果酒酿造是一个复杂的过程，由多种微生物共同参与，其中的主导微生物是酵母。酵母的生长代谢会引起果汁多种成分发生变化，从而形成果酒，因此，酵母是影响果酒品质和风格的重要因素之一[1]。用于果酒酿造的酵母根据发酵乙醇特性划分为两类：一类为酿酒酵母属（Saccharomyces），主导乙醇发酵，具有起酵速度快、发酵力强，对酒精、温度、酸度、SO2等耐受性强的特点。目前，Saccharomyces有4个种常用于葡萄酒酿造，分别是酿酒酵母S. cerevisiae、贝酵母S. bayanus（原葡萄汁酵母S. uvarum）、巴斯德酵母S. pastorianus和奇异酿酒酵母S. paradoxus[2]；第二类是非酿酒酵母属（non-Saccharomyces），是相对于酿酒酵母属提出的一个概念，是除酿酒酵母属之外的所有酵母菌种[3]。对非酿酒酵母的认识和应用相对较晚，截止2021年，从葡萄或葡萄醪中共分离到293个非酿酒酵母[4]。非酿酒酵母总体上耐酒精、温度、酸度、SO2能力较差，但因其能产生活性相对较高的关键胞外酶，使非酿酒酵母呈香呈味风格突出，对酒醪的风味品质有积极影响，赋予葡萄酒[5-7]、火龙果酒[8]、菠萝酒[9]、樱桃酒[10]等果酒及薏米酒醪[11]、传统米酒[12]等独特风格。
目前，不同风土特色的果酒越来越受到人们的关注，所以酵母尤其是非酿酒酵母的分离、鉴定及选育一直是果酒酿造的重要课题，目前通过分离、诱变等技术已筛选出具有优异酿酒特征的酵母种[13-15]，有些菌种已经商业化，如安琪葡萄酒酵母RW型和SY型，常被用于果酒、粮食酒酿制[16-17]。不同水果酿制果酒所需酵母菌种有所不同，为了丰富果酒市场多样性，酿制不同风土特色葡萄酒，从当地水果表皮、果园土壤、果树枝条、酒厂中发掘适合当地水果酿制果酒的优良酵母是一条有效途径。
安徽滁州凤阳和蚌埠地区的气候和土壤适合种植葡萄，目前葡萄种植面积大、产量高，成立了小岗村葡萄产销一体化农业生产合作社[18]，主要有巨峰、阳光玫瑰、夏黑、美人指等多个品种。由于浆果保质期短，外销运输成本高，如何开展当地主栽葡萄的深加工是解决季节性水果滞销的关键途径。‘巨峰’由于颜色浅可用来生产桃红（浅红）葡萄酒，本试验从当地主栽的‘巨峰’葡萄和怀远‘玉石籽’石榴及市售‘黑布林’果皮上分离、筛选出适合当地主栽葡萄品种‘巨峰’酿造葡萄酒的专用菌种，以期为开发‘巨峰’葡萄酒提供优良酿酒酵母菌株。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
‘黑布林’李子、‘巨峰’葡萄、‘玉石籽’石榴：市售；商业干酵母RW型、SY型：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KCl、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、柠檬酸、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chlorid，TTC）、福林酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；单宁酸、没食子酸、芦丁标准品（均为色谱纯）：合肥博美生物科技有限责任公司；2×Fast Taq预混液：南京博雷兹生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
分离培养基为酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）琼脂、WL营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）、豆芽汁、麦芽汁琼脂培养基，121 ℃灭菌20 min。
TTC筛选培养基：下层为葡萄糖5%、蛋白胨2%、酵母浸膏1.5%、KH2PO4 1%、MgSO4 0.4%、柠檬酸0.027%、琼脂2%，上层为葡萄糖0.5%、琼脂粉2%，灭菌后加入0.05%TTC。
1.2 仪器与设备
立式压力蒸汽灭菌器（LDZF-50KB-II）：上海申安医疗器械厂；洁净工作台（SW-CJ-ZF）：苏州安泰空气技术有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9123A）：上海一恒科学仪器有限公司；双层真彩触摸屏摇床（ZWYA2102C）：上海智城分析仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计（UV-6100）：上海元析仪器有限公司；笔式pH检测计（pH828）：东莞万创电子制品有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酵母分离与纯化
取3种水果皮各8 g剪碎，于YPD+10 mg/L青霉素培养基中，28 ℃、180 r/min富集培养36 h。富集液稀释成10-1～10-6，取200 μL涂布于5种分离培养基上，3次重复，28 ℃培养1～3 d。统计菌株数量，根据形态挑取酵母菌，平板划线纯化，挑取单菌落低温保存。
1.3.2 TTC法初步筛选
菌株点接于TTC下层培养基中，待长出菌落时将冷却至35 ℃左右TTC上层培养基缓慢倒入，避光倒置2 h，观察颜色深浅。产酒精能力强的酵母会显示深红色，次之显粉红色、微红色或不显色[19]，挑选颜色为深红色的菌落保存。
1.3.3 杜氏发酵法二级筛选
6 mm×30 mm杜氏小管注满YPD，倒置于含4.5 mL YPD的试管中，接种初筛得到的204株菌，28 ℃静置培养2 d。统计杜氏小管产气情况，并由感官品评小组对香气进行评价。
1.3.4 发酵葡萄酒的制备
葡萄分选、去梗、破碎→调糖、调酸→加硫→接种酵母→主发酵→倒罐→后发酵→多次澄清→陈酿→成品。
操作要点：1）成分调整：调pH3.3～3.5（酸度6～7 g/L），调糖20 °Bx，加入60 mg/L焦亚硫酸钾；2）装入250 mL带发酵栓的三角烧瓶中，每瓶150 mL；3）前期筛选出11株表现优异的酵母（命名为Y1～Y11）和RW、SY甘油菌种，平板划线活化、制备种子液并测OD值，接种菌液浓度要求OD值为0.5、接种量10%。各酵母种子液按实际OD值量取相应体积种子液，常温下4 000 r/min离心5 min收集菌体，无菌水漂洗菌体2次，果汁重悬菌体，接入调整成分后葡萄汁中，每个菌种接种3瓶，盖发酵栓，于20 ℃条件下发酵；4）主发酵期间每天晃瓶管理，相对密度降至0.995以下时过滤去皮渣，转入灭菌的玻璃瓶，满瓶，密封后发酵；5）多次转瓶去酒脚：于室温下4 000 r/min离心5 min去酒脚，澄清酒液装瓶于4 ℃下保存，用菌株编号标记酒样名称。
1.3.5 葡萄酒理化指标测定
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法测定还原糖和总糖含量（以葡萄糖计）[20]；总酚含量采用福林-肖卡（Folin-Ciocalteu）法测定，单宁含量测定采用福林-丹尼斯（Folin-Denis）法[21]；NaOH滴定法测定总酸含量（以硫酸计）[21]，利用pH计测定pH值；总酯含量（以乙酸乙酯计）测定采用中和滴定法[21]；酒精含量采用比色法测定[22]；总还原力测定参照苗永美等[23]的方法。
利用样品吸光度（A420、A520、A620），计算色度（C）和色调（H），计算时减去A700校正浊度的影响[24]，公式如下。
总花色苷含量采用pH示差法测定[25]，总花色苷含量（以矢车菊色素-3-葡萄糖苷计）按下列公式计算。
式 中：M为 总 花 色 苷 含 量，mg/L；A=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5；N为稀释倍数；26 900为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，L（/mol·cm）；449.12为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔质量，g/mol。
根据祝霞等[26]的方法计算柔和指数（suppleness index，IS），计算公式如下。
式中：I为酒样柔和指数；A为酒精体积分数，%；T为单宁质量浓度，g/L；C为总酸质量浓度（以硫酸计），g/L。
1.3.6 分子鉴定
Y4、Y7和Y10菌体中加入50 mmol/L NaOH溶液重悬后煮沸10 min，加入1 mol/L Tris-HCl溶液（pH8.0），4 ℃、12 000 r/min条件下离心5 min，上清液用通用引物ITS4和ITS5进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩 增。扩 增 体 系：1 μL DNA模 板、10 μL 2×Fast Taq预 混 液、0.4 μL ITS4（10 μmol/L）、0.4 μL ITS5（10 μmol/L）、8.2 μL ddH2O；扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送通用生物（安徽）股份有限公司测序。获得序列在NCBI网站GenBank中BLAST进行搜索、相似性比对，构建进化树。
1.4 数据分析
采用Excel软件进行数据分析和绘图，MEGA11软件构建系统发育树。试验均进行3次重复，结果表示为平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 菌种富集及数量统计
10-1和10-2稀释液由于浓度过高难以形成单菌落，不做统计。10-3～10-6稀释度下能获得单菌落，菌落数统计结果见表1。考虑到种类和数量，只挑取10-3稀释度涂布板上的菌落，其他稀释度只统计数量未挑取菌落。
表1 菌落数统计结果
Table 1 Statistical results of yeast colony
培养基—材料麦芽汁—石榴表皮麦芽汁—李子表皮麦芽汁—葡萄表皮PDA—石榴表皮PDA—李子表皮PDA—葡萄表皮YPD—石榴表皮YPD—李子表皮YPD—葡萄表皮豆芽汁—石榴表皮豆芽汁—李子表皮豆芽汁—葡萄表皮WL—石榴表皮WL—李子表皮WL—葡萄表皮总计稀释梯度10-3 35 91 51 21 120 133 17 123 47 18 110 37 27 137 29 996 10-4 4 40 17 4 98 73 3 93 13 8 87 17 2 87 13 559 10-5 2 16 10-6 1 1 6 5 3 2 0 1 1 8 47 1 60 15 1 22 1 3 4 6 7 1 6 1 0 1 5 2 2 2 0 2 318 1 0 9 8总计44 149 69 27 301 268 22 298 62 29 255 63 30 310 44 1 971
由表1可知，不同果皮来源的酵母分离需要的培养基不同，石榴果皮、李子果皮和葡萄果皮上酵母的分离需要的最佳培养基分别是麦芽汁培养基、WL培养基和PDA培养基。本研究只挑取10-3稀释度涂布板上的菌落，共996个单菌落，不同果皮获得的酵母数量不同，利用5种培养基从李子果皮挑取到的酵母数量最多，为581个，其次是葡萄表皮（297个），挑取到的酵母数量最少的是石榴表皮，仅有118个，根据形态从996个酵母菌落中选取669个单菌落用于后期试验。
2.2 TTC 法初步筛选
TTC显色筛选结果见表2。
表2 TTC 显色筛选结果
Table 2 Screening results of TTC chromogenic method
来源石榴表皮李子表皮葡萄表皮总菌株数95 374 200深红色菌株数83 328 191浅红色菌株数10 27 7白色菌株数2 19 2深红菌株占比/%87.37 87.70 95.50
由表2可知，3种水果皮上分离出的酵母菌经过TTC法筛选出深红色酵母菌株为83、328、191株，共602株，分别占总菌株数的87.37%、87.70%、95.50%，结果表明，葡萄表皮分离出的酵母中，呼吸酶活力强的菌株占比最高。
2.3 杜氏小管法二级筛选
从初步筛选出的602株菌中挑选出颜色更为深红的204株，杜氏小管法比较产气性能，结果见表3。
表3 不同菌株的杜氏发酵情况
Table 3 Duchenne fermentation of different strains
来源石榴表皮李子表皮葡萄表皮测试菌株数41 135 28产气相对体积占比/%≤25 13 31 4≤50 4 19 2≤75 8 20 1≤100 16 65 21起酵优良菌株占比/%68.29 77.04 85.71香气较淡16 62 9淡浓13 34 8 12 39 11
由表3可知，石榴表皮来源的41株酵母中有28株起酵优良（产气量占杜氏小管体系一半以上），发酵液气味浓的有12株，且这12株且均属于起酵优良菌株；李子表皮来源的135株酵母菌中有104株具起酵优良特性，39株发酵液呈浓香味，其中37株兼有起酵优良和香气浓郁特性；葡萄表皮来源的28株酵母菌有24株起酵优良，其中11株的发酵液具浓香味兼有起酵优良特性。通过杜氏小管发酵法共筛选出起酵速度快且香味浓郁的酵母60株，选择来源于葡萄表皮的11株酵母（命名为Y1～Y11）进行后续研究。
2.4 ‘巨峰’葡萄酒的基本理化指标分析
13 株酵母发酵葡萄酒的基本理化指标见表4。
表4 不同酵母菌发酵‘巨峰’葡萄酒的基本理化指标
Table 4 Basic physicochemical indicators of 'Kyoho' grape wine fermented with different yeast strains
注：同列不同小写字母表示不同样品间差异显著（P＜0.05）。
酒样RW SY Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 Y11总糖含量/（g/L）10.60±0.14d 16.05±0.21a 10.90±0.17d 8.20±0.09f 7.20±0.11fg 12.10±0.12c 7.20±0.17fg 4.90±0.09h 13.80±0.21bc 15.60±0.21ab 9.80±0.20de 14.00±0.23b 11.00±0.28d还原糖含量/（g/L）4.30±0.04ef 10.15±0.14ab 8.30±0.25c 5.20±0.14e 3.00±0.07f 3.20±0.01g 4.10±0.02ef 3.50±0.06f 7.70±0.04cd 8.80±0.08c 6.40±0.15d 12.40±0.12a 4.80±0.19e还原糖占比/%40.57 63.24 76.15 63.41 41.67 26.45 56.94 71.43 55.80 56.41 65.31 88.57 43.64乙醇含量/%12.62±0.10def 12.74±0.49def 12.65±0.20def 12.58±0.16ef 13.15±0.05abc 12.89±0.18cde 13.31±0.13ab 12.46±0.08f 13.45±0.20a 12.46±0.11f 13.23±0.23abc 12.99±0.33bcd 6.53±0.23g pH 值3.71±0.04c 3.58±0.02d 4.06±0.08a 3.86±0.09b 3.89±0.04ab 3.98±0.06ab 3.81±0.04b 4.08±0.02a 3.93±0.06ab 3.82±0.04b 3.81±0.02b 3.95±0.06ab 4.06±0.08a总酸含量/（g/L）4.16±0.04b 4.48±0.02ab 2.70±0.07d 3.68±0.08c 4.07±0.07b 2.55± 0.01de 3.72±0.04c 2.94±0.03cd 2.70±0.02d 2.94±0.01cd 3.13±0.04cd 2.60±0.03de 4.78±0.08a总酯含量/（g/L）2.18±0.02b 2.04±0.04bc 2.29±0.09b 2.18±0.04b 2.18±0.06b 2.07±0.04bc 2.18±0.02b 2.07±0.03bc 2.18±0.09b 2.85±0.07a 2.74±0.05a 2.18±0.06b 1.96±0.04c
由表4可知，13种葡萄酒样中总糖含量为4.90～16.05 g/L、还原糖含量为3.00～12.40 g/L、还原糖占比为26.45%～88.57%、乙醇含量为6.53%～13.45%；2种对照菌株RW和SY发酵形成乙醇的能力差异不显著，而SY酒中总糖和还原糖含量显著高于RW酒，说明RW酵母分解糖形成乙醇外，形成其他代谢产物能力高于SY。自分离的11株酵母发酵酒中，Y3、Y5、Y7、Y9酒中乙醇含量显著高于2种对照酒，这4种酒中Y3和Y5中总糖含量显著低于2种对照酒，Y7和Y9总糖含量仅显著低于SY酒样，说明Y3和Y5菌株发酵糖的能力强于2种对照菌株，Y7和Y9发酵糖的能力仅显著高于SY菌株。Y4酒的总糖含量高于RW酒，而还原糖含量显著低于RW酒，与对照相比，Y4酒中糖主要是非还原糖，还原糖含量较少，仅占26.45%，可能是Y4菌株能分泌菌多糖的能力强或者利用多糖能力弱。Y10酒中总糖含量和还原糖含量与Y4酒的两种糖含量相反，Y10酒中主要是还原糖，占88.57%。Y1～Y11酒的pH值均显著高于2种对照酒；除Y3和Y11酒的总酸含量与对照酒差异不显著外，其他9种酒的总酸含量均显著低于2种对照酒，说明这9种酵母的降酸能力较好。酯类赋予果酒香味，影响酒体品质，Y8和Y9酒中总酯含量显著高于2种对照酒，其他8种酒中总酯含量与对照酒差异不显著。
2.5 ‘巨峰’葡萄酒颜色与酚类物质分析
颜色是葡萄酒重要感官指标，色度反映酒的呈色强度，色调体现酒的成熟度[24]，色调值大，黄色比例大，红色比例小，趋向于经过陈酿后颜色，说明成熟度高。不同酵母发酵酒颜色及呈色相关指标见表5。
表5 不同酵母菌发酵‘巨峰’葡萄酒颜色与酚类物质
Table 5 Color parameters and phenolic contents of 'Kyoho' grape wine fermented with different yeast strains
注：同列不同小写字母表示不同样品间差异显著（P＜0.05）。
酒样RW SY Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 Y11色度0.59±0.04cd 0.63±0.02c 0.67±0.03c 0.34±0.04e 0.51±0.07d 0.65±0.02c 0.86±0.04a 0.49±0.03d 0.68±0.07c 0.79±0.05b 0.61±0.06c 0.62±0.05c 0.67±0.03c色调1.66±0.09d 1.66±0.11d 1.76±0.12c 1.79±0.06c 1.85±0.07c 1.75±0.06c 2.03±0.05b 3.50±0.07a 1.86±0.09bc 1.69±0.08d 1.82±0.05c 1.62±0.04d 1.94±0.06bc总酚含量/（mg/L）102.78±7.76b 114.96±5.27a 85.23±2.41de 67.61±8.97f 83.70±4.80de 77.45±1.80e 88.49±0.47d 57.14±7.75g 81.99±1.28de 101.82±4.99b 98.64±8.16bc 101.72±3.71b 89.88±4.30cd单宁含量/（mg/L）234.61±2.93de 405.03±11.82a 254.06±10.84cd 182.94±6.14g 216.56±5.29ef 199.06±5.55fg 244.06±7.56cd 146.56±10.84h 233.78±12.73de 340.72±8.35b 261.56± 28.65c 322.11±20.57b 215.72±11.71ef总花色苷含量/（mg/L）3.51±0.29b 2.56±0.14c 0.48±0.02f 2.11±0.19d 1.34±0.01e 1.50±0.17e 2.34±0.17cd 9.46±0.10a 2.56±0.18c 2.62±0.10c 0.45±0.07f 3.67±0.17b 1.34±0.01e
由表5可知，2种对照酒的色度和色调差异不显著；Y5和Y8酒色度显著高于对照酒，而Y2酒色度显著低于对照酒，其他酒样色度与对照酒的色度差异不显著；除了Y8和Y10酒色调与对照酒差异不显著外，其他酒样色调均显著高于对照酒。除了Y8和Y10酒中总酚含量与RW酒差异不显著外，其他酒样中总酚含量均低于2种对照酒；自分离的11个菌株发酵酒中单宁含量均低于SY酒，Y2、Y4、Y6酒中单宁含量显著低于RW酒，Y8、Y9、Y10酒中单宁含量显著高于RW酒，其他酒样与RW酒差异不显著；仅有Y6中总花色苷含量高于对照酒，Y10与RW，Y5、Y7、Y8与SY中总花色苷含量差异不显著外，其他酒中总花色苷含量均低于2种对照酒。
指标的相关系数见表6。
表6 指标的相关系数
Table 6 Correlation coefficients of indexes
注：*表示显著相关（P＜0.05），**表示极显著相关（P＜0.01）。
项目色度色调总酚含量单宁含量总花色苷含量色度1色调-0.239 1总酚含量0.471-0.673*1单宁含量0.438-0.549 0.879**1总花色苷含量-0.247 0.828**-0.408-0.266 1
由表6可知，酚类物质、单宁和花色苷在呈色和陈酿潜力上发挥作用，色度与总酚含量、单宁含量呈正相关，与色调、总花色苷含量呈负相关，但都不显著，说明酒中呈色物质还有其他有色成分。色调与总酚含量、单宁含量呈负相关，尤其与总酚含量呈显著负相关，而与总花色苷含量呈极显著正相关。总酚含量与单宁含量呈极显著正相关，总酚含量和单宁含量均与总花色苷含量呈不显著负相关性，说明酒样总酚含量与单宁含量变化趋势相似，酚类物质中以单宁为主。
2.6 不同酵母发酵‘巨峰’葡萄酒的IS 分析
IS是对葡萄酒味感平衡进行数字化衡量的指标，IS＜5说明酒体瘦弱粗重，5≤IS＜6说明酒样较为柔和，IS≥6表明丰满圆润，口感平衡[27]。不同酵母对发酵‘巨峰’葡萄酒IS的影响见图1。
图1 不同酵母对发酵‘巨峰’葡萄酒IS的影响
Fig.1 Effects of different yeast strains on IS of fermented'Kyoho' grape wine
由图1可知，除了Y11外，其他10种酒样的IS均大于6且高于2种对照酒，其中Y4、Y7和Y10酒的IS超过10，说明这10种果酒平衡感好，丰满圆润。
2.7 酵母的分子鉴定
将发酵‘巨峰’葡萄酒IS超过10的3株酵母Y4、Y7和Y10进行分子鉴定，扩增的ITS序列分别为665、755、659 bp，进行BLAST相似性比对，选取相似度最高的进行进化树构建，结果见图2。
图2 根据ITS基因序列构建3种酵母菌株系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of three yeast strains based on ITS sequences
Debaryomyces hansenii 为汉逊德巴利酵母；Debaryomyces nepalensis 为尼泊尔德巴利酵母；Trichoderma citrinoviride 为橘绿木霉；Acrophialophora fusispor 为梭孢顶孢霉；Rhinocladiella sp.为喙枝孢属物种；Exophiala lacus 为湖外瓶霉；Hanseniaspora sp.为汉逊酵母属物种；Hanseniaspora uvarum 为葡萄汁有孢汉逊酵母。
由图2可知，Y4及Y10与汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、尼泊尔德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis）聚为一支，亲缘关系较近，Y4和Y10与汉逊德巴利酵母相似性分别为100%和99.84%；Y7与葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）聚为一支，亲缘关系较近，同源性为99.59%。
3 结论
不同来源酵母需要不同分离培养基分离培养，富集液稀释10-3后涂布，菌落分布较为均匀，适合挑取菌落；从平板上挑选669个菌落，TTC培养基上颜色较深红色酵母602个，杜氏发酵法性能比较获得60株具有起酵速度快且发酵液香味浓的菌株。根据显微镜下形态观察和预试验，选出11个更优异菌株酿造‘巨峰’葡萄酒。所有酵母包括RW和SY菌株酿造的葡萄酒均为浅红色，葡萄酒的12项指标比较分析结果表明，不同菌株在不同指标上都有各自的应用发酵潜力，乙醇产生能力较强的菌株有Y3、Y5、Y7、Y9，除Y3和Y11菌株外，其他9个菌株的降酸能力强于对照，Y8和Y9产酯能力高于对照，Y5和Y8菌株发酵酒的色度和色调均较为突出，优于对照；Y6形成花色苷能力最强。除了Y11外，其他10种酒的IS均大于6且高于两种对照酒的IS，尤其是Y4、Y7和Y10酒的IS超过10，表明葡萄酒品质柔和、丰满度好、口感平衡。根据ITS序列比对结果构建进化树，Y4和Y10与汉逊德巴利酵母相似性分别为100%和99.84%，Y7与葡萄汁有孢汉逊酵母同源性为99.59%。
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