随着经济发展和生活节奏加快，消费者对冷冻食品的需求量不断提高，对其要求也越来越严格，不仅要求膳食搭配，还更加注重食用安全性和营养价值。冷链物流是指将冷冻食品在生产、运输、配送和消费的各个环节，始终贮存在合适的低温环境下，以保证产品安全和质量、减少能耗的系统工程[1]。在全球冷链物流技术不断发展完善的同时，相比于发达国家，发展中国家的冷链物流技术仍存在诸多弊端，有待进一步提高[2]。然而，食品在低温冷链贮存过程中导致的冰晶生长和重结晶问题以及可能产生的水分分离、蛋白质变性、淀粉砂粒、脂质氧化等现象是影响产品品质的关键[3-4]。近年来，人们为控制冰晶生长和重结晶，防止产品因细胞结构破裂而产生品质恶化，研究并尝试了许多技术方法。添加抗冻剂作为一种有效改善冷链物流全过程中食品冷冻特性的方法，愈发受到人们的关注，是近几年研究的热点。
能够稳定食品在冻融循环中质量的物质称为抗冻剂[5]。传统的商业抗冻剂一般为糖类、醇类、盐类及其复配物。其中糖类抗冻剂多为蔗糖与山梨糖醇的混合物，尽管这种混合物具有明显的抗冻作用，但是它们的热量和甜度较高，可能会对产品的质地和风味产生负面影响，而且容易引发高血糖、高血压等症状，严重限制了糖尿病患者和肥胖人群的使用[6]。此外，虽然高浓度的糖在冷冻贮存期间能减少冰晶的形成，但是它们不能有效防止因温度波动而导致的小冰晶重结晶[7]。磷酸盐类抗冻剂通常与其它抗冻剂一起加入到冷冻食品中，这是因为它们的抗冻能力相对较弱，磷酸盐类抗冻剂的加入通常不会导致产品质地的改变，尽管盐类浓度的升高往往会对凝胶的形成产生不利影响[8]。然而，过量摄入磷酸盐会损害身体吸收钙的能力，甚至导致骨质疏松症和肾衰竭等症状[9]。有机溶剂二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作为常用的人工合成抗冻剂，具有潜在的细胞毒性作用，这限制了其在生物领域的应用[10]。综上，人工合成抗冻剂的安全性和不良副作用已经成为其在冷链物流应用上的焦点问题。因此，开发一种高效且安全的新型抗冻剂是研究重点。
南极磷虾是海洋甲壳类浮游动物，其总生物量约为3.8×109亿t，已成为世界上较为丰富的动物蛋白资源之一[11]。据报道，南极磷虾含有11.9%～15.4% 的蛋白质、0.5%～3.6%的脂质、3%的灰分、2%的碳水化合物和77.9%～83.1% 的水分，具有低脂高蛋白的特点[12]。目前，南极磷虾主要被加工成磷虾油以及动物饲料、诱饵等低价值产品[13-14]，即使脱脂和采油后剩余的磷虾副产品保留了65%以上的蛋白质，它们仍然被丢弃[15]。为了促进资源利用并创造更大的经济效益，迫切需要提高南极磷虾的附加值。抗冻肽（antifreeze peptides，AFPs）是一类小分子蛋白质或蛋白质水解物，具有热滞活性、重结晶抑制活性、细胞膜保护作用等多种特性[16-18]，在冷冻食品中加入AFPs是提高食品安全性和营养价值的可行手段。近期研究表明，只需要添加极少量来自不同种类、不同部位的水产品蛋白水解物，即可获得明显的抗冻效果。例如，Cui等[19]从鲢鱼肌肉水解液中筛选和鉴定出一种新型AFPs，发现其对酵母细胞和冷冻面团具有出色的冷冻保护作用，并从分子动力学模拟的角度揭示了它的抗冻特性，即通过防止冰晶的形成和生长。Liu等[20]利用小龙虾壳酶解制备了AFPs，发现经过24 h冻融循环后，加入AFPs的酿酒酵母的存活率从12.5%（对照）提高到88.5%。Erickson等[21]的研究表明，相比于温带鱼类，南极鱼类的副白蛋白含量和对钙的亲和力更高，这赋予了它们一种特殊的抗寒机制，从而使它们的身体免受冻伤并保持稳定。目前，虽然已有关于南极磷虾多肽调节血糖、抗衰老、缓解疲劳等其它生物活性的研究，但有关其抗冻活性以及揭示其肽序列的研究鲜见。
因此，本研究以食源性南极磷虾为原料，采用6种商业蛋白酶水解脱脂后的南极磷虾蛋白，筛选出高效酶制备脱脂南极磷虾抗冻肽（antifreeze peptides from defatted Antarctic krill，AKAPs），并对AKAPs的氨基酸组成进行表征。通过超滤、Sephadex G-25凝胶过滤层析、液相色谱-串联质谱联用（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）以及生物合成技术相结合，获得拥有较高抗冻活性的肽段。此外，还研究AKAPs对鼠李糖乳杆菌的低温保护作用，进一步验证其在益生菌中的抗冻效果，更好地开发南极磷虾水解产物中的有效蛋白，以期为冷链物流技术的发展提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
南极磷虾：青岛南极维康生物科技有限公司；酸性蛋白酶（50 000 U/g）、中性蛋白酶（50 000 U/g）、碱性蛋白酶（200 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g）、胃蛋白酶（250 000 U/g）、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）、过氧化氢酶（2 000 000 U/g）、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）：北京索莱宝科技有限公司；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus BNCC275495）：北京北纳科技有限公司；牛肉膏蛋白胨肉汤培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：青岛海博生物科技有限公司；生物合成肽段DY、LT（＞95%）：南京金斯瑞生物科技有限公司；氢氧化钠（分析纯）：昆山金城试剂有限公司；磷酸（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；生理盐水、甘油、蔗糖、脱脂奶粉：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
分光光度计（Characin V100）：英国应用物理摄影有限公司；全自动氨基酸分析仪（L-8900）：日本日立公司；超滤离心管：美国Merck Millipore公司；快速自动化蛋白纯化系统（AKTA Pure 25 M1）：美国通用电气公司；Sephadex G-25凝胶层析柱（2.0 cm×40 cm）：杭州思拓凡生物科技有限公司；纳升级高效液相系统（EASYnLC 1200）C18预柱（nanoViperTM）、C18反相色谱柱（AcclaimTM PepMapTM 100）、组合型四极杆静电场轨道阱质谱仪（Q ExactiveTM）、纳升喷雾离子源（Nanospray FlexTM）：美国赛默飞世尔科技公司；全波长酶标仪（Spark03030923）：瑞士Tecan公司；全自动微生物生长曲线分析仪（192.168.113.34）：芬兰Bioscreen公司；恒温磁力搅拌器（HJ-6）：巩义市予华仪器有限责任公司；摇水浴培养箱（SWB-500MAX）：群安科学仪器（浙江）有限公司；恒温培养箱（HH-B11-BY）：上海跃进医疗器械有限公司；冰箱（BCD-527WDPC）：海尔智家股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 南极磷虾蛋白的提取
南极磷虾虾肉洗净、去头去壳，置于烧杯中，加入料液比为0.32∶1（g/mL）的去离子水（4 ℃）匀浆。之后，用2 mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为11.38，静置0.5 h后，4 ℃条件下10 000×g离心10 min，得到上清液，整个提取过程重复3次。最后，将收集的上清液用2 mol/L磷酸调节pH值为4.5，静置1.0 h后，4 ℃条件下10 000×g离心10 min，收集沉淀物并冷冻干燥保存。
1.3.2 南极磷虾蛋白的脱脂
将提取的南极磷虾蛋白溶解于丙酮溶液中，浓度为0.25 g/mL，用恒温磁力搅拌器搅拌3 h后静置0.5 h至液体澄清，上层红色液体为南极磷虾油。将磷虾油倒出继续加入丙酮，搅拌2 h后静置0.5 h，重复上述操作，直至上层液体呈无色为止，在通风橱中回收脱脂的南极磷虾蛋白。
1.3.3 南极磷虾多肽的制备
脱脂后的南极磷虾蛋白按0.02 g/mL溶解于去离子水中，分别采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶对脱脂南极磷虾蛋白进行酶解，蛋白酶的添加量为每克南极磷虾蛋白添加3 000 U蛋白酶，均在对应最适酶解温度和pH值下进行，如表1所示。溶液置于摇水浴培养箱中进行4 h酶促反应。酶解后，将反应后的溶液于沸水中加热15 min，使蛋白酶钝化失活，反应终止，并迅速用冰水冷却至4 ℃，在12 000×g下离心15 min，保留上清液，真空浓缩，冷冻干燥，待测。
表1 6 种商业蛋白酶的最佳酶解条件
Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions for six commercial proteases
种类酸性蛋白酶中性蛋白酶碱性蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶酶解温度/℃55 55 55 37 37 55 pH 值2.0 7.0 9.5 8.0 2.0 7.0酶解时间/h底物浓度/%4 4 4 4 4 4酶活/（U/g）50 000 50 000 200 000 250 000 250 000 100 000 2 2 2 2 2 2加酶量/g 120 120 30 24 24 60
1.3.4 水解度测定
根据Tong等[22]的OPA法测定水解度（the degree of hydrolysis，DH），稍作修改。将80 mg的OPA溶于2 mL无水乙醇、200 μL β-巯基乙醇、5 mL十二烷基硫酸铵（质量分数10%）和92.8 mL的四硼酸钠（0.1 mol/L）混合，配制成100 mL的OPA溶液。取40 μL南极磷虾多肽溶液与4 mL OPA混合。所得混合物在室温下孵育2 min，然后测定340 nm波长下的吸光值。将南极磷虾蛋白置于6 mol/L HCl中，在115 ℃下反应24 h，采用丝氨酸标准曲线测定游离氨基酸的数量。南极磷虾蛋白的DH计算公式如下。
式中：H为水解度，%；Nt为t时酶解产物中游离氨基酸数量；N0为未进行酶水解的游离氨基酸数量；NT为完全水解后的游离氨基酸数量。
1.3.5 抗冻活性测定
采用Cai等[23]的方法，通过测定酶在冻融前后的酶活力测定抗冻活性。用KH2PO4-NaOH缓冲液（pH7.0、0.05 mol/L）适当稀释过氧化氢酶，将等量的过氧化氢酶稀释液和8×10-3 g/mL南极磷虾多肽溶液混匀，分别测定过氧化氢酶初始酶活力。然后放入-20 ℃冰箱冷冻24 h，取出25 ℃下解冻，再放入-20 ℃冷冻3 h，反复冻融3次后测定过氧化氢酶活力。在石英比色皿内准确加入1.9 mL蒸馏水、0.1 mL待测酶液和1 mL过氧化氢稀释液，盖上比色皿盖子，立刻摇匀，测定240 nm初始吸光值，每隔1 min记录吸光值，计时5 min。采用冻融后酶活力和初始酶活力比值来表示抗冻活力，酶残余活力越大，表明待测样品的抗冻活性越大。冻融前后的过氧化氢酶活力（catalase viability，CV）和过氧化氢酶残余活力（catalase residual viability，CRV）计算公式如下。
式中：C为过氧化氢酶活力，U/g；R为过氧化氢酶残余活力，%；ΔA240 nm为一定时间内240 nm处吸光值的降低值；D为过氧化氢酶的稀释倍数；V为反应溶液的总体积，mL；T为反应的时间间隔，min；VS为样品体积，mL；U为冻融后过氧化氢酶的活力，U/g；U0为冻融前过氧化氢酶的活力，U/g；10为将吸光值计算的蛋白浓度转换为抗冻活性的关键因子。
1.3.6 氨基酸组成测定
参考Zeng等[24]的研究方法稍作改动。南极磷虾酶解产物用6 mol/L HCl在110 ℃的氮气氛围下消化24 h。消化后的混合物转移至离心管，在50 ℃下减压干燥。所得样品用蒸馏水洗涤两次。最后将干燥后的样品溶解在柠檬酸钠缓冲液（pH2.2）中，并通过0.22 μm过滤器过滤。氨基酸组成分析采用全自动氨基酸分析仪。
1.3.7 超滤分离
根据Hu等[25]的方法，采用超滤离心管过滤法分离南极磷虾酶解产物中的多肽，并将其分离成不同分子量（molecular weight，MW）。样品依次通过10 kDa超滤离心管、3 kDa超滤离心管，参数设置为4 000×g、25 min至所有液体过膜。收集组分MW＞10 kDa、3 kDa＜MW＜10 kDa、MW＜3 kDa的肽段，真空浓缩，冷冻干燥。测定不同分子量组分的过氧化氢酶残余活力，进而分析其抗冻活性。
1.3.8 Sephadex G-25凝胶过滤层析
利用Sephadex G-25凝胶过滤层析进一步分离纯化超滤收集的抗冻活性最强的组分[26]，先用超纯水平衡，然后用超纯水以0.3 mL/min的流速洗脱。洗脱液的每个部分在280 nm处监测，并收集得到的峰，真空浓缩，冷冻干燥，测定其抗冻活性。
1.3.9 LC-MS/MS分析
对Sephadex G-25凝胶过滤层析的抗冻活性最强的组分进行LC-MS/MS分析。酶切多肽样品经离心（12 000×g离心15 min）干燥后，重新溶解于流动相A（2%乙腈，1%甲酸）中装瓶上样，进行在线LC-MS/MS分析。溶解后的样品以合适的体积上样到C18预柱上，然后用20 μL体积冲洗脱盐。液相为纳升级高效液相系统，样品在预柱上脱盐保留后再经分析柱分离，分析柱规格是C18反相色谱柱，试验所用梯度为30 min内流动相B（80% 乙腈、0.1% 甲酸）由5% 升高至38%。质谱采用组合型四极杆静电场轨道阱质谱仪结合纳升喷雾离子源，喷雾电压为1.9 kV，离子传输管加热温度为275 ℃。质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式（data dependent analysis，DDA），一级质谱扫描分辨率为70 000，扫描范围m/z 350～2 000，最大注入时间100 ms。二级质谱离子最大注入时间为50 ms，碰撞室能量设定为28 eV，适用于所有前体离子，动态排除设置25 s。采用PEAKS Online 11软件进行加工处理和检索分析，检索参数设置如下。一级质谱误差10×106；二级质谱误差0.03 Da；酶设置为none；可变修饰：Oxidation（M）。
1.3.10 鼠李糖乳杆菌的活化和传代
将0.3～0.5 mL左右无菌水或液体培养基注入冻干管中，充分溶解成菌悬液。吸取200 μL菌悬液，分别加入琼脂平板表面，并涂布均匀，液体试管和平板置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中。
1.3.11 鼠李糖乳杆菌的生长曲线测定
根据Chen等[27]的方法测定鼠李糖乳杆菌的生长曲线并略作修改。将活化后的二代菌悬液按体积分数0.1%、1%、2%、5%、10% 接种至牛肉膏蛋白胨肉汤培养基中，吸取200 μL发酵液置于96孔板中，测定其OD600 nm。以未接种菌株的培养基为对照，选取OD600 nm在0.1～0.2的浓度梯度，吸取1 mL发酵液置于生长曲线板，采用全自动微生物生长曲线分析仪测定。在37 ℃条件下静置培养48 h，每隔30 min记录发酵液的OD600 nm，并以其表征菌株的最大生物量。以时间为横坐标，OD600 nm为纵坐标，得到鼠李糖乳杆菌在37 ℃的生长曲线。
1.3.12 AKAPs对鼠李糖乳杆菌的低温保护能力测定
参考Chen等[27]的方法，取鼠李糖乳杆菌菌悬液，按1∶100的体积比接种至37 ℃牛肉膏蛋白胨肉汤培养基中进行传代培养，活化过夜。在对数生长期收集细菌，8 000 r/min离心10 min，无菌生理盐水洗涤两次，再用无菌生理盐水将细菌密度稀释至OD600 nm为1.0，将0.1 mL稀释后的菌悬液转移到2 mL离心管中，加入0.9 mL的抗冻肽，使终浓度为1.0 mg/mL。设置阴性对照组（生理盐水）、3个阳性对照组[1 mg/mL蔗糖、1 mg/mL脱脂牛奶、20%甘油（体积分数）]。将加入不同抗冻剂的离心管置于-20 ℃冰箱冷冻24 h。将冷冻处理后的菌液37 ℃解冻15 min，然后将每种混合物0.2 mL接种至3.8 mL的MRS肉汤培养管中，在37 ℃培养20 h。鼠李糖乳杆菌的相对存活率以培养20 h冷冻前后OD600 nm的百分比表示。
1.4 数据处理
本研究中所有试验平行操作3次，数据用平均值±标准差表示，并采用Origin 2021软件作图。IBM SPSS Statistics 26软件用于试验中各组数据的单因素方差分析和显著性分析。P＜0.05表示具统计学意义。
2 结果与分析
2.1 制备AKAPs 最佳蛋白酶的筛选
蛋白酶的特异性决定了其催化水解的作用位点，而不同的作用位点和最佳酶解条件则导致了肽链长度和氨基酸组成的多样性，影响酶解产物的生物活性和水解程度[28]。因此，采用6种不同的商业蛋白酶水解脱脂后的南极磷虾蛋白。蛋白质水解度是评价酶解产物生物活性的重要指标之一，会影响多肽的分子量和氨基酸组成。此外，有效的水解还能促进生物活性基团的释放[29]。测定蛋白酶种类对水解度的影响，结果如图1A所示。利用过氧化氢酶残余活力试验分析蛋白酶种类对抗冻活性的影响，结果如图1B所示。
图1 蛋白酶种类对南极磷虾酶解产物水解度和抗冻活性的影响
Fig.1 Effect of protease species on the hydrolysis degree and antifreeze activity of Antarctic krill hydrolysates
A. 抗冻活性；B. 水解度。不同小写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图1可知，相对于其它4种蛋白酶，碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解产物的水解度更高（P＜0.05），分别为（37.77±1.14）%和（34.10±0.35）%。碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解产物的过氧化氢酶残余活力显著高于其它4种蛋白酶（P＜0.05），分别为（70.00±1.29）%和（64.29±3.74）%。这可能是由于多肽的抗冻活性主要取决于特定肽链的结构域[30]，而在底物充足的条件下，碱性蛋白酶和胰蛋白酶拥有更多的消化位点，表现出更高的耐热性，蛋白更容易被水解成小分子肽。由于碱性蛋白酶的酶解产物显示出最强的抗冻活性，并且在溶解南极磷虾蛋白方面最有效。此外，碱性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，此类蛋白酶的活性中心含丝氨酸残基[31]。有研究表明，碱性蛋白酶已被用作酶解豌豆蛋白、中华鲟蛋白的蛋白酶[32-33]。综上，选择碱性蛋白酶为制备AKAPs的最佳蛋白酶。
2.2 AKAPs 的氨基酸组成
经过碱性蛋白酶水解得到的AKAPs的氨基酸组成和含量见表2。
表2 AKAPs 的氨基酸组成和含量
Table 2 Amino acid composition and content of AKAPs
氨基酸种类天冬氨酸（Asp）苏氨酸（Thr）丝氨酸（Ser）谷氨酸（Glu）甘氨酸（Gly）丙氨酸（Ala）半胱氨酸（Cys）缬氨酸（Val）甲硫氨酸（Met）异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸（Phe）赖氨酸（Lys）组氨酸（His）精氨酸（Arg）脯氨酸（Pro）含量/（g/100 g）1.05 2.61 1.41 8.11 6.28 6.48 0.70 3.05 1.10 2.16 3.03 1.69 2.57 6.60 1.73 5.38 14.05占比/%1.54 3.84 2.07 1.19 9.24 9.53 1.03 4.49 1.62 3.18 4.46 2.49 3.78 9.71 2.54 7.91 20.67
由表2可知，AKAPs中含有大量的脯氨酸（20.67%）、赖氨酸（9.71%）、丙氨酸（9.53%），以上几种氨基酸对多肽的抗冻活性具有贡献，这些氨基酸通过疏水相互作用、氢键与冰晶结合，从而抑制冰晶的生长[34]，脯氨酸的羟基化程度也可能影响多肽抗冻活性的强弱[35]。其次是甘氨酸（9.24%）、精氨酸（7.91%）和亮氨酸（4.46%），它们会改变酶解产物的冰亲和力，增加多肽吸附冰晶的表面作用力[36]。此外，AKAPs中还含有一定量的缬氨酸（4.49%）、苏氨酸（3.84%）、天冬氨酸（1.54%）等脂肪族氨基酸，这些氨基酸也会在低温保护中发挥作用[37]。
2.3 AKAPs 的分离和纯化
超滤离心管可快速有效地浓缩核酸、酶、肽等大分子物质，具有高流速、高通量、极低的蛋白吸附等特性，以及高回收率等优点，不同分子量组分的抗冻活性见图2A。将超滤得到的MW＜3 kDa组分载于Sephadex G-25凝胶层析柱上，洗脱图谱见图2B。测定Sephadex G-25凝胶过滤层析后各组分的抗冻活性，结果如图2C所示。
图2 AKAPs的分离与纯化
Fig.2 Isolation and purification of AKAPs
A. 超滤后不同分子量组分的抗冻活性；B. 分子量小于3 kDa 组分的Sephadex G-25 凝胶过滤层析洗脱图谱；C. Sephadex G-25 凝胶过滤层析后各组分的抗冻活性，F1～F3 表示根据出峰时间收集的3 个多肽峰组分。不同小写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图2A可知，不同分子量多肽呈现出不同的抗冻活性，其中MW＜3 kDa的组分对过氧化氢酶表现出了最强的抗冻保护作用，过氧化氢酶残余活力为（75.19±0.78）%，与其它分子量组分存在显著性差异（P＜0.05）。凝胶过滤色谱是根据分子量分离肽的一种有价值的技术，高分子量的肽不能进入凝胶颗粒，从而被快速洗脱。由图2B可知，Sephadex G-25凝胶过滤层析主要洗脱出3个多肽峰组分，对洗脱的组分按出峰时间进行收集，分子量越低，分离肽的保留时间越长，因此可以推断F1分子量最大，F2在色谱柱中是第二个被分离出来的，分子量居中，F3分子量最小。由图2C可知，F3具有最强的抗冻活性，其过氧化氢酶残余活力达到（80.12±0.69）%，与多肽组分F1与F2存在显著性差异（P＜0.05）。因此，选择对南极磷虾多肽F3组分进一步进行LC-MS/MS分析。试验结果表明，AKAPs经超滤和Sephadex G-25凝胶过滤层析后，实现了小分子肽的分离和富集，得到的分子量较小的组分具有良好的抗冻活性，与分离纯化前的样品相比，过氧化氢酶的残余活力得到了明显提高（10.12%）。这可能是因为大分子AFPs转变为小分子活性片段，分子量较小的组分短肽含量较高，而短肽容易吸附在冰晶表面，抑制冰晶生长，导致抗冻效果得到进一步提高[38]。
2.4 AKAPs 的肽段鉴定
LC-MS/MS可以高通量地鉴定和定量复杂多肽样品中的组分，对多肽组分F3进行肽段鉴定、分离、纯化的南极磷虾多肽中属于AFPs的肽段可能为DINFRY和LGDGMSLST，其二级质谱图如图3所示。LC-MS/MS鉴定出的肽段信息见表3。
图3 LC-MS/MS鉴定出的AKAPs二级质谱图
Fig.3 Secondary mass spectra of AKAPs identified by LC-MS/MS
A. Asp-Ile-Asn-Phe-Arg-Tyr；B. Leu-Gly-Asp-Gly-Met-Ser-Leu-Ser-Thr。通过序列解释和人工计算，多肽的序列与LC-MS/MS 图谱中观察到的片段离子一起显示。为清晰起见，只标注了b-和y-离子，其中b-离子从N 端累积，提供序列的正向信息，y-离子从C 端累积，提供反向验证。
表3 经LC-MS/MS 鉴定出的AKAPs
Table 3 AKAPs identified by LC-MS/MS
肽段序列DINFRY LGDGMSLST肽段在蛋白中的起始和终止的位置416、421 35、43电荷2 2质荷比（m/z）414.205 9 440.711 3肽段质量与理论值偏差-0.2×106 8.4×106
从肽离子获得了清晰的质谱，并且还显示了从肽离子衍生的一些b-和y-离子，由表3可知，肽段的氨基酸序列鉴定为Asp-Ile-Asn-Phe-Arg-Tyr、Leu-Gly-Asp-Gly-Met-Ser-Leu-Ser-Thr，分子量分别为828.41、881.42 Da，氨基酸数量在6～9个之间。这与大多数从水产蛋白水解物中分离出的活性肽一致，即分子量小于1 000 Da，由7～12个氨基酸组成[39-40]，证实两条肽段的结构特征有利于生物活性的提高。此外，甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸的存在也与抗冻蛋白的抗冻活性密切相关，其中LT还含有Gly-x1-x2的三肽序列，这与抗冻肽的结构特征相吻合[41]。利用生物合成技术获得了DY、LT，其二级质谱图如图4所示。
图4 利用生物合成技术获得的AKAPs二级质谱图
Fig.4 Secondary mass spectra of AKAPs obtained by biosynthetic techniques
A. Asp-Ile-Asn-Phe-Arg-Tyr；B. Leu-Gly-Asp-Gly-Met-Ser-Leu-Ser-Thr。
由图4可知，测定的精确分子量分别为826.91、879.98 Da，将其与之前的理论值进行比较，分子量基本一致，验证了合成肽的准确性。
2.5 合成肽段的抗冻活性评价
鼠李糖乳杆菌是最常见的益生菌之一，由于其安全性和健康益处，在发酵食品中应用广泛[42]，但冷藏期间的低温胁迫往往会导致益生菌细胞活力下降。将抗冻肽添加到益生菌中，是探究其低温保护作用的有效途径。将鼠李糖乳杆菌进行活化与传代，第一代菌种的稀释涂布平板形态和第二代菌种的平板划线形态见图5。
图5 鼠李糖乳杆菌的活化和传代
Fig.5 Activation and passage of L. rhamnosus
A. 鼠李糖乳杆菌活化后第一代菌种的稀释涂布形态图；B. 鼠李糖乳杆菌活化后第二代菌种的平板划线形态图。
由图5可知，平板菌层明显，菌落典型，直径为1～2 mm，正面白色，反面黄色，并且表面光滑，质地湿润，其形态特征证明培养的菌种纯度较高。取生物合成后的肽段DY、LT 2 mg分别溶解于4 mL去离子水中，并互溶制备复合肽段DY+LT。通过测定过氧化氢酶的残余活力进一步验证其抗冻活性，结果如图6A所示；取第三代菌种在37 ℃下进行生长曲线的测定，结果如图6B所示；通过鼠李糖乳杆菌的相对存活率分析不同抗冻剂对益生菌低温保护能力的影响，结果如图6C所示。
图6 合成肽段的抗冻活性验证
Fig.6 Verification of antifreeze activity of synthetic peptides
A. 合成肽段的抗冻活性；B. 鼠李糖乳杆菌的生长曲线；C. 不同抗冻剂对鼠李糖乳杆菌的低温保护能力。不同小写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图6A可知，经过3次冻融循环后，DY、LT、DY+LT 3个肽段显示出了较高的抗冻活性，过氧化氢酶的残 余 活 力 分 别 为（83.12±1.88）%、（85.94±1.79）%、（93.33±1.13）%，复合肽段DY+LT的抗冻效果显著优于DY、LT两个肽段（P＜0.05），这可能与其较高的疏水氨基酸、酸性氨基酸占比有关，这些氨基酸使肽与冰晶之间的氢键更加稳定，并使DY+LT表现出抑制单冰晶生长的能力和重结晶抑制活性。
由图6B可知，在0 h到4 h鼠李糖乳杆菌生长缓慢，菌种处于生长的适应阶段，为迟滞期，在4 h到15 h生长相对较快，为对数期，在15 h到20 h生长速度变缓，约在20 h到达稳定期。培养20 h后，鼠李糖乳杆菌进入稳定期，液体培养体系中的营养物质消耗殆尽，菌体的生理特性和生长状态比较稳定。
由图6C可知，鼠李糖乳杆菌在无菌生理盐水阴性对照中的相对存活率较低[（11.40±0.68）%]，而20%（体积分数）甘油组、DY组、LT组以及DY+LT组鼠李糖乳杆菌的相对存活率显著高于其他组（P＜0.05），其中复合肽段DY+LT的低温保护作用最强，鼠李糖乳杆菌的相对存活率达到了（94.11±0.91）%。上述试验结果表明，DY、LT、DY+LT能够通过维持细胞膜的结构完整性、保护细胞活力，有效地抑制益生菌冷冻过程中代谢活性的下降[43]。即使复合后肽段的分子量增大，多肽的空间位阻也会增大，阻碍其与冰晶表面的结合并减少大冰晶的生成，从而提高其抗冻活性。
3 结论
通过筛选最佳蛋白酶优化制备AKAPs的工艺，采用超滤、Sephadex G-25凝胶过滤层析、LC-MS/MS、生物合成技术的结合获得具有较高抗冻活性的肽段，探究AKAPs的对鼠李糖乳杆菌低温保护活性的能力。结果表明，最高水平的DH和抗冻活性是通过碱性蛋白 酶 的 水 解 作 用 实 现 的[（37.77±1.14）%，（70.00±1.29）%]。超滤分离出3种不同分子量的多肽组分，抗冻活性也有所差异。MW＜3 kDa的抗冻活性显著高于MW＞10 kDa、3 kDa＜MW＜10 kDa，过氧化氢酶残存活力达到（75.19±0.78）%，与超滤前相比提高了5.19%。经Sephadex G-25凝胶过滤层析对其进行分离纯化后，获得的3个多肽组分中，F3的抗冻活性最强，其过氧化氢酶残存活力为（80.12±0.69）%，优于F1、F2和碱性蛋白酶酶解产物。通过LC-MS/MS肽段鉴定得到DY、LT两条肽段，该肽段富含可以起到抗冻效果的氨基酸，同时还具有合适的肽段长度。合成肽段DY、LT以及复合肽段DY+LT均显示出了较高的抗冻活性，过氧化氢酶的残余活力分别为（83.12±1.88）%、（85.94±1.79）%、（93.33±1.13）%。在鼠李糖乳杆菌冻融过程中，3个肽段表现出比生理盐水和商业冷冻保护剂更好的低温保护作用，鼠李糖乳杆菌的相对存活率分别达到（83.16±0.88）%、（87.88±3.00）%、（94.11±0.91）%。综上所述，从脱脂南极磷虾中提取的AKAPs具有一定的抗冻活性，可以推测南极磷虾多肽中具有较高抗冻活性肽段的氨基酸序列是Asp-Ile-Asn-Phe-Arg-Tyr、Leu-Gly-Asp-Gly-Met-Ser-Leu-Ser-Thr，下一步可利用分子对接、分子模拟等技术，深入评价AKAPs的抗冻机制，为新型抗冻剂的开发和冷链物流的发展提供一定的理论依据。
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