帕金森（Parkinson′s disease，PD）是一种常见的神经退行性疾病，是继阿尔茨海默病之后第二常见的神经退行性疾病，以黑质纹状体区多巴胺能神经元进行性缺失和纹状体多巴胺含量显著减少为特征。全球60岁以上人口中近 1% 患有帕金森病[1]，该病严重影响着患者的生活质量。随着人口老龄化的加剧，PD的患病率呈明显上升趋势。据统计，我国有将近300万帕金森病患者，几乎占全球该病患者的50%，是世界上该病患者最多的国家[2]。
益生菌作为一种微生物制剂，一直以来都被用于改善人体健康。调节肠道菌群可以通过膳食补充或者摄取益生菌。多项研究表明，摄入某些特定益生菌可通过肠-脑轴有效预防和改善PD，潜在的作用包括调节肠道微生态、减轻炎症反应和促进神经营养因子的表达等[3-4]。屎肠球菌是一种在动物中广泛使用的益生菌[5]。枯草芽孢杆菌已被证明可以恢复胃肠道的生态失调，在胃肠道中具有良好的耐受性[6]。此外，屎肠球菌联合枯草芽孢杆菌还能抑制肠道机会性病原体，包括大肠杆菌、福氏志贺氏菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌[7]。枯草芽孢杆菌作为一种需氧菌，定殖肠道后可降低肠道局部氧浓度，形成适合厌氧菌群生长的肠道微环境。这又促进了双歧杆菌和乳杆菌等厌氧细菌的生长[8]。近年来进行的多项研究表明，益生菌制剂对神经退行性疾病具有治疗作用，能够通过微生物-肠-脑轴对中枢神经系统起到保护作用。
因此，本文通过研究屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）诱导的PD小鼠治疗作用，对治疗后PD小鼠脑组织中抗氧化活性以及改善小鼠的肠道菌群进行探究。对新型具有缓解帕金森病潜力的益生菌及其缓解帕金森病的机制进行解析，以期为微生物疗法防治帕金森病及其他神经退行性疾病提供可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验动物和材料
C57BL/6J小鼠[体质量（20±2）g，40只]：辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证编号：SCXK（辽）2020-0001，伦理号：2024082117。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶：上海源叶生物科技有限公司；左旋多巴（l-dopa）：上海富达制药有限公司；屎肠球菌R-026[菌种编号：SHMCC（SHBCC）D24692]、枯草芽孢杆菌R-179[菌种编号：SHBCC D24691]：由北华大学药学院实验室-80 ℃保存；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；多巴胺（dopamine，DA）试剂盒：武汉基因美生物科技有限公司；彩虹marker：美国GE Healthcare公司；转录因子NF-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗体、血红素氧合酶1（hemeoxygenase-1，HO-1）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GADPH）抗体：武汉爱博泰克生物科技有限公司；ECL显影液：武汉赛维尔生物科技有限公司；甲醇、乙醇（均为色谱纯）：辽宁瑞泉试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
高速匀浆机（FSH-2型）：上海净信实业发展有限公司；酶标仪（Infinite M200型）：瑞士帝肯公司；低温高速离心机（5430R）：美国Eppendorf公司；-80 ℃低温冰箱（LZT40-100）：上海博迅实业有限公司；全自动荧光及化学发光凝胶成像仪（ChampChemi professional plus）：北京赛智创业科技有限公司；电热恒温水浴锅（HH·S11-Ni4）：北京长安科学仪器厂；涡旋混合器（Vortex-MULTI）：上海沪析实业有限公司；显影仪（Chemstudio 515型）：德国耶拿分析仪器股份公司。
1.2 方法
1.2.1 MPTP溶液配制
向MPTP药物粉末中加入生理盐水制成5 mg/mL溶液，现用现配。
1.2.2 益生菌混悬液制备
活化屎肠球菌、枯草芽孢杆菌3次，活菌数不少于109 CFU/mL，接种至新培养基，培养12 h，4 ℃、4 000 r/min离心10 min得屎肠球菌、枯草芽孢杆菌菌泥，将菌泥重悬于生理盐水中，制成益生菌混悬液（屎肠球菌1.8×108 mL、枯草芽孢杆菌2.0×107 mL）。
1.2.3 左旋多巴混悬液制备
将左旋多巴片剂研磨过筛后加入生理盐水制成2 mg/mL左旋多巴混悬液。
1.2.4 实验动物分组及给药
40 只小鼠随机分为空白（Con）组、模型（MPTP）组、益生菌治疗（BE）组和阳性药（Pos）组，每组10只，MPTP组、Pos组及BE组连续7 d每天腹腔注射剂量为25 mg/kg的MPTP，Con组连续7 d给予同等剂量的生理盐水。建模结束后，Pos组灌胃给药左旋多巴10 mg/kg，剩余组给予等量生理盐水，连续给药14 d。BE组小鼠给药剂量为屎肠球菌R-026（9×107 CFU/mL）、枯草杆菌R-179（1.0×107 CFU/mL）连续给药21 d。
1.2.5 行为学实验
1.2.5.1 爬杆实验
爬杆实验用来评估动物的敏捷性和感觉运动障碍。在一个盛满垫料的笼子里放置一个 50 cm高的垂直杆（直径 1 cm），表面材质粗糙。将每只小鼠都放置在杆子的顶部，头朝上，记录其从顶部向下转动到落地的时间，每只小鼠测试 3次（测试之间间隔 1 min），取3次实验的平均时间[9]。
1.2.5.2 悬挂实验
将一根长约40 cm绷紧的电线固定在距离桌面30 cm高的位置，桌面上铺泡沫板，防止小鼠掉落摔伤。将小鼠两只前爪悬挂在固定好的电线上，观察小鼠爪子的抓握情况，小鼠两只后爪都可以抓住电线记5分，一只后爪可以抓住记3分，两只后爪均抓不住则记1分，计算分值，重复实验3次取平均值，最后计算各组小鼠的得分情况[10]。
1.2.5.3 旷场实验
实验装置安装好后，将动物从饲养笼里取出，背向实验者放置到旷场的中央区域，实验者迅速离开，任其动物在实验箱自由活动。迅速开启软件的摄像系统视频录制，记录动物在旷场中5 min的活动情况。实验监测时间结束后将小鼠取出并放回饲养笼内，对旷场反应箱底部、放置物以及侧壁进行彻底清洁，以免本次动物余留的信息（如动物的大小便、气味）影响下次测试结果，用75% 乙醇清洁整个旷场箱体，等待晾干后更换小鼠继续重复以上实验[11]。
1.2.6 小鼠脑组织DA含量及血清SOD、MDA、GSH、CAT水平测定
末次行为学后断髓处死小鼠，摘除小鼠眼球收集血液至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min，收集上清液。对各组小鼠进行断髓处理并收集小鼠脑组织，按照体积比1∶10加入裂解液，匀浆后取上清液并将其分装保存在离心管，按照试剂盒说明书进行相应检测。
1.2.7 蛋白质免疫印迹法关键靶点蛋白表达的测定
将50 mg小鼠脑组织切成小块，加入 500 uL组织蛋白裂解液，在冰上裂解 1 h。离心 10 min（12 000 r/min，4 ℃），用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA） 法测定上清液中的蛋白浓度。将蛋白质样品煮沸3～7 min使其变性，在转移缓冲液中将蛋白转移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。将含有蛋白的 PVDF膜在 5%脱脂牛奶中封闭 2 h，然后分别与Nrf2、HO-1蛋白的第一抗体 4 ℃孵育过夜。将膜用TBST洗涤 3次，每次 15 min，然后在室温下与相应的二抗温育 1 h。用 ECL显影液和显影仪使蛋白质可视化，并进行蛋白灰度分析。
1.2.8 小鼠肠道菌群16S rDNA测序
取样前笼子铺上消毒滤纸。超净台灭菌15 min，通风5 min，酒精擦拭桌面。在冻存管无菌条件下收集3组受试小鼠的粪便3～5颗，封装后置于-80 ℃冰箱里，采样结束后干冰存放样品并将其转送至杭州联川生物技术股份有限公司进行测序分析。
1.3 数据处理
本实验结果利用SPSS 26.0进行统计学处理，数据结果采用平均值±标准差的方式表示，p＜0.05认定具有统计学意义，该数据可以作为参考。
2 结果与分析
2.1 行为学实验测定结果
屎肠球菌联合枯草芽孢杆菌对PD小鼠行为学的影响见图1。
图1 行为学实验
Fig.1 Behavioral experiments
A.爬杆时间；B.悬挂实验得分；C.旷场实验。**表示与Con 组相比差异极显著，p＜0.01；#表示与MPTP 组相比差异显著，p＜0.05；##表示与MPTP 组相比差异极显著，p＜0.01。
由图1可知，与Con组小鼠相比，MPTP组的爬杆时间极显著延长（p＜0.01）；而与MPTP组小鼠相比，BE组小鼠爬杆时间极显著缩短（p＜0.01）。悬挂实验结果显示，与Con组相比，MPTP组小鼠悬挂实验得分极显著降低（p＜0.01）；与MPTP组相比，BE组小鼠悬挂实验得分极显著升高（p＜0.01）。旷场实验结果显示，与Con组相比，MPTP组小鼠5 min运动总路程极显著减少（p＜0.01）；与MPTP组相比，BE组小鼠5 min运动总路程显著增加（p＜0.05）。表明BE组相比MPTP组小鼠的运动症状有所改善，证明益生菌可以缓解PD小鼠的运动障碍。
2.2 小鼠血清中SOD、MDA、GSH、CAT 水平的测定结果
屎肠球菌联合枯草芽孢杆菌对PD小鼠生化指标的影响见图2。
图2 益生菌对小鼠氧化应激的影响
Fig.2 Effect of probiotics on oxidative stress in mice
A. SOD 活性；B. MDA 含量；C. GSH 含量；D. CAT 活性；**表示与Con 组相比差异极显著，p＜0.01；#表示与MPTP 组相比差异显著，p＜0.05；##表示与MPTP 组相比差异极显著，p＜0.01。
由图2可知，与Con组相比，MPTP诱导的 PD模型小鼠中脑抗氧化物SOD、CAT活性、GSH含量极显著降低（p＜0.01），MDA含量极显著上升（p＜0.01）。与MPTP组相比较，BE组小鼠的SOD、CAT活性（p＜0.05）、GSH含量升高（p＜0.01），MDA含量显著下降（p＜0.05）。表明BE可能是通过上调小鼠血清中SOD、CAT活性、GSH含量和降低MDA含量发挥作用。以上结果表明摄入益生菌可增强中枢神经系统的抗氧化能力，从而帮助 PD小鼠降低超氧化物毒性并减轻氧化应激。
2.3 益生菌对帕金森病小鼠DA 含量的影响
在PD小鼠模型中通过补充纹状体 DA水平，可以显著改善运动功能障碍，屎肠球菌联合枯草芽孢杆菌对PD小鼠DA含量的影响见图3。
图3 益生菌对 PD小鼠纹状体单胺的影响
Fig.3 Effect of probiotics on levels of striatal monoamines in PD mice
**表示与Con 组相比差异极显著，p＜0.01；##表示与MPTP 组相比差异极显著，p＜0.01。
由图3可知，与Con组相比，MPTP处理极显著降低纹状体中 DA含量（p＜0.01）。与MPTP组相比，Pos组极显著改善了纹状体中DA含量（p＜0.01）。益生菌干预也极显著增加了 PD小鼠纹状体中DA含量（p＜0.01），表明其可能通过调节肠道菌群-脑轴的代谢通路，间接促进 DA合成或抑制其降解，从而改善 PD小鼠的神经递质失衡状态。
2.4 益生菌对PD 小鼠脑组织中抗氧化相关蛋白表达的影响
Nrf2/HO-1通路通过抗氧化机制，在PD小鼠模型中显著延缓多巴胺能神经元退化并改善运动功能。屎肠球菌联合枯草芽孢杆菌对PD小鼠脑组织中Nrf2、HO-1蛋白表达的影响见图4。
图4 益生菌对小鼠脑组织中Nrf2、HO-1蛋白表达的影响
Fig.4 Effect of probiotics on expression of Nrf2 and HO-1 proteins in mouse brain tissue
A.益生菌对PD 小鼠脑组织中HO-1、Nrf2 蛋白表达的影响；B. HO-1；C. Nrf2。**表示与Con 组相比差异极显著，p＜0.01；#表示与MPTP 组相比差异显著，p＜0.05；##表示与MPTP 组相比差异极显著，p＜0.01。
由图4可知，与Con组相比，MPTP组小鼠脑组织中Nrf2、HO-1蛋白表达极显著降低（p＜0.01）。与MPTP组比较，BE组小鼠脑组织中Nrf2、HO-1蛋白表达显著升高（p＜0.05，p＜0.01）。结合此前 BE对纹状体DA含量的改善作用，推测 BE或通过激活 Nrf2/HO-1通路，减少多巴胺氧化产物积累，缓解线粒体损伤，最终促进神经元保护与功能恢复。
2.5 小鼠肠道菌群16S rDNA 测序结果
2.5.1 扩增子序列变异体（amplicon sequence variants，ASVs）分布韦恩图
小鼠粪便肠道菌群 16S rDNA测序统计韦恩图见图5。
图5 小鼠粪便肠道菌群 16S rDNA测序统计韦恩图
Fig.5 Venn diagram of 16S rDNA sequencing statistics of intestinal flora in mouse feces
由图5可知，韦恩图结果展示了各组之间ASVs的重合情况。在所有的ASVs中，Con组中有376个ASVs是空白组特有的，814个ASVs是模型组特有的，而BE组中有676个ASVs为其特有，464个ASVs为3组共有的。MPTP组大量菌群种类的特异性出现或消失，可能与肠道微生态失衡、炎症反应或神经-肠轴功能紊乱相关。BE组 676个特有的 ASVs则暗示益生菌干预重塑了肠道菌群组成。
2.5.2 β-多样性分析
β-多样性用于描述组间物种多样性的差异程度。本研究进一步分析各组小鼠肠道菌群的 β-多样性，基于 Jaccard距离矩阵使用主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）降维方法分析评估所有样品的组间差异，结果如图6所示。
图6 小鼠粪便肠道菌群 PCoA分析图
Fig.6 PCoA diagram of intestinal flora in mouse feces
由图6可知，从 PCoA的聚类结果可以看出，不同组别能较好地区分开来；4组间存在明显差异；MPTP诱导下的 PD小鼠的肠道菌群结构和正常小鼠存在差异；与MPTP组小鼠相比，益生菌与阳性药物干预组使得肠道菌群结构实现一个新的稳态；PCoA的分析结果表明，PD小鼠的肠道菌群结构较Con组发生明显变化，而益生菌的干预能够改变菌群的结构。
2.5.3 柱状堆叠图
为了探究益生菌如何通过改变微生物群落结构来保护 MPTP诱导的 PD小鼠模型，本研究根据测序结果对肠道菌群进行进一步注释，分析结果如图7所示。
图7 对 PD小鼠肠道菌群结构及组成的影响
Fig.7 Effect on structure and composition of intestinal flora in PD mice
A. 9 个细菌门相对丰度的聚类热图；B. 肠道菌群门水平柱状堆叠图。
由图7可知，小鼠门水平肠道菌群主要由9个类群组成，且 Firmicutes和 Bacteroidota是相对丰度最大的两个门，其丰度占可识别菌群总丰度的 75%以上，但在 MPTP诱导的 PD小鼠中这两个门类的丰度并未发生明显变化。除 Firmicutes和Bacteroidota以外，鉴定出的门还包括Proteobacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia、Patescibacteria、Desulfobacterota、Campylobacterota和 Cyanobacteria。此外，与 Con组小鼠相比，Proteobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia在 PD小鼠中的丰度明显增加，而Actinobacteria、Patescibacteria、Campylobacterota、Cyanobacteria和 Desulfobacterota的丰度明显降低。而益生菌干预可以纠正上述 PD小鼠肠道菌群门水平的变化。
2.5.4 益生菌对帕金森病小鼠肠道中差异菌群的影响
为了确定各组之间的显著差异物种，基于线性判别式分析法（linear discriminant analysis effects size，LEfSe）在属水平上进一步探究益生菌干预对 PD小鼠肠道菌群的影响，各组小鼠肠道菌群中的差异属分析结果如图8所示。
图8 益生菌对 PD小鼠肠道中差异菌群的影响
Fig.8 Effect of probiotics on differential flora in intestine of PD mice
A.属水平LEfSe 分析进化分支图；B.分布柱状图；C.差异属相对丰度。*表示基因在样本之间差异显著，p＜0.05；**表示基因在样本之间差异极显著，p＜0.01。
由图8可知，以lg LDA＞3.0和 p＜0.05作为差异分析阈值，总共检测出11个属具有组间差异；Con组丰度差异最大的菌群为Candidatus_Saccharimonas、Eubacterium_xylanophilum_group和Enterorhabdus。其中，MPTP干预明显改变了 PD小鼠的肠道菌群，增加了Escherichia-Shigella、Enterococcus、Eisenbergiella的丰度。益生菌处理可以恢复这些细菌水平的改变。此外，本研究发现经 MPTP处理的小鼠肠杆菌科水平升高。BE组丰度差异最大的是Ligilactobacillus、Lactobacillus、 HT002、Pseudomonas。BE一定程度上调节了MPTP诱导小鼠引起的紊乱，这些菌属丰度的改变，可能通过恢复健康的肠道菌群的水平，从而间接地缓解小鼠的 PD症状。
3 讨论与结论
本研究利用MPTP诱导建立帕金森小鼠模型，益生菌干预治疗2周后，与MPTP组相比，BE组小鼠血清中 MDA含量显著下降，SOD活性、CAT活性、GSH含量显著升高，脑组织中DA含量升高。GSH是大脑中的重要抗氧化剂，可以通过减少活性氧来保护机体免受氧化应激引起的损伤[12]。有研究表明，增加大脑中 GSH含量是 PD的有效治疗策略之一[13]。黑质致密部 （substantia nigra pars compacta，SNpc） 内DA神经元的丢失是PD的一个定义病理标志。通过对PD/路易小体痴呆（dementia with Lewy bodies，LBD）老年对照样本黑质snRNA-seq分析，发现DA神经元占比显著下降[14]。以上结果表明：摄入益生菌可增强中枢神经系统的抗氧化能力，从而帮助 PD小鼠减轻氧化应激和DA含量升高。Nrf2/HO-1是一种抵御外界刺激的抗损伤机制，也是抗氧化应激的主要信号通路。与Con组相比，经 MPTP诱导后的 PD小鼠纹状体中Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著降低，但屎肠球菌联合枯草芽孢杆菌干预能显著上调 Nrf2、HO-1的蛋白表达量，具有明显缓解效果。Lu等[15]发现抑制 Nrf2活性可降低下游抗氧化酶 HO-1和抗氧化水平，最终加重 PD炎症反应和多巴胺神经元变性。银杏内酯 C可通过激活1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+） 暴露的 SN4741神经元细胞中的 AKT/Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化作用[16]，与本研究结果一致。以上结果表明，屎肠球菌联合枯草芽孢杆菌具有激活抗氧化应激通路 Nrf2/HO-1/NQO1的作用，从而抑制MPTP诱导的 PD小鼠脑部的氧化应激反应，来发挥神经保护作用。
肠道菌群不仅参与人体代谢、维持机体免疫功能正常等过程，还与焦虑、抑郁等神经系统性疾病有着密切关系。研究表明“菌群-肠-脑轴”参与帕金森病、抑郁症等[17-18]，帕金森病患者肠道微生态存在失调[19]。为探索益生菌如何通过调节菌群结构来保护 MPTP诱导的 PD小鼠，对来自不同组小鼠的粪便样品进行了16S rDNA进行测序。在本实验中，β-多样性结果显示Proteobacteria在 PD小鼠中的丰度显著增加。研究表明PD患者的肠道微生物群含有增加的Proteobacteria[20]。Monira等[21]发现，相比于健康儿童，在营养不良儿童中，Proteobacteria的数量会显著增加。在Sun等[22]研究中，PD患者的Verrucomicrobia丰度显著增加，与本研究结果一致。提示益生菌可能通过调节Proteobacteriaa丰度来改善PD小鼠肠道菌群异常。在本实验中Actinobacteria、Patescibacteria、Campylobacterota、Cyanobacteria和 Desulfobacterota在PD小鼠中的丰度显著降低。双歧杆菌是Actinobacteria中的一种有益菌，它可以改善帕金森[23]、代谢[24]、结肠炎[25]等。双歧杆菌可以改善由MPTP诱导的Patescibacteria、Campylobacterota、Cyanobacteria和 Desulfobacterota丰度降低[26]。
本研究中LefSe分析发现MPTP干预显著改变了PD小鼠的肠道菌群，增加了 Escherichia-Shigella、Enterococcus、Eisenbergiella的丰度且小鼠肠杆菌科水平升高，但在益生菌干预后明显减少。研究结果表明，Escherichia-Shigella减少可以改善 PD小鼠的肠道中疾病症状[27]。除了分泌蛋白外，Enterococcus被证明会产生有毒的氧代谢物，从而导致细胞或器官损伤[28]。Eisenbergiella被认为是促炎症微生物，会使免疫细胞释放的炎症介质增多[29]。Liu等[30]发现肠杆菌科水平升高与 PD和 阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）均有关。
综上所述，益生菌一定程度上可减轻MPTP诱导的PD小鼠的症状，改善PD小鼠的运动障碍，对氧化应激有良好改善作用。同时可对肠道菌群产生影响，改变菌群丰度由此改善帕金森的症状。本研究确定了枯草杆菌联合屎肠球菌能够通过影响微生物-肠-脑轴对帕金森病发挥缓解效果。
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