTAATGGATTAGGGGAACTAAAAAACCCAGAATCTCCT CCACCTCCTCATCCTTTAACACGACTGTATTGGGGGCATT ATAAACCATTGCAATTTCCATCA TGCCCCCAATACAGTCTT GGGGTTGGGATTAATTGTGA AGGGATGATGGTGGTTTTTGGTTATACACCCAAATCTCAGGGTAT AGAACACCATTAAACCCAGAAAGGGTGGTGGAGTTGGTTGTG GGCAATGGCTACAGAGCA ACCCACCAAAATTTAACACAA CATTAAACCCAGAAAGGACC ATAGTTGAATGACAACGATGG TTCGCCTATTTATGGGGGGTACAATACCACAACCAACTCC TCCCACAAACCCAAGCACAATGGTTAGATTCCATGTGAGAA TGGGATTAATTGTGAGTGGT
1.4 梅花鹿茸与马鹿茸的LAMP 标准反应体系的建立
采用LAMP试剂盒进行LAMP反应，反应体系为25 μL：2×MM 12.5 μL，Bst DNA聚合酶 1 μL，外引物F3和B3各5 pmol，内引物FIP和BIP各40 pmol，环引物LB和LF各20 pmol，重组质粒DNA 1 μL，染料Ft 1μL，超纯水补足25 μL。LAMP反应程序：采用荧光定量PCR仪实时监控扩增情况，反应程序为62 ℃恒温扩增40 min。 按照标准LAMP反应体系，将梅花鹿茸和马鹿茸的3组引物分别进行扩增，选择最佳引物。
1.5 梅花鹿茸和马鹿茸最佳反应温度确定
在标准LAMP反应体系的基础上，保证其它条件不变，配制LAMP反应体系，在61～65 ℃恒温反应40 min，确定LAMP阳性反应最佳温度。
1.6 梅花鹿茸与马鹿茸的LAMP 的特异性试验
为检测LAMP反应的特异性，将梅花鹿茸核酸、马鹿茸核酸以及梅花鹿茸与马鹿茸核酸等量混合物作为扩增对象，分别选择马鹿茸LAMP引物及梅花鹿茸LAMP引物进行扩增，检测梅花鹿茸和马鹿茸LAMP引物的特异性。
1.7 LAMP 反应体系的敏感性试验
为确定该方法的敏感性，将提取的质粒原液进行10倍梯度稀释，并对已经建立的反应条件进行定量检测，同时进行普通PCR检测，比较两者的敏感性。
1.8 PCR 扩增体系建立
采用F3和B3为扩增引物进行梅花鹿茸和马鹿茸基因的PCR检测，扩增长度为 199 bp。PCR反应总体积为 25 μL，包括 PCR Master Mix 12.5 μL、引物F3和B3各 1 μL、重 组 质 粒DNA 1 μL，超 纯 水 补 足25 μL。反应条件为94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃最终延伸5 min。PCR产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.9 市售样品真伪的检测
从市售梅花鹿茸和马鹿茸样品提取DNA，以本试验建立的LAMP检测方法，进行真伪检测。
1.10 统计学分析
每个样品至少重复测定3次，取平均值，采用SPSS 16.0对数据进行处理和分析。
2 结果与分析
2.1 LAMP 反应体系建立
使用梅花鹿茸与马鹿茸的特异性引物，进行LAMP试验，管内液体变成黄绿色且浑浊判定为阳性结果。马鹿茸反应体系见图1，梅花鹿茸反应体系见图2。
图1 马鹿茸特异性LAMP引物筛选结果
Fig.1 Screening results of specific LAMP primers for red deer antler
A.马鹿茸的3 种引物扩增曲线；B.马鹿茸3 组引物LAMP 反应体系；1～3 分别为使用3 种LAMP 引物的扩增结果。
图2 梅花鹿茸特异性LAMP引物筛选结果
Fig.2 Screening results of specific LAMP primers for sika deer antler
A.梅花鹿茸的3 种引物扩增曲线；B.梅花鹿茸3 组引物LAMP 反应体系；1～3 分别为使用3 种LAMP 引物的扩增结果。
由图1可知，马鹿茸的1号和2号LAMP引物的扩增产物都出现黄绿色荧光，并且变混浊，且1号引物扩增效果最佳，2号引物有扩增，但扩增效果较1号稍弱，而3号引物基本无产物生成。
由图2可知，梅花鹿茸的3组引物的LAMP结果都出现黄绿色荧光，变混沌，其中3号LAMP引物扩增效果最佳，2号扩增效果较3号稍差，1号引物扩增效果较弱。故后续LAMP试验选用马鹿茸的1号LAMP引物及梅花鹿茸的3号LAMP引物。
2.2 LAMP 扩增体系最佳反应温度的确定
马鹿茸LAMP扩增体系反应温度筛选结果见图3，梅花鹿茸LAMP扩增体系反应温度筛选结果见图4。
图3 马鹿茸不同温度的LAMP扩增结果
Fig.3 LAMP amplification results of red deer antler at different temperatures
A.马鹿茸的不同温度扩增曲线；B.马鹿茸不同温度LAMP 反应体系；1～5.反应温度分别为61、62、63、64、65 ℃；N 为阴性对照。
图4 梅花鹿茸不同温度的LAMP扩增结果
Fig.4 LAMP amplification results of sika deer antler at different temperatures
A.梅花鹿茸的不同温度扩增曲线；B.梅花鹿茸不同温度LAMP 反应体系；1～5.反应温度分别为61、62、63、64、65 ℃；N 为阴性对照。
由图3可知，马鹿茸在61、62、63、64、65 ℃均可以发生扩增反应，各管内均产生黄绿色荧光，产物浑浊，从扩增曲线上看，61 ℃效果最好，因此，后续试验马鹿茸使用61 ℃为扩增温度。
由图4可知，梅花鹿茸在61、62、63、64、65 ℃均可以发生扩增反应，各个温度条件下扩增管内均产生均呈黄绿色荧光，产物浑浊，其中以61 ℃效果最好，且随着温度的增高，产物扩增效率有所下降。后续试验梅花鹿茸使用61 ℃为扩增温度。
2.3 LAMP 的特异性扩增效果试验
梅花鹿茸LAMP特异性扩增试验结果见图5，马鹿茸LAMP特异性扩增试验结果见图6。
图5 梅花鹿茸LAMP特异性扩增实验结果
Fig.5 LAMP specific amplification results of sika deer antler
1.阴性对照；2.马鹿茸与梅花鹿茸混合液为模板的LAMP 反应结果；3.马鹿茸为模板的LAMP 反应结果；4.梅花鹿茸为模板的LAMP 反应结果。
图6 马鹿茸LAMP特异性扩增实验结果
Fig.6 LAMP specific amplification results of red deer antler
1.阴性对照；2.马鹿茸与梅花鹿茸混合液为模板的LAMP 反应结果；3.马鹿茸为模板的LAMP 反应结果；4.梅花鹿茸为模板的LAMP 反应结果。
由图5可知，只有2号反应管与4号反应管基内液体呈黄绿色，浑浊，而1号与3号反应管其内液体为浅黄色，液体澄清，说明使用梅花鹿茸LAMP特异性引物能够扩增出只含有梅花鹿茸核酸以及梅花鹿茸与马鹿茸核酸混合液，而且无交叉反应。
由图6可知，使用梅花鹿茸LAMP特异性扩增引物，只有2号马鹿茸与梅花鹿茸混合液为模板的反应管与3号管马鹿茸为模板的反应管内液体呈黄绿色，浑浊，而1号阴性对照与4号梅花鹿茸为模板的反应管其内液体为浅黄色，液体澄清，说明使用马鹿茸特异性引物能扩增出只含有马鹿茸核酸以及梅花鹿茸与马鹿茸核酸混合液，而且无交叉反应。
2.4 LAMP 扩增敏感性结果
将马鹿茸质粒进行梯度稀释，浓度为1×105、1×104、1×103、1×102、10、1 copies/μL，梅花鹿茸质粒进行梯度稀释，具体如下：2×104、2×103、2×102、20、2 copies/μL，然后分别进行LAMP和PCR的敏感性试验。马鹿茸LAMP和PCR敏感性试验结果见图7，梅花鹿茸敏感性试验结果见图8。其中黄绿色为阳性结果，浅橙色为阴性结果，红色框对应的稀释度为检测出阳性结果的最小稀释度。
图7 马鹿茸LAMP和PCR扩增技术敏感性实验结果
Fig.7 Sensitivity test results of LAMP and PCR amplification techniques for red deer antler
A. LAMP 扩增结果，1～6 为不同稀释倍数的马鹿茸模板；B. PCR 扩增结果。M. marker；a～f. 不同稀释倍数的马鹿茸模板。
图8 梅花鹿茸LAMP和PCR扩增技术敏感性实验结果
Fig.8 Sensitivity test results of LAMP and PCR amplification techniques for sika deer antler
A. LAMP 扩增结果，1～6 为不同稀释倍数的梅花鹿茸模板；B. PCR扩增结果。M. marker；a～f. 不同稀释倍数的梅花鹿茸模板。
由图7A可知，LAMP检测马鹿茸的最低检测值为10 copies/μL，而图7B显示，PCR结果能检测到马鹿茸的最低值为1×104 copies/μL。
由图8可知，梅花鹿茸的LAMP检测最低值为2 copies/μL，而PCR能检测到的最低值为2×103 copies/μL。
2.5 市售样品的检测
采用LAMP反应体系对市售的梅花鹿茸及马鹿茸样品进行检测，结果见图9。
图9 LAMP反应体系鉴定市售马鹿与梅花鹿茸样品的真伪
Fig.9 LAMP reaction system identification of authenticity of commercially available red deer antler and sika deer antler samples
A. 马鹿茸样品LAMP 检测结果；B. 梅花鹿茸样品LAMP 检测结果。1、2 分别为待检样品；N 为阴性对照。
由图9可知，市售的2份梅花鹿茸及马鹿茸LAMP反应管液体均为黄绿色，浑浊，而且对照管内液体呈浅黄色，澄清，购置的梅花鹿茸及马鹿茸均为真品。
3 讨论与结论
本试验首次确立了以梅花鹿茸、马鹿茸线粒体基因序列为目的基因的LAMP检测方法，LAMP检测的关键在于引物设计，本试验针对梅花鹿茸和马鹿茸分别设计了3组引物，比较了LAMP反应结果，并通过试验比较也证实了 LAMP方法的高度特异性。LAMP试验对环境要求低，在中等温度放置40 min即可，结果可直接通过肉眼观察，高效便利，对环境及仪器要求低，且不需开盖检测，减少对环境污染，适用于多种场景进行检测。
LAMP检测方法是一种快速灵敏的检查方法，其能在恒温状态下1 h内对数个拷贝的DNA进行109倍的扩增。本研究利用LAMP方法用于梅花鹿茸和马鹿茸的鉴别。通过优化反应条件，确定了61 ℃、反应时间40 min的最优条件。本项目建立的鹿茸LAMP反应体系具有反应灵敏的特点。LAMP反应检测马鹿茸的最低检测值为10 copies/μL，而PCR技术能检测到马鹿茸的最低检测值为1×104 copies/μL。梅花鹿茸的LAMP检测最低值为2 copies/μL，而PCR技术能检测到马鹿茸的最低检测值为2×103 copies/μL。上述结果，可以看出LAMP的检测的灵敏性要远高于普通PCR。为了验证本研究建立的LAMP检测方法的可靠性与稳定性，分别从市场购置了2份梅花鹿茸及马鹿茸样品，使用LAMP方法进行鉴定。结果显示，该方法成果稳定可靠。同时，也验证本地区销售的动物性中药材的可靠性。
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