鲍鱼素有“海味之冠”称号，是海产“八珍”之一，其通体是宝，其中被视为废弃物的内脏中均含有丰富的有机物和生物活性化合物，如蛋白质、多肽、矿物质、维生素和抗氧化物等[1-2]。回收加工鲍鱼内脏不仅可以有效减轻环境负荷、降低水体污染风险，还能为医药、保健品和食品添加剂等领域提供有价值的原料[3-4]。已有研究发现鲍鱼内脏中含有丰富的β-葡萄糖苷酶，该酶在食品工业、生物燃料、农业饲料和环境监测等领域具有广泛应用潜力[5-7]。从海洋生物体内分离纯化蛋白酶的常规性方法一般有沉淀法、盐析法等[8-10]，这些方法存在操作复杂、生产周期长、提取效率低等问题，不利于工厂化生产。因此，寻找一条便捷、高效、环保的分离纯化技术路线具有较高的应用价值。
双水相萃取技术在生物分离和提取方面具有许多优势，如操作简单、成本低廉、条件温和、保持物质活性等[11-13]。但常规性双水相萃取一般采用一次萃取，但纯化效果往往不太理想，若通过对一次萃取液进行双水相二次萃取[14]，虽能有效提升其杂蛋白清除能力，但依旧存在目标蛋白纯化率不高的问题。壳聚糖是一种天然的阳离子聚合物，具有良好的生物相容性和生物可降解性[15]。壳聚糖絮凝沉淀法因沉淀目标蛋白质效率高、用量少、安全无毒等特点也常被用来分离纯化酶[16-18]。本研究将双水相萃取法和壳聚糖絮凝沉淀法相结合，构建出一条分离纯化鲍鱼内脏中β-葡萄糖苷酶的技术路线，并通过一种专用于双水相体系优化方法和响应面优化法对该路线进行条件优化，以期为分离纯化海洋生物体内活性蛋白提供一个新的分离纯化思路和科学研究依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲍鱼内脏（皱纹盘鲍）：市售；磷酸氢二钠、柠檬酸、乙酸、壳聚糖、乙酸钠、聚乙二醇600、1000、2000：国药集团化学试剂有限公司；β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-GC）活性检测试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂：北京索莱宝科技有限公司。以上所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
A25S均质乳化机：上海欧河机械设备有限公司；3-18K高速冷冻离心机：德国SIGMA公司；MM400组织研磨仪：德国Retsch公司；VORTEX Genius 3涡旋振荡仪：艾卡（广州）仪器设备有限公司；Epoch 2全波段酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；TS-1000脱水摇床：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；D 24UV超纯水机：默克密理博公司；BSA 2202S电子天平：德国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 粗酶液的制取
取适量-20 ℃预冷后的鲍鱼内脏置于烧杯中，以1∶4的质量比加入4 ℃预冷的醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH5.0）中，在冰浴中使用均质乳化机对鲍鱼内脏进行短暂多次破碎，待组织完全粉碎后，冰浴浸提1 h，取浸提液，4 ℃下10 000 r/min离心15 min，取上清液即为粗酶液，-20 ℃保存待用。
1.3.2 酶活力和蛋白浓度的测定
酶活标准曲线的绘制：将5 μmol/mL标准液稀释至0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/mL标准液待测，每组浓度稀释3管，测定OD403 nm后取平均值，得到酶活标准曲线回归方程y=0.003 4x+0.059 0（R2=0.999 7），式中y代表样品的OD403 nm值，x代表标准液浓度。
样品酶活测定：酶活采用对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，p-NPG）比色法测定，将样品稀释一定倍数后，将100 μL样品与1 mL p-NPG混匀，水浴催化反应10 min后，测定样品403 nm的吸光度，重复3次取平均值，通过标准曲线拟合公式计算样品酶活。
蛋白标准曲线的绘制：用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释液配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）标准溶液，每个浓度各3管，各取20 μL分别加入至96孔板后与200 μL G-250染色液反应后，测定OD595 nm后取平均值，得到蛋白标准曲线回归方程y=2.733 4x+0.633 6（R2=0.999 0），式中y代表样品的OD595 nm值，x代表标准液浓度。
样品蛋白含量的测定：将样品稀释至标准曲线有效范围后，加入200 μL G-250染色液充分混匀并静止反应10 min，在595 nm的波长下测量待测样品的吸光值，重复3次，取平均值并记录数值。根据蛋白标准曲线的方程，即可计算出样品中蛋白质的浓度。
试验过程中其他相关参数计算公式如下。
式中：Da（b）为上（下）相酶比活，U/mg；Ua（b）为上（下）相酶活，U；Ca（b）为上（下）相蛋白浓度，mg/mL；PF1为纯化倍数；PF2为总纯化倍数；D1为每步处理前样品酶比活，U/mg；D2为每步处理后样品酶比活，U/mg；D0为初始粗酶液酶比活，U/mg。
1.3.3 双水相相图的绘制
常用的聚合物-盐双水相萃取体系因相与相间存在的低黏度与高密度差，具有分离快、易回收、传质快等优势。其中常用的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）分子量种类有600、1000、1500、2000、4000[19-20]。相关研究结果显示，聚合物-盐双水相萃取体系萃取β-葡萄糖苷酶存在一定规律，即PEG分子量越大，该酶更易分配于下相，萃取效果更好[21]。反之PEG分子量越小，该酶更易富集于上相。为提高经济效益和减少操作时间对酶降解的影响，在第一次双水相萃取中采用使目标物富集于上相，杂质富集于下相的策略，固选取PEG600作为聚合物相。在PEG/盐体系中，常用的盐有NaH2PO4、（NH4）2SO4、K2HPO4、柠檬酸钠等。由于大多数生物所产生的β-葡萄糖苷酶最适pH值为4～6，故从酸性盐中选取组成体系的种类。相关研究结果显示NaH2PO4、（NH4）2SO4、柠檬酸钠提取该酶的效果较好，故选择以上3种盐作为双水相萃取体系的盐相种类进行筛选。综上，以PEG600与NaH2PO4、（NH4）2SO4、柠檬酸钠3种盐绘制相图。由于体系温度会影响酶的分配情况，因此，控制试验体系温度为25 ℃、pH自然。相图的制作采用浊点法[22]。
1.3.4 双水相体系的构建及优化方法
参考文献[22]方法，固定双水相第一次萃取体系总质量为10 g，其中粗酶液样品添加量为1 g，pH自然，温度为25 ℃。体系优化方法采用“52×3双水相试验法”[23]，确定双水相体系中最优的PEG质量分数、盐种类及盐质量分数。“52”临界成相点的测定：以PEG600/盐相图的双节线为基础，选取中心位置的PEG600质量分数（纵轴）的5个相邻点临界成相点为起点，并固定每个点的PEG600的质量分数，按固定的比例增加盐的质量分数（横轴），分别进行5个点试验，确定每组酶比活最高的点。三点验证对比与验证：从上述“52”成相临界点试验中补充选取每组酶比活最高点的左右两点，共3点进行验证性试验，三点从左到右，若第一点或第二点为最佳，即最高点为该体系中的最佳点；如果第三点为最佳点，则需要以一定间隔继续增加盐的质量分数，使得第一个点保持最高，这样才能确定酶比活最佳点，即为稳定后的第一个点。对上述“52×3双水相试验法”每组选取出的5个最佳点同时进行试验比较，可得到最优双水相体系PEG600/盐种类与对应质量分数组成。
1.3.4.1 双水相第一次萃取体系的构建
双水相第一次萃取旨在将目标产物富集于上相，黄酮、核酸等杂质集中至下相。在β-葡萄糖苷酶富集于上相能力方面，硫酸盐体系＞柠檬酸盐体系＞磷酸盐体系[21]，故选PEG600/（NH4）2SO4作为双水相一次萃取体系的构建。根据PEG600/（NH4）2SO4相图中双节线上方中心区域间隔2%，从16% PEG600开始，依次选取5个PEG600质量分数为固定点，并以该PEG600双节线上成相临界点的（NH4）2SO4质量分数为起点，依次递增2%作为盐相质量分数的构成。以10 g为体系总质量，在15 mL离心管中加入1 g的粗酶液与相应质量分数的PEG600、（NH4）2SO4与超纯水，通过涡旋振荡仪充分溶解混匀，冰浴静止10 min后，4 ℃下5 000 r/min离心3 min，取上相100 μL，通过测定对应酶活力和蛋白含量，计算上相的酶比活和纯化倍数。
1.3.4.2 双水相第二次萃取体系的构建
进行双水相第二次萃取的目的是将目标产物富集于下相，黄酮、核酸等杂质集中至上相。研究表明，NaH2PO4使目标蛋白富集于下相的效果最佳，故回收双水相第一次萃取后的上相，加入一定质量分数的NaH2PO4粉末，形成双水相第二次萃取体系[21]。根据双水相一次萃取最佳萃取体系的PEG600质量分数，在PEG600/NaH2PO4相图中双节线上方中心区域，以横轴间隔2%递增选取5个点，作为双水相二次萃取体系的NaH2PO4质量分数构成。取5 g双水相一次萃取后的上相，加入10 mL离心管中，根据上述选取的5个点，计算加入NaH2PO4粉末质量，使得NaH2PO4质量分数与上述选取的5个点一致。通过涡旋振荡仪使粉末充分溶解混匀后，冰浴静止萃取10 min后，4 ℃下5 000 r/min离心3 min，测定对应酶活力和蛋白含量，计算下相的酶比活和纯化倍数。
1.3.5 壳聚糖絮凝沉淀单因素试验
取上述双水相体系第一次萃取上相或第二次萃取下相0.5 mL于1.5 mL离心管中，加入一定量的5 mg/mL壳聚糖的醋酸溶液，涡旋振荡5 min使其充分混匀后，用0.1 mol/L的盐酸和0.1 mol/L的NaOH调节pH值至定值，于组织研磨仪中振荡20 min，4 ℃下7 000 r/min离心10 min，弃去上清液，得到壳聚糖-β-葡萄糖苷酶复合物，将复合物溶于4 mL的乙酸-乙酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH3.8）中，涡旋振荡30 min，使壳聚糖-β-葡萄糖苷酶复合物解离，4 ℃下7 000 r/min离心10 min，上清液即为β-葡萄糖苷酶溶液。考察壳聚糖添加量、复合时pH值、振荡时间对β-葡萄糖苷酶纯化倍数的影响。其中单因素试验中壳聚糖添加量分别选取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，复合时pH值分别选取5.0、5.4、5.8、6.2、6.6，振荡时间分别选取15、20、25、30、35 min。
1.3.6 响应面优化试验
以双水相第二次萃取下相为原料，选取壳聚糖添加量、振荡时间和复合时pH值3个因素，通过单因素试验筛选出各因素的3个较优水平，以纯化倍数为响应值，进行响应面优化试验，以获得壳聚糖絮凝沉淀的最佳工艺条件。试验因素和水平设计见表1。
表1 响应面试验的因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface design
水平-1因素0 1 A 壳聚糖添加量/（mg/mL）0.5 1.0 1.5 B 振荡时间/min 20 25 30 C 复合时pH 值5.4 5.8 6.2
1.3.7 不同分离纯化策略的比较
分别设计6种不同的分离纯化策略，以比较本研究探索的最佳工艺路线的分离纯化效果。策略Ⅰ为盐析法[24]；策略Ⅱ为双水相一次萃取最优体系；策略Ⅲ为壳聚糖絮凝沉淀法（最优条件参数）；策略Ⅳ为双水相二次萃取最优体系；策略Ⅴ为双水相一次萃取联用壳聚糖沉淀；策略Ⅵ为双水相二次萃取最优体系联用壳聚糖沉淀。
1.4 数据处理与分析
使用WPS office软件处理数据；使用Origin 2021软件和Adobe Photoshop 2020进行绘图；利用Design-Expert 12软件 Box-Behnken设计响应面试验并对结果进行分析。
2 结果与分析
2.1 相图
PEG600与NaH2PO4、（NH4）2SO4、柠檬酸钠的相图见图1。
图1 PEG600与3种盐的双水相相图（25 ℃）
Fig.1 Aqueous two-phase diagram of PEG600 with three salts（25 ℃）
根据相图可知该体系的最低分相浓度，选取双节线上方区域作为PEG600和盐质量分数变量的参考基线。由图1可知，本研究分别选取PEG600浓度为质量分数10%～26%、NaH2PO4浓度为质量分数8%～26%、（NH4）2SO4浓度为质量分数8%～20%、柠檬酸钠浓度为质量分数12%～20%优化成相物质的质量分数。
2.2 双水相第一次萃取体系的优化
在图1中PEG600双节线临界点附近选取质量分数2% 间隔相邻的5个点，以及质量分数间隔2% 的（NH4）2SO4的5个点，取1 mL粗酶液，补水至10 g总体系，进行3次平行试验，测定成相体系下相酶比活，PEG600/（NH4）2SO4双水相萃取临界体系见表2。固定PEG600质量分数不变，通过单因素试验得PEG600/（NH4）2SO4三点验证见图2。
图2 PEG600/（NH4）2SO4三点验证
Fig.2 Three-point validation diagram of PEG600/（NH4）2SO4
表2 PEG600/（NH4）2SO4 双水相萃取临界体系
Table 2 Aqueous two-phase extraction critical system of PEG600/（NH4）2SO4
注：-为不成相；+为成相并选取该体系进行试验；*为上相酶比活最高点。
PEG600 质量分数/%16 18 20 22 24（NH4）2SO4 质量分数/%12 16 18 20---+*14-+*+*+* +++* ++++++++++++++
由表2可知，最佳体系出现在成相临界点附近，从表中结果选取最优体系点即上相酶比活最高点，进行三点验证试验。由图2可知，获得第一次萃取的最佳双水相系统组成为质量分数为18% 的PEG600及14%的（NH4）2SO4；测定体系pH值为5.0（自然），此时上相酶比活为1.2 U/mg，纯化倍数为5.8。当固定PEG600的质量分数后，随着（NH4）2SO4的质量分数的增加，上相酶比活在第一点和第二点出现峰值，随后逐渐下降。
2.3 双水相第二次萃取体系的优化
选取质量分数为18% 的PEG600与质量分数间隔2%的NaH2PO4的5个点，取5 g双水相一次萃取后的上相，根据选取的5个点，计算加入NaH2PO4粉末的质量，补水至10 g总体系，进行3次平行试验，测定成相体系下相酶比活和总纯化倍数，18% PEG600/NaH2PO4双水相萃取临界体系见表3，双水相二次萃取体系三点验证见图3。
图3 双水相二次萃取体系三点验证
Fig.3 Three-point verification of aqueous two-phase secondary extraction system
表3 18% PEG600/NaH2PO4 双水相萃取临界体系
Table 3 Aqueous two-phase extraction critical system of 18%PEG600/NaH2PO4
注：-为不成相；+为成相并选取该体系进行试验；*为上相酶比活最高点。
PEG600 质量分数/%18 NaH2PO4 质量分数/%12-14-16+*18+20+
由表3与图3可知，双水相第二次萃取最佳萃取体系为在第一次萃取后的上相溶液中加入NaH2PO4粉末至总体系质量分数的17%；体系pH值为5.0（自然）。此时下相酶比活达到1.58 U/mg，总纯化倍数为7.9。相比于第一次双水相萃取，酶比活提高了0.38 U/mg，纯化倍数提高了2.1。
2.4 壳聚糖絮凝沉淀的条件优化
2.4.1 壳聚糖添加量的影响
探究壳聚糖添加量对β-葡萄糖苷酶纯化倍数的影响，结果如图4所示。
图4 壳聚糖添加量对纯化倍数的影响
Fig.4 Effect of chitosan addition on purification multiple
由图4可知，随着壳聚糖添加量的增加，纯化倍数先增大后减小，当壳聚糖添加量为1.0 mg/mL时，下相溶液纯化倍数达到最大值，继续增大壳聚糖添加量，纯化倍数下降。原因可能是壳聚糖添加量增加时，壳聚糖-β-葡萄糖苷酶复合物的稳定性增强，两者解离困难，造成纯化倍数下降，并且壳聚糖添加量增大时，除与β-葡萄糖苷酶结合以外，还会吸附杂蛋白，从而使得β-葡萄糖苷酶纯度降低，而壳聚糖用量过大，不仅会造成浪费，还影响后续除去壳聚糖，达不到提纯的目的，综合考虑，选定壳聚糖添加量0.5、1.0、1.5 mg/mL为下相溶液进行后续试验。
2.4.2 复合时pH值的影响
复合时pH值对纯化倍数的影响见图5。
图5 复合时pH值对纯化倍数的影响
Fig.5 Effect of pH during complexation on purification multiple
由图5可知，当复合pH值由5.0增大到5.8时，纯化倍数迅速增加至最大值5.6，原因是β-葡萄糖苷酶的存在影响了壳聚糖的溶解度，两者在一定pH值下才会复合形成沉淀。而随着复合pH值继续增大，越来越接近壳聚糖的解离常数（pKa），使得壳聚糖溶解度下降，壳聚糖与β-葡萄糖苷酶结合程度随之降低，从而造成纯化倍数下降。综合考虑，选定复合pH值为5.4、5.8、6.2进行后续试验。
2.4.3 振荡时间的影响
振荡时间对纯化倍数的影响见图6。
图6 振荡时间对纯化倍数的影响
Fig.6 Effect of shaking time on purification multiple
由图6可知，振荡时间在10～30 min时，纯化倍数随着振荡时间的延长逐渐增大，振荡时间为25 min时出现最大值（4.9），随后呈现略微下降的趋势，其原因可能是随着振荡时间的延长，壳聚糖与β-葡萄糖苷酶的结合程度已达饱和，故不能进一步增加其纯度，同时若操作时间过长也易导致酶发生降解，减弱酶活力。因此，选择壳聚糖絮凝有效振荡时间为20、25、30 min进行后续试验。
2.4.4 响应面优化试验结果及分析
通过单因素试验结果，确定壳聚糖添加量、振荡时间和复合时pH值为β-葡萄糖苷酶纯化效果的显著影响因素，进一步采用响应面优化方法判断各因素对纯化倍数的影响。设定A（壳聚糖添加量）、B（振荡时间）、C（复合时pH值）为自变量，纯化倍数为响应值，进行三因素三水平的响应面试验设计，结果见表4。
表4 响应面优化结果
Table 4 Response surface optimization results
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 A 壳聚糖添加量/（mg/mL）0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 B 振荡时间/min 20 20 30 30 25 25 25 25 20 30 20 30 25 25 25 25 25 C 复合时pH 值5.8 5.8 5.8 5.8 5.4 5.4 6.2 6.2 5.4 5.4 6.2 6.2 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8纯化倍数4.23 4.37 5.18 5.35 4.24 4.45 4.39 4.32 3.82 4.81 4.10 4.72 5.08 5.01 5.08 5.09 5.04
根据表4的试验结果，通过Design-Expert 12软件处理数据进行回归拟合，得到的二次多项式回归方程：Y=5.06+0.056 25A+0.442 5B+0.026 25C+0.007 5AB-0.07AC-0.092 5BC-0.145A2-0.132 5B2-0.565C2。为检验方程有效性，对结果进行方差分析，结果见表5。
表5 回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance of regression model
注：**表示影响极显著（P＜0.01）；*表示影响显著（P＜0.05）。
方差来源模型自由度A B C A B AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总离差平方和3.25 0.025 3 1.57 0.005 5 0.000 2 0.019 6 0.034 2 0.088 5 0.073 9 1.34 0.024 6 0.020 0 0.004 6 373.00 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 7均方0.361 1 0.025 3 1.57 0.005 5 0.000 2 0.019 6 0.034 2 0.088 5 0.073 9 1.34 0.003 5 0.006 7 0.001 1 F 值102.64 7.20 445.29 1.57 0.064 0 5.57 9.73 25.16 21.01 382.08 P 值＜0.000 1**0.0314*＜0.000 1**0.250 8 0.807 6 0.050 0*0.016 9*0.001 5**0.002 5**＜0.000 1**5.80 0.061 2
由表5可知，该回归模型的F=102.64，P值＜0.000 1，表明该试验获得的回归方差模型极显著，相关系数R2=0.992 5，说明回归方程的预测值与试验值存在较高的相关性，失拟项P值=0.061 2＞0.05，为不显著，也表明模型的拟合度高。方差分析的结果显示，B、A2、B2和C2对β-葡萄糖苷酶的纯化倍数有极显著的影响，A、BC、AC为显著影响因素，而C、AB影响均不显著。由F值可推断，影响壳聚糖絮凝沉淀效果的3个因素强弱依次为振荡时间（B）＞壳聚糖添加量（A）＞复合时pH值（C）。
通过Design-Expert 12软件处理数据得到响应面图7～图9。
图7 壳聚糖添加量与振荡时间对纯化倍数的影响
Fig.7 Effects of chitosan addition and shaking time on purification multiple
由图7可知，随着壳聚糖添加量的增加和振荡时间的延长，纯化倍数的提升较小，由此可知壳聚糖添加量和振荡时间的交互作用不显著。由图8可知，随壳聚糖添加量和复合时pH值的增加，对纯化倍数有所提高，两者交互作用较为显著。由图9可知，曲线曲率较大，故振荡时间与复合时pH值对纯化倍数的影响的交互作用较为显著。
图8 壳聚糖添加量与复合时pH值对纯化倍数的影响
Fig.8 Effects of chitosan addition and pH on purification multiple
图9 振荡时间与复合时pH值对纯化倍数的影响
Fig.9 Effects of shaking time and pH on purification multiple
根据响应面试验结果得到壳聚糖絮凝沉淀最佳的工艺条件为壳聚糖添加量（A）1.5 mg/mL、振荡时间（B）30 min和复合时pH值（C）5.8，预测的最大纯化倍数为5.29，为检验模型预测的准确性，按上述各条件进行平行试验3次，纯化倍数平均值为5.32，其试验结果与预测值相近，说明此模型可靠，响应面优化结果正确。
2.4.5 不同分离纯化策略的对比分析
根据上述试验结果，分别确定各项分离纯化策略的条件参数。策略Ⅰ—盐析法[24]：10 mL粗酶液中，加入质量分数60% 的硫酸铵，盐析pH5.5，静止时间12 h。策略Ⅱ—双水相一次萃取最优体系：将1 mL粗酶液加入至质量分数18% 的PEG600和14% 的（NH4）2SO4构成的10 mL萃取体系中，体系pH值为5.0（自然）。策略Ⅲ—壳聚糖沉淀法（最优条件参数）：取1 mL粗酶液，设置壳聚糖添加量为1.5 mg/mL，振荡时间30 min，pH5.8。策略Ⅳ—双水相二次萃取最优体系：使用策略Ⅱ中方法后，取其上相，追加二次萃取，即在第一次萃取后的上相溶液中入NaH2PO4粉末至总体系质量分数的17%。策略Ⅴ—双水相一次萃取联用壳聚糖沉淀：使用策略Ⅱ后，取上相1 mL，按策略Ⅲ进行壳聚糖絮凝沉淀操作。策略Ⅵ—双水相二次萃取最优体系联用壳聚糖沉淀：先采用策略Ⅳ后，取二次萃取的下相进行策略Ⅲ的壳聚糖絮凝沉淀操作。
在pH自然和室温条件下，采用不同的分离纯化策略所得结果如图10所示。
图10 不同分离纯化策略纯化效果
Fig.10 Purification effects of different separation and purification strategies
I.盐析法；Ⅱ.双水相一次萃取最优体系；Ⅲ.壳聚糖沉淀法（最优条件参数）；Ⅳ.双水相二次萃取最优体系；Ⅴ.双水相一次萃取联用壳聚糖沉淀；VI.双水相二次萃取最优体系联用壳聚糖沉淀。
由图10可知，采用盐析法纯化β-葡萄糖苷酶效果较差，总纯化倍数仅为3，酶比活为0.3 U/mg。而采用双水相一次萃取或壳聚糖沉淀法提取β-葡萄糖苷酶，相比盐析法有所提升，但提升效果仍然不高，其总纯化倍数分别提高至5.0和4.9，酶比活分别达到了1.00 U/mg和0.98 U/mg。双水相二次萃取提升幅度较大，总纯化倍数可达8.5，酶比活达到了1.58 U/mg。双水相一次萃取联用壳聚糖沉淀提升幅度增大，其总纯化倍数达到了24.0，酶比活为5 U/mg。而采用双水相二次萃取联用壳聚糖沉淀最佳工艺路线，最大限度的提升了β-葡萄糖苷酶的纯化效果，最终总纯化倍数可达42.2，酶比活达到8.4 U/mg。
3 结论
多数自然生物来源的β-葡萄糖苷酶的pH值一般在3.5～5.5的酸性范围之间[25]。以该原则为基础，通过能形成酸性环境条件的双水相体系与壳聚糖沉淀两种方法的联用，建立了一条高效便捷且快速的分离纯化海洋源生物（鲍鱼）内脏中β-葡萄糖苷酶的技术路线。通过目标酶在双水相萃取过程中分配行为规律的探究，提出了双水相二次萃取的思路，并最终选择进行二次双水相萃取结合壳聚糖絮凝沉淀法分离纯化鲍鱼内脏中的β-葡萄糖苷酶。本研究考察了第一次和第二次双水相萃取体系中成相物质的组成及对应的质量分数比例，以及壳聚糖添加量、复合时pH值、振荡时间对目标酶纯化效果的影响，得到了纯化该酶的最佳工艺路线及技术参数。研究表明第一次最佳双水相系统组成为质量分数为18%的PEG600、质量分数为14%的（NH4）2SO4；第二次双水相最佳萃取体系组成为取一次萃取中上相溶液，加入NaH2PO4盐溶液，使二次双水相体系盐的质量分数为17%，两次体系pH值均为5.0（自然）。壳聚糖絮凝沉淀最优工艺条件为壳聚糖添加量1.5 mg/mL，振荡时间30 min，pH5.8。在此条件下，β-葡萄糖苷酶的最终总纯化倍数相比可达42.2，酶比活达到8.4 U/mg。试验结果表明该分离纯化方法路线具有一定的优越性，能大大提升分离纯化效率，同时对分离纯化介质实现最大化利用，节能环保。在后续的试验探究中，将开发新双水相体系组成类型，如离子液体[26]、深共晶溶剂等，以提升双水相体系对目标提取物的特异性，同时探究该技术路线与其他常规分离纯化技术路线的效能比较，为该技术路线可广泛运用于分离纯化海洋生物酶的可行性提供更多的科学依据和应用场景。
[1] CHUNG W H, COOREY R, TAKECHI R, et al. Compositional and nutritional evaluation of viscera from commercially harvested wildcaught Australian abalones (Haliotis spp.)[J]. LWT-Food Science and Technology, 2024, 191: 115590.
[2] YAMANUSHI M, SHIMURA M, NAGAI H, et al. Antihypertensive effects of abalone viscera fermented with Lactiplantibacillus pentosus SN001 via angiotensin-converting enzyme inhibition[J]. Food Chemistry: X, 2022, 13: 100239.
[3] NI J, YANG Z, ZHANG Y, et al. Aaqueous exposure to silver nanoparticles synthesized by abalone viscera hydrolysates promotes the growth, immunity and gut health of zebrafish (Danio rerio)[J].Frontiers in Microbiology, 2022, 13: 1048216.
[4] 陈敏, 高广春, 田新朋, 等. 皱纹盘鲍内脏抗氧化肽的制备及活性分析[J]. 食品科技, 2022, 47(6): 159-166.CHEN Min, GAO Guangchun, TIAN Xinpeng, et al. Antioxidant peptides from Haliotis discus viscera: Preparation and in vitro activity evaluation[J]. Food Science and Technology, 2022, 47(6): 159-166.
[5] NI J, REN L R, MA Y, et al. Selenium nanoparticles coated with polysaccharide-protein complexes from abalone viscera improve growth and enhance resistance to diseases and hypoxic stress in juvenile Nile tilapia (Oreochromis niloticus)[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2023, 134: 108624.
[6] 陈小艺. 鲍鱼内脏天然活性物质的提取分离研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2018.CHEN Xiaoyi. Study on extraction and separation of natural active substances from abalone viscera[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2018.
[7] 付丽丽, 那日, 郭久峰, 等. 双水相萃取纯化钝顶螺旋藻藻蓝蛋白技术探讨[J]. 食品科技, 2015, 40(10): 193-196.FU Lili, NA Ri, GUO Jiufeng, et al. Aqueous two-phase extraction and purification of c-phycocyanin from Spirulina platensis[J]. Food Science and Technology, 2015, 40(10): 193-196.
[8] 陈胜军, 刘先进, 杨贤庆, 等. 酶法提取鲍鱼内脏多糖工艺的优化[J]. 南方农业学报, 2018, 49(7): 1389-1395.CHEN Shengjun, LIU Xianjin, YANG Xianqing, et al. Optimization of enzymatic extraction of visceral polysaccharide from abalone[J]. Journal of Southern Agriculture, 2018, 49(7): 1389-1395.
[9] 陈胜男, 张利, 石贤爱, 等. 鲍鱼内脏β-葡萄糖苷酶中试规模制备研究[J]. 福州大学学报(自然科学版), 2017, 45(5): 731-735, 741.CHEN Shengnan, ZHANG Li, SHI Xian′ai, et al. Study on the pilotplant scale preparation of β-glucosidase from abalone viscera[J].Journal of Fuzhou University (Natural Science Edition), 2017, 45(5): 731-735, 741.
[10] ZHANG X X, XIE J H, YAN M L, et al. Extraction of lutein by aqueous two-phase system including both cholinium and imidazolium-based ionic liquids from wet microalgae[J]. Algal Research,2024, 77: 103369.
[11] MADHUSUDHAN M C, AMRUTHA N, RANI A, et al. Aqueous two-phase extraction in downstream processing[J]. Current Biochemical Engineering, 2015, 2(1): 39-48.
[12] KANG S M, TARK D, SONG B M, et al. Evaluation of antiviral effect against SARS-CoV-2 propagation by crude polysaccharides from seaweed and abalone viscera in vitro[J]. Marine Drugs, 2022,20(5): 296.
[13] LU X X, WANG B Y, ZOU L. New aqueous two-phase system formed by piperazinium-based surface-active ionic liquid for extraction of dyes[J]. Journal of Molecular Liquids, 2024, 396: 124075.
[14] 朱恒伟, 白新鹏, 梁秋杨, 等. 多级双水相萃取木瓜蛋白酶的研究[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(4): 152-156.ZHU Hengwei, BAI Xinpeng, LIANG Qiuyang, et al. Study on multistage aqueous two-phase extraction of papain[J]. Food and Fermentation Industries, 2024, 50(4): 152-156.
[15] 史先鑫, 赵传成, 孟浩, 等. 超声波结合絮凝沉淀法制备酸枣提取物及其卷烟应用[J]. 广东化工, 2022, 49(12): 45-48.SHI Xianxin, ZHAO Chuancheng, MENG Hao, et al. Preparation of jujube extract with ultrasonic combine flocculation process and its application to cigarette[J]. Guangdong Chemical Industry, 2022, 49(12): 45-48.
[16] 董娜, 董文宾, 田颖. 双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合分离猪胃蛋白酶[J]. 食品科技, 2011, 36(1): 26-29.DONG Na, DONG Wenbin, TIAN Ying. Aqueous two-phase extraction and chitosan precipitation combination for swine pepsin isolation[J]. Food Science and Technology, 2011, 36(1): 26-29.
[17] 郭振华, 杨帆, 刘中桃, 等. 壳聚糖絮凝剂的研究与应用[C]//2016 中国环境科学学会学术年会论文集(第二卷). 海口: 中国环境科学学会, 2016: 1723-1726.GUO Zhenhua, YANG Fan, LIU Zhongtao, et al. Research and application of chitosan flocculant[C]//Proceedings of the 2016 Annual Academic Conference of Chinese Society for Environmental Sciences (Volume 2). Haikou: Chinese Society for Environmental Sciences, 2016: 1723-1726.
[18] 张永斌. 壳聚糖絮凝沉淀法在健脾运化合剂除杂工艺中的应用研究[J]. 西部中医药, 2021, 34(11): 80-82.ZHANG Yongbin. On the application of chitosan flocculation precipitation method in impurity removal process of spleen-invigorating transportation mixture[J]. Western Journal of Traditional Chinese Medicine, 2021, 34(11): 80-82.
[19] ZHANG H, ZHU W B. Ultrasound-assisted ethanol/K2HPO4 aqueous two-phase extraction of polysaccharides from Plantago asiatica L.seeds: Process optimization, physicochemical properties, and antioxidant activity[J]. Phytochemical Analysis, 2024, 35(3): 586-598.
[20] 张璟, 邢娜, 韩杨. 双水相萃取技术在生物制药中的应用[J]. 山西化工, 2023, 43(10): 112-114, 120.ZHANG Jing, XING Na, HAN Yang. Application of aqueous twophase extraction technology in biopharmaceuticals[J]. Shanxi Chemical Industry, 2023, 43(10): 112-114, 120.
[21] 曾颖, 张亚楠, 曾臻, 等. 双水相体系萃取分离鲍鱼内脏中的β-葡萄糖苷酶[J]. 食品工业科技, 2020, 41(21): 164-171.ZENG Ying, ZHANG Yanan, ZENG Zhen, et al. Extraction of βglucosidase from abalone viscera by aqueous two-phase system[J].Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(21): 164-171.
[22] 白玉兰, 梁爱琴, 姚文红. 用Origin 绘制(NH4)2SO4-NH4Cl-H2O(100 ℃)三元水盐体系相图[J]. 长沙大学学报, 2011, 25(2): 55-57.BAI Yulan, LIANG Aiqin, YAO Wenhong. Drawing the phase diagram of ternary salt-water system (NH₄)₂SO₄-NH₄Cl-H₂O (100 ℃)using Origin[J]. Journal of Changsha University, 2011, 25(2): 55-57.
[23] 曾颖, 曾淑欣, 何玉书, 等. 双水相临界萃取条件优化方法及其应用[J]. 食品研究与开发, 2023, 44(16): 100-105.ZENG Ying, ZENG Shuxin, HE Yushu, et al. Condition optimization and application of aqueous two-phase critical extraction[J].Food Research and Development, 2023, 44(16): 100-105.
[24] 宁校平, 陈文清. 硫酸铵盐析法提高β-葡萄糖苷酶活探究实验[J]. 四川化工, 2016, 19(2): 17-19.NING Xiaoping, CHEN Wenqing. Study of enhancing β-glucosidase′ enzyme activity by salting out method with ammonium sulfate[J]. Sichuan Chemical Industry, 2016, 19(2): 17-19.
[25] 姚瑶, 刘庆, 刘福, 等. β-葡萄糖苷酶的性质及其在食品加工中的应用研究进展[J]. 贵州农业科学, 2018, 46(2): 132-135.YAO Yao, LIU Qing, LIU Fu, et al. Characteristics of β-glucosidase and its applications in food processing[J]. Guizhou Agricultural Sciences, 2018, 46(2): 132-135.
[26] 姜健, 刘波, 李刚, 等. 离子液体双水相萃取及检测牛血中血红蛋白[J]. 化学研究与应用, 2022, 34(9): 2142-2148.JIANG Jian, LIU Bo, LI Gang, et al. Extraction and detection of hemoglobin in bovine blood by ionic liquid-based aqueous Bbiphasic system[J]. Chemical Research and Application, 2022, 34(9): 2142-2148.