2022 年我国蓝莓总产量达52.53万t，位居全球首位[1]。蓝莓富含花青素、糖类、多酚等生物活性物质，每克蓝莓鲜果中的花青素含量高达38.7～48.7 mg[2]，蓝莓花青素可用作食品添加剂、药品或保健品等。蓝莓鲜果加工率约占总产量的45%，加工过程会产生大量的蓝莓皮渣废料。蓝莓花青素主要存在于皮渣中，从蓝莓皮渣中分离提取花青素，可以增加蓝莓的附加值，并且实现废物综合利用。
相关研究报道的蓝莓色素的提取方法存在以下问题。1）原材料昂贵，多使用蓝莓鲜果[3-4]、冻果[5]、果粉[6-7]，少有采用蓝莓皮渣进行提取的[8-9]；2）采用的提取剂甲醇有毒性[10-11]；3）设备和操作成本高，如采用超高压提取法[6，12]、超临界流体萃取法[8，13]、亚临界水提法[14]、超 声 波 辅 助 提 取 法[4，9-10]、微 波 提 取 法[11，15]、酶法[9]，使用传统的溶剂浸提法较易提取蓝莓皮红色素，不需要特殊的设备；操作方式不合理，工业操作多采用多级逆流提取，而实验室研究提供的主要是多级错流提取法[4-5，7]，错流提取法的料液比高、产品浓度低、试剂耗量大、回收成本高；4）提取温度过高[3-5]，没有充分考虑花青素的稳定性和节能等。
蓝莓色素的纯化方法有大孔树脂吸附法[16-18]、层析法[19]、膜分离法[16]。层析法材料昂贵，处理量小，不适宜工业化生产；膜分离法不能有效分离分子量相近的物质，且膜污染也制约其应用。大孔树脂法以成本低、操作简单、使用周期长、可重复利用等特点，广泛应用于工业上分离纯化花青素，文献报道的树脂筛选的范围较窄，达不到优化的效果。
本研究利用安徽怀宁丰富的蓝莓资源，以其周边蓝莓饮料加工厂废弃的蓝莓皮渣为原料，拟解决上述研究存在的问题，尝试开发设计适宜于工业化生产的提取、分离纯化蓝莓花青素的工艺，以期为蓝莓资源的深加工利用提供技术参考。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
蓝莓皮渣：福建康之味食品工业有限公司加工蓝莓饮料的废渣；柠檬酸、磷酸氢二钠、冰乙酸：天津市瑞金特化学品有限公司；氯化钾、无水乙酸钠：天津市光复科技发展有限公司；无水乙醇、盐酸：国药集团化学试剂有限公司；LS-610B、LS-305树脂：陕西蓝深特种树脂有限公司；DM-21树脂：山东鲁抗立科药物化学有限公司；D101树脂：西安蓝晓科技新材料股份有限公司；X-5、AB-8树脂：天津南开大学化工厂；SP-207树脂：日本三菱工业株式会社；XAD-16树脂：罗门哈斯国际贸易（上海）有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
320A/C酸度计：美国梅特勒公司；HY-4A数显调速多用振荡器：金坛市晨玻实验仪器厂；UV-1285紫外可见分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司；TDL-60B低速大容量离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；AR1530分析天平：奥豪斯（上海）有限公司；RE-52A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；LGJ-10C真空冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 提取条件优化
1）提取剂种类的选择
称取100 g蓝莓皮渣，分别使用水、水+0.1%HCl、水+0.2%HCl、50% 乙 醇、50% 乙 醇+0.25% 柠 檬 酸、50%乙醇+2%冰乙酸作为提取剂，料液比1∶1（g/mL），于100 r/min摇床中，振荡浸提24 h后测量上清液中花青素浓度。
2）乙醇浓度的确定
称取100 g蓝莓皮渣，分别采用体积分数为40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇水溶液作为提取剂，料液比1∶1（g/mL），于100 r/min摇床中，振荡浸提24 h后测量上清液中花青素浓度。
3）料液比和提取次数的确定
称取100 g蓝莓皮渣，选用60%乙醇水溶液，分别选择料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8、1∶10（g/mL），于100 r/min摇床中，振荡浸提24 h，在4 000 r/min条件下离心10 min后，倾出上清液，皮渣继续按此料液比浸提，直至无花青素溶出为止，分别测定每次浸提的花青素浓度。不同料液比下第i次浸提得到的花青素质量占提取总质量的百分比为第i次的提取率φi，计算公式如下。
式中：Ci为第i次提取液的浓度，mg/L；Vi为第i次提取液的体积，L；公式中的分子项：Ci×Vi为第i次提取得到的花青素质量，mg；分母项为每次提取得到的花青素累积总和，即提取n次直至无花青素溶出的所提花青素的总质量，mg。
4）提取时间的确定
选用60% 乙醇水溶液，料液比1∶4（g/mL），于100 r/min摇床中，室温下浸提3次，分别在提取时间为1、2、3、4、5、6 h时测量上清液中花青素浓度，首次提取时，提取液浓度不变时的最短时间为最适提取时间。
1.2.2 大孔树脂吸附纯化
1.2.2.1 树脂的预处理
取适量大孔吸附树脂，先用去离子水浸泡清洗，然后用3倍体积的95%乙醇溶液浸泡24 h，用去离子水清洗至无乙醇味，用滤纸吸干表面水分至无水印，用比重瓶法测定树脂的密度，密封保存至双层密封袋中，备用。所用树脂的吸附量计算都以单位体积湿树脂为基准。
1.2.2.2 静态吸附预选树脂
分别将预先称重的8种湿树脂（相当于2 mL湿树脂）和制备好的100 mL初始浓度为212.5 mg/L、pH2.0的蓝莓花青素粗提液（60%乙醇提取后蒸发除去乙醇的溶液）加到三角瓶中。室温下放置于100 r/min摇床上吸附24 h，平衡后，测定吸光度。根据下列公式计算吸附容量（qe，mg/mL）。
式中：Co和Ce分别为初始和平衡的液相浓度，mg/L；Vo为溶液体积，L；v为树脂体积，mL。
1.2.2.3 静态条件下料液pH值对吸附的影响
将预选出的3种树脂（2 mL湿树脂）分别置于100 mL初始浓度为391.3 mg/L的料液中，pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0，室温下于100 r/min摇床上吸附24 h，测定吸光度。
1.2.2.4 动态上柱吸附试验
将湿树脂装到1 cm×50 cm的玻璃柱中，装树脂体积为35 mL，料液浓度为158.4 mg/L，流速为1 BV/h，每10 mL接一管，测定流出液中花青素的浓度，绘制穿透曲线。当流出液浓度为初始料液浓度的5% 时，即为树脂的穿透点；当流出液浓度为初始料液浓度的95%时，即为树脂的饱和点。吸附饱和后，用3～5 BV体积的去离子水冲洗柱子。树脂吸附量（q，mg/mL）计算公式如下[20]。
式中：Ci为初始料液的浓度，mg/L；Ca为流出液的浓度，mg/L；Vs为上样液体积，L；v为湿树脂的体积，mL。
1.2.2.5 动态洗脱试验
将1.2.2.4中上柱吸附达到饱和的3个柱子，用去离子水清洗去除残留在柱中的杂质和料液，然后用60%的乙醇水溶液进行洗脱，流速为1 BV/h，每10 mL接一管，测定每管流出液中花青素浓度，绘制洗脱曲线。
1.2.3 分析方法
1.2.3.1 花青素含量测定
蓝莓皮红色素是花青素类化合物，采用美国官方分析化学师协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）的pH示差法测定，以矢车菊-3-葡萄糖苷计[21]。
1.2.3.2 产品色价的测定
企业中常用色价来标记产品的品质，花青素色价按照GB 1886.244—2016《食品安全国家标准 食品添加剂 紫甘薯色素》[22]的方法测定。
1.3 数据处理
所有测定重复3次，且每个试验至少进行3次。图表中数据均为平均值±标准差。采用单因素方差分析法比较每组试验结果，p＜0.05时认为试验结果有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 提取剂种类及体积分数的确定
提取剂种类对提取液中蓝莓花青素浓度的影响如图1所示。
图1 不同提取剂对蓝莓花青素浓度的影响
Fig.1 Effect of different extraction agents on concentration of blueberry anthocyanins
由图1可知，含乙醇的3种水溶液提取的花青素浓度高于其他提取剂，且含乙醇水溶液提取的上清液清亮，杂质溶出较少，而水及酸性水溶液提取的上清液浑浊，而且提取时皮渣在水中充分溶胀，难以摇动均匀；乙醇水溶液中加入柠檬酸和冰乙酸并不能提高花青素的提取率，这与紫甘薯、萝卜红等色素的提取特性不同，工业上紫甘薯、萝卜红等花青素的粗提取是采用酸性水溶液来提取，蓝莓花青素只能采用乙醇水溶液作为提取剂。
提取剂乙醇水溶液体积分数对提取液中蓝莓花青素浓度的影响如图2所示。
图2 不同体积分数的乙醇水溶液对蓝莓花青素浓度的影响
Fig.2 Effect of ethanol aqueous solution with different volume fractions on concentration of blueberry anthocyanins
由图2可知，60% 乙醇水溶液浸提出的蓝莓花青素浓度最高，根据相似相溶原理，可能是因为60% 乙醇水溶液与蓝莓花青素的极性最相近。
2.2 料液比和提取次数的确定
料液比和提取次数对蓝莓花青素提取率的影响如图3所示。
图3 料液比和提取次数对蓝莓花青素提取率的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio and extraction frequency on extraction yield of blueberry anthocyanins
由图3可知，按照工业化生产总提取率为95%计算，料液比1∶1（g/mL）需要提取5次，料液比1∶2（g/mL）和1∶3（g/mL）均需要提取4次，提取次数过多，操作时间过长，可以不考虑；当料液比大于1∶5（g/mL）时均需要提取2次，虽然提取次数降低，但是消耗的试剂量增加，产品浓度降低。工业化操作通常采用多级逆流提取，既节约试剂消耗量，又增加产品浓度；综合考虑这两方面的原因，采用料液比1∶4（g/mL），逆流提取3次。
2.3 提取时间的确定
提取时间对提取液中蓝莓花青素浓度的影响如图4所示。
图4 提取时间对蓝莓花青素浓度的影响
Fig.4 Effect of extraction time on concentration of blueberry anthocyanins
由图4可知，大约提取4 h就能达到平衡，以4 h为适宜的提取时间。
2.4 树脂的预选
8 种不同树脂的特性参数和吸附能力预筛选结果如表1所示。
表1 树脂的特性和对蓝莓花青素的吸附能力
Table 1 Characteristics of resins used and their adsorption properties on blueberry anthocyanins
树脂种类LS-610B LS-305 DM-21 SP-207 XAD-16 D101 AB-8 X-5极性非极性非极性非极性非极性非极性非极性弱极性非极性比表面积/（m2/g）900～1 000 900～1 000 1 000 600 750 50～530 480～520 500～600孔径/Å 55 60 50～60 110 100 90～100 130～140 290～300吸附量/（mg/mL）5.23±0.03 4.96±0.02 4.34±0.02 4.03±0.03 3.84±0.04 2.94±0.03 2.58±0.03 2.45±0.01
由表1可知，吸附量最高的3种树脂LS-610B、LS-305、DM-21树脂，其次为SP-207、XAD-16树脂，其余3种树脂的吸附量均不高，大致的规律是比表面积越大吸附量越高。从成本和吸附量考虑，后续试验采用前3种树脂：LS-610B、LS-305和DM-21树脂。
2.5 静态条件下pH 值对吸附量的影响
使用预选出的LS-610B、LS-305和DM-21树脂，静态条件下，pH值对树脂吸附量的影响如图5所示。
图5 pH值对LS-610B、LS-305和DM-21树脂吸附蓝莓花青素吸附量的影响
Fig.5 Effect of pH values on adsorption capacities of LS-610B，LS-305，and DM-21 resins to blueberry anthocyanins
由图5可知，LS-305树脂的吸附量对pH值的变化影响较大，pH2.5～3.0时吸附量最大，超过其它两种树脂，DM-21、LS-610B树脂在pH2.0～4.0，变化不大，总体来看3种树脂pH2.5～3.0时吸附量最大，pH5.0时的吸附量最低。考虑到节约用酸量，后续试验均采用pH3.0。
2.6 动态上柱吸附穿透曲线
上柱料液浓度为158.4 mg/L，3种树脂的动态上柱吸附穿透曲线如图6所示，3种树脂的吸附参数如表2所示。
表2 3 种树脂上柱吸附蓝莓花青素的能力比较
Table 2 Comparison of adsorption capacities of three resins in column to blueberry anthocyanins
注：qb 表示达到穿透点时树脂的吸附量；qs 表示达到饱和点时树脂的吸附量；η 表示树脂利用率（qb/qs×100）。
树脂种类DM-21 LS-610B LS-305 qb/（mg/mL 湿树脂）3.80 4.29 4.40 qs/（mg/mL 湿树脂）6.45 6.12 6.58 η/%58.9 70.1 66.9
图6 3种树脂吸附蓝莓花青素的动态穿透曲线
Fig.6 Dynamic breakthrough curves of blueberry anthocyanin absorption by three resins
由表2可知，LS-305树脂到达穿透点和饱和点时的吸附量都最大，LS-610B树脂达到穿透点时树脂的利用率最高，DM-21达到穿透点时的吸附量和树脂的利用率都最低。后续试验采用LS-305和LS-610B两种树脂。
2.7 上柱吸附后的洗脱曲线
LS-305和LS-610B两种吸附饱和的树脂的洗脱曲线如图7所示。
图7 LS-305和LS-610B树脂在1 BV/h流速下的动态洗脱曲线
Fig.7 Dynamic elution curves of LS-305 and LS-610B resins at a flow rate of 1 BV/h
由图7可知，LS-305树脂的洗脱峰陡，需要的洗脱液体积少，LS-610B树脂洗脱峰低，而且有很明显的拖尾现象。LS-305树脂解吸率高，为90.4%，LS-610B树脂的解吸率低，为86.7%，解吸后明显看出树脂颜色比吸附前要深。后续试验只采用LS-305树脂。乙醇是工业上广泛使用的天然色素洗脱剂，常用的浓度在50%～70%。通常洗脱剂浓度与色素的极性接近时，容易洗脱下来；水的含量越大，洗脱剂的极性越大，得到的产品水溶性越好，但是因为含水比例的增加，蒸发去除乙醇的过程中，沸点会升高，能耗增加；乙醇浓度越高，洗脱剂的极性减少，得到的产品水溶性会差一些，而且耗费乙醇的量会增加，结合工厂的实践经验，综合考虑采用60%的乙醇水溶液作洗脱剂。
2.8 不同制备方法得到的色素产品性能
将蓝莓皮用乙醇提取浓缩、干燥得到的产品与浓缩去除乙醇然后上柱吸附纯化得到的产品进行比较，结果如表3所示。
表3 不同制备方法得到的固体产品性能比较
Table 3 Comparison of solid product characteristics prepared by different technologies
制备方法乙醇提取浓缩烘干乙醇提取浓缩上柱产品色价18.71±0.32 77.24±1.53收率/（g 色素/100 g 湿皮）15.3±0.6 2.8±0.1花青素含量/（mg/g）43.56±1.27 245.74±4.67
由表3可知，乙醇提取后上柱纯化得到的色素产品色价比吸附前提高了3.1倍，花青素含量提高了4.6倍，收率（g色素/100 g湿皮）降低了4.5倍。实际工业化生产中，可根据客户需要调整制备方法，如需要色价18以下的产品，采用乙醇提取浓缩烘干工艺即可；如果需要高色价的产品，就需要采用吸附柱进行纯化，柠檬酸是产品的调酸剂，糊精常用来做色素载体，不同色价产品可以通过调整不同工艺得到的产品比例、添加柠檬酸、糊精载体等方法进行调配，以使生产成本最低化。
设计的工业化生产工艺如图8所示。
图8 蓝莓皮渣提取色素的工业化工艺流程
Fig.8 Industrial process flowchart for extracting pigments from blueberry peel residues
3 结论
从蓝莓皮渣中提取花青素，最佳提取剂为60%乙醇水溶液，料液比1∶4（g/mL），采用三级逆流提取，每次提取时间为4 h；对提取液进行浓缩蒸发去除乙醇，然后采用树脂进行吸附纯化，最优树脂是LS-305，上柱操作流速为1.0 BV/h，达到穿透点时停止操作，洗脱剂为60% 的乙醇水溶液，流速1 BV/h，洗脱剂使用量为3倍柱体积，工业上可采用真空降膜浓缩蒸发，然后喷雾干燥；根据客户对不同色价产品的需要，工业化生产可以通过调整生产工艺，如需要色价18以下的产品，采用乙醇提取浓缩烘干工艺即可；如果需要高色价的产品，就需要采用吸附柱进行纯化，不同色价产品可以通过调整不同工艺得到的产品比例、添加柠檬酸、糊精载体等方法调配出消费者需要的不同色价的产品。
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