草莓酿造酒是一种低酒精饮料，其保留部分草莓水果风味和橙红的颜色，富含多酚、类黄酮等生物活性物质[1]，深受广大消费者的喜爱。草莓果酒的研发与生产加工能够提升草莓产品的附加值，为解决草莓鲜果过剩和深加工不足的问题提供了新策略。在草莓酒酿造加工过程中通常只使用商业化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.c）进行接种发酵，其具有发酵完全、重复性好、酒精产率高并可抑制杂菌生长等优点[2]。然而，仅依靠单一种类的酿酒酵母进行果酒酿制，果酒风格呈现单一、风味缺乏复杂性与典型特征[3]。近年来，大量研究将非酿酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）与酿酒酵母联合使用，发挥每种酵母的酿造特性和优势，可提升苹果酒[4]、猕猴桃酒[5]、黄桃酒[6]等果酒的品质，尤其是香气特征。然而，目前关于此类混合发酵对果酒中抗氧化成分及其活性影响的研究鲜见。
非酿酒酵母是一类自然存在于果园土壤、果树、果实表面或酿酒环境中可参与果酒发酵的微生物，虽然这类酵母对高乙醇浓度和低pH值环境的耐受性较差，但果酒发酵过程中，可以产生更高活力的糖苷酶、果胶酶、脂肪酶等，且作用底物的范围更广[7]。通过酶促反应能促使发酵体系中香气前体物质分解，生成酯类、醇类、萜烯类等风味成分，并且释放甘露糖蛋白或多糖，增加甘油含量等，有助于提高果酒的感官品质[8]。
果皮中的结合态糖苷（包括单糖苷和双糖苷）大多以无味且不易挥发的形式存在，仅在酸解或酶解的作用下才能转化为游离态，赋予果酒特有的风味，从而体现果酒品质特征和特色典型的品种香气[9]。参与水解这类香气前体物的酶主要包括β-D-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶和β-D-木糖苷酶等[10]。这些糖苷酶酶活性影响果酒中香气成分的数量和含量，进一步影响果酒的感官品质。此外，非酿酒酵母参与混菌发酵分泌的酶还可促进果酒中多酚类物质的产生、提高果酒的色泽鲜艳度和抗氧化活性。如在赤霞珠葡萄酒发酵时添加非酿酒酵母马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus，K.marxianus）的粗酶提取物，发现葡萄酒中的多酚含量增加了28%，而添加商业果胶酶后多酚含量仅增加15%[11]。
本文通过对比德尔布有孢圆酵母（Torulapora delbrueckii，T.d）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，M.p）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe，S.p）、陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola，I.t）4种非酿酒酵母的发酵特性（糖苷酶酶活性以及对葡萄糖、柠檬酸、乙醇、二氧化硫的耐受力），进一步评估4种非酿酒酵母与酿酒酵母顺序接种混菌发酵对草莓果酒的色差值、抗氧化成分、抗氧化活性与感官品质的影响，以期为草莓酒品质提升提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料
草莓：“红颜”品种，采摘于安徽省合肥市包河区大圩镇；酿酒酵母（S.c）、葡萄酒果酒专用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；德尔布有孢圆酵母（T.d）：法国Laffort公司；美极梅奇酵母（M.p）、粟酒裂殖酵母（S.p）、陆生伊萨酵母（I.t）：中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 主要试剂
焦亚硫酸钾（食品级）：意大利Enartis公司；果胶复合酶：法国Laffort公司；蔗糖（食品级）：广州福正东海食品有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]（均为分析纯）：美国Sigma-Aldrich公司；对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、对硝基苯基-α-L-阿拉伯糖苷、对硝基苯基-α-L鼠李糖苷、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷、对硝基苯基-β-D-木糖苷（均为分析纯）：上海毕得医药科技股份有限公司；酵母浸粉：江苏艾康生物医药研发有限公司；福林酚、葡萄糖、酚酞（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SPX-150B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HNY-2102C智能恒温培养振荡器：天津欧诺仪器股份有限公司；YK-DH500恒温培养箱：北京中兴伟业仪器有限公司；CR-400/410型色彩色差仪：日本美能达公司；TU-1950紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；PEN 3.5型电子鼻：德国Airsense公司。
1.3 试验方法
1.3.1 酵母活化
菌种接种到酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基（酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH6.0，115 ℃湿热灭菌20 min）中，于恒温培养振荡器中26 ℃、200 r/min活化24 h。
1.3.2 草莓果酒发酵工艺
试验设计：采用顺序接种方式，分别先接种非酿酒酵母（T.d、M.p、S.p、I.t），24 h后再接种酿酒酵母（S.c）（接种体积比为1∶1），分别记作T.d+S.c组、M.p+S.c组、S.p+S.c组和I.t+S.c组；纯种发酵作为对照组（S.c组）。
工艺流程：草莓称重→清洗、破碎、酶解（添加焦亚硫酸钾0.06 g/kg、果胶酶0.05 g/kg，酶解12 h）→调糖（用蔗糖将糖度调至22 °Brix）→接种不同处理组酵母→主发酵（22 ℃发酵直至结束）→过滤（采用80目滤网过滤）→陈酿（16 ℃下恒温培养箱内陈酿3个月）→澄清→成品酒[12]。
1.3.3 糖苷酶酶活性的测定
采用对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）方法分析4种非酿酒酵母（T.d、M.p、S.p和I.t）的5种糖苷酶（β-D-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶和β-D-木糖苷酶）酶活性。以p-NP浓度为横坐标，吸光度（OD400 nm）为纵坐标，绘制标准曲线（y=14.557x+0.015 3，R2=0.999 5）。糖苷酶酶活性的测定参考马得草[13]的方法，酶活性单位（U）定义为pH5.0、50 ℃条件下，1 min内水解对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、对硝基苯基-α-L-阿拉伯糖苷、对硝基苯基-α-L鼠李糖苷、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷或对硝基苯基-β-D-木糖苷催化生成1 μmol p-NP所需酶量。
1.3.4 酵母菌株耐葡萄糖、柠檬酸、乙醇和SO2能力测定
将各酵母菌株分别接种于含有不同葡萄糖浓度（50、100、150、200、300、350 g/L）、柠檬酸浓度（15、20、25、30、35、40 g/L）、乙醇浓度（3%、6%、9%、12%、15%、18%）和SO2浓度（50、100、200、300、400、450 mg/L）的YPD液体培养基中，摇床（28 ℃、180 r/min）培养24 h，采用紫外可见分光光度计测定600 nm处吸光度。每个浓度设置3个平行。
1.3.5 色差值测定
利用色彩色差仪测定草莓果酒的L*（明亮度）值、a*（红绿色）值、b*（黄蓝色）值，草莓果酒的饱和度（C*）值和色调（h）值计算公式如下。
1.3.6 抗氧化指标的测定
总酚含量采用福林酚法测定[14]；总黄酮含量参考时宽芹[15]的方法测定；总花色苷含量采用pH示差法[14]测定；DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率参考Wang等[16]的方法测定。
1.3.7 电子鼻分析
取5 mL草莓果酒置于40 mL顶空瓶中密封，室温静置5 min后插入电子鼻探头，测定挥发性香气物质。参数设置：采样间隔1 s、冲洗时间150 s、调零时间5 s、预采样时间5 s、检测时间120 s、载气流速300 mL/min、进样流速300 mL/min。每个样品设置6个平行，选取稳定状态下的响应值进行分析。
1.3.8 感官评价
草莓果酒感官评价在安徽农业大学食品与营养学院感官评定室进行，评价小组由10名食品专业人员（3男7女）组成，评价小组接受20 h培训，包括描述词的筛选、参比样的选择及参比样强度的确定[17]。
草莓果酒于醒酒器中醒酒30 min，随后分装在125 mL专业果酒评酒杯中，每杯约20 mL，样品均采用三位数随机码进行标示。评价属性、定义及参照样按照表1制备，统一放置于50 mL一次性样品杯中提供给评价员进行嗅觉和味觉参考。采用15点线性标度，线段最左端为0，代表“没有”；最右端为15，代表“最强”。
表1 草莓果酒感官定量描述词汇与参比样
Table 1 List of sensory quantitative descriptors for strawberry wine and comparative samples
范畴香气对应强度9% = 12；3% = 6 5% = 13；1% = 3 12% = 8；6% = 4 9 6 1 2风味描述词甜香酸气乙醇香果香发酵香草莓香酸味甜味苦味果味乙醇味涩味定义类似蜂蜜的香甜气味乙酸带来的气味感受明显的乙醇香气熟透的水果所具有的的典型而浓郁的香气，一种甜香、花香的混合感带有糖发酵后的酒精味、醋味和过熟味成熟草莓果实的香气一种基本味觉，以柠檬酸为代表的酸性物质产生的特有感官属性一种基本味觉，以蔗糖为代表的甜味物质产生的特有感官属性一种基本味觉，以奎宁为代表的苦味物质产生的特有感官属性通常指额外的甜意，类似从新鲜浆果中尝到的乙醇的醇厚芳香，具有特殊的、令人愉快的香气，并略带刺激性一种化学刺激引起的口腔触觉，舌头或口腔产生粗糙、干燥、皱缩的感觉参比样蜂蜜食品级白醋食品级乙醇水果和蜜饯混合活化酵母粉草莓柠檬酸蔗糖盐酸奎宁溶液草莓汁乙醇溶液矾水溶液0.4% = 8 0.2% = 4；1% = 6 0.006% = 9；0.003% = 4 12 6% = 8 0.05% = 6
1.4 数据统计与分析
试验数据结果以平均值±标准差表示。方差分析采用SPSS statistics 22软件进行，Duncan检验进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。定量描述分析采用Panel Check 14.0软件分析数据。
2 结果与分析
2.1 酵母的糖苷酶酶活性分析
酵母中的糖苷酶酶活性及累积酶活性结果如图1所示。
图1 酵母中的糖苷酶酶活性及累积酶活性
Fig.1 Glycosidase activity and cumulative enzyme activity in various yeasts
（a）糖苷酶酶活性；（b）累积酶活性。不同小写字母表示同种糖苷酶酶活性在不同酵母中差异显著，P＜0.05。
由图1（a）可知，除了M.p，其他3株非酿酒酵母的β-D-葡萄糖苷酶酶活性均显著高于酿酒酵母S.c（P＜0.05）。除了非酿酒酵母I.t，其他3株非酿酒酵母的α-L-阿拉伯糖苷酶酶活性均显著高于S.c（P＜0.05）。此外，I.t的β-D-葡萄糖苷酶酶活性最高，比S.c高37.9%，而M.p的α-L-阿拉伯糖苷酶酶活性最高，比I.t高63.1%。4株非酿酒酵母的α-L-鼠李糖苷酶酶活性均显著高于S.c，但4株非酿酒酵母的β-D-半乳糖苷酶与β-D-木糖苷酶的酶活性上没有优势。由图1（b）可知，非酿酒酵母的糖苷酶酶活性均高于S.c，因此添加非酿酒酵母与S.c进行混合发酵，对于提高草莓果酒的风味具有积极意义[18]。
2.2 4 种非酿酒酵母的耐受性
4 株非酿酒酵母对葡萄糖、柠檬酸、乙醇和SO2的耐受性见图2。
图2 4种非酿酒酵母的耐受性
Fig.2 Tolerance of four non-Saccharomyces cerevisiae strains
（a）葡萄糖；（b）柠檬酸；（c）乙醇；（d）SO2。
由图2（a）可知，随着葡萄糖浓度的增加，4株非酿酒酵母的生长整体均受到一定程度的抑制，其中M.p和T.d的耐高糖性能较好。草莓果酒发酵一般在葡萄糖浓度为200 g/L左右进行[19]，此条件下这4株非酿酒酵母生长情况均良好。
由图2（b）可知，在柠檬酸浓度为15～40 g/L时，4株非酿酒酵母的生长未受到明显影响，尤其是M.p和S.p对于柠檬酸的耐受性要强于其他两株非酿酒酵母。在草莓果酒的生产中，有机酸主要来源于草莓原料，研究表明草莓中有机酸含量为9.0 g/L左右[20]，故4株非酿酒酵母均能满足草莓果酒的生产。
高乙醇浓度对酵母的生长和活力产生抑制作用，进而对发酵效果产生不良影响。由图2（c）可知，随着乙醇浓度的增加，4株非酿酒酵母的耐受能力逐渐减弱，当乙醇浓度超过9%后，4株非酿酒酵母的生长受到严重抑制。发酵初期，乙醇浓度较低，所以非酿酒酵母与S.c混菌发酵适合顺序发酵模式，以避免高浓度乙醇对非酿酒酵母的毒害抑制作用。
在果酒发酵中，SO2具有抑菌、防腐、护色等作用，由图2（d）可知，当SO2浓度低于300 mg/L时，4株非酿酒酵母均能良好生长。
综上所述，经过对4株非酿酒酵母的耐受性测试，它们均能够耐受250 g/L葡萄糖、40 g/L柠檬酸、9%乙醇以及300 mg/L SO2，结果表明这4株非酿酒酵母在草莓果酒酿造环境中具有良好的生存能力，能满足酿造要求。
2.3 色差值分析
不同酵母组合发酵草莓果酒的色差值见表2。
表2 不同酵母组合发酵草莓果酒的色差值
Table 2 Color difference value of strawberry wine fermented with different yeast combinations
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
组别S.c 组T.d+S.c 组M.p+S.c 组S.p+S.c 组I.t+S.c 组L*值82.44±1.19a 81.15±1.64bc 81.97±0.11ab 81.24±1.15bc 80.50±0.50c a*值22.09±1.08b 24.95±1.63a 21.78±0.88b 23.97±0.72a 24.48±0.83a b*值71.83±2.73b 77.11±2.05a 74.09±1.52b 73.79±4.35b 77.51±0.83a C*值75.16±2.77b 81.05±2.44a 77.23±1.58b 77.59±4.22b 81.29±1.00a h 值1.27±0.01ab 1.26±0.01bc 1.28±0.01a 1.26±0.02bc 1.26±0.01bc
由表2可知，与S.c组相比，非酿酒酵母T.d、I.t与S.c顺序接种发酵显著增加了草莓果酒的a*值，b*值和饱和度C*值（P＜0.05），且其余组别之间无显著差异（P＞ 0.05），各组L*值、h值之间的数据差异较小。有些非酿酒酵母的添加会使草莓果酒的颜色饱和度增加，这可能是因为添加非酿酒酵母，增加了果酒中的酚类物质。花青素在很大程度上决定了果酒的颜色。在果酒陈酿过程中，酒中的黄酮醇、黄酮-3-醇、酚酸等非花青素酚类化合物可与花青素形成复合物[21]，这进一步提升了果酒色泽的稳定性。
2.4 抗氧化成分含量及抗氧化活性分析
不同酵母组合发酵草莓果酒的抗氧化成分含量及抗氧化活性见图3。
图3 不同酵母组合发酵草莓果酒的抗氧化成分含量及抗氧化活性
Fig.3 Antioxidant component content and antioxidant activity of strawberry wine fermented with different yeast combinations
（a）总酚含量；（b）总黄酮含量；（c）总花色苷含量（d）抗氧化活性。不同小写字母表示同一指标不同草莓果酒差异显著，P＜0.05。
果酒的抗氧化能力与果酒中的总酚含量、总黄酮含量与总花色苷含量关联性较大，一般呈正相关关系[22]。多酚类物质具有苦味和涩味，是直接影响果酒品质和感官的重要化合物，也是主要的抗氧化物质。由图3（a）可知，添加非酿酒酵母显著提高了草莓果酒的总酚含量，可能是因为在酒精发酵过程中，非酿酒酵母产生的糖苷酶活性更高，酶能促进聚合态酚类化合物发生水解[23]，从而提高总酚含量。不同酵母组合发酵草莓果酒的总酚含量差异显著，S.p+S.c组总酚含量最高，其次是T.d+S.c组和M.p+S.c组。酵母代谢产物丙酮酸、乙醛等可以与酚类物质如花青素缩合形成更稳定的聚合色素，提高果酒色泽的稳定性 [24]。研究表明S.p菌株能代谢产生较多的丙酮酸[25]，有利于多酚物质的积累。
黄酮类物质在酒中有两种存在方式，即配糖体形式和游离态形式，β-葡萄糖苷酶可以水解以糖苷键形式存在的黄酮类物质，同时释放活性苷元[26]。由图3（b）可知，混菌发酵草莓果酒的总黄酮含量为151.59～180.8 mg/L，显著高于S.c组。这与Li等[27]发现与单一酿酒酵母发酵的猕猴桃酒相比，顺序发酵的猕猴桃酒总黄酮含量显著增加的结果一致。此外，S.p+S.c组总黄酮含量显著高于其余组别，其次是M.p+S.c组。
花色苷是一种天然色素，可通过与果酒中的类黄酮形成共价键或疏水相互作用而产生辅色效应，从而增强果酒颜色的稳定性；通常，花色苷含量越高，果酒色泽越饱和，其色度值也相应增加[28]。由图3（c）可知，添加非酿酒酵母后草莓果酒的总花色苷含量为7.88～11.04 mg/L，比S.c组高64.5%～130.5%。研究发现，T.d菌株可以释放大量甘露糖蛋白和多糖，从而减少酵母细胞壁对花色苷的吸收，故在果酒中保留了较高含量的花色苷[28]。
草莓果酒的抗氧化活性通过DPPH·清除率和ABTS+·清除率评价。由图3（d）可知，4株非酿酒酵母与S.c顺序接种发酵，均能显著提高草莓果酒的抗氧化活性，其中，DPPH自由基清除率提升较明显。此外，M.p+S.c组与S.p+S.c组草莓果酒的抗氧化活性显著高于其他组（P＜0.05），DPPH·清除率和ABTS+·清除率分别是纯种S.c发酵的1.86倍和1.09倍，且二者之间没有显著性差异（P＞0.05）。
2.5 不同酵母组合发酵草莓果酒的电子鼻分析
使用电子鼻评估不同酵母组合发酵草莓果酒的整体气味特征，并构建雷达图。对从各种果酒样品中获得的电子鼻数据进行线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA），结果见图4。
图4 不同酵母组合发酵草莓果酒的电子鼻分析
Fig.4 E-nose analysis of strawberry wine fermented with different yeast combinations
（a）雷达图；（b）线性判别分析图。*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异极显著，P＜0.01；***表示差异高度显著，P＜0.001。
由图4（a）可知，传感器W1S的响应强度最高，其次是W1W、W2S、W5S和W2W，而且5种样品在这5根传感器上的响应值存在显著性差异（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。相比于纯种发酵，混合发酵含有两个种类的酵母，是一个相对复杂的微生物体系。不同酵母菌在发酵的不同阶段发挥作用，通过菌株之间的相互作用，产生更多样化和更高浓度的香气物质，以改善果酒香气的丰富性和浓郁度，解决单菌种发酵造成的风味单调问题。由图4（a）可知，除了W3S传感器，混菌发酵的草莓果酒样品的电子鼻信号明显高于S.c单一菌种发酵的样品。
由图4（b）可知，LD1和LD2的累积贡献率为89.98%，表明它们几乎包含了样品的所有相关信息。此外，5种草莓果酒样品分别位于4个象限，表明它们的香气特征有明显的差异。M.p+S.c组、T.d+S.c组和I.t+S.c组位于第一主成分的正向，且距离较近，表明这3种草莓果酒的挥发性成分较类似。
2.6 感官分析
不同酵母组合发酵草莓果酒的定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）雷达图和主成分分析（principal component analysis，PCA）见图5。
图5 不同酵母组合发酵草莓果酒的QDA雷达图和PCA图
Fig.5 Radar plots of QDA and PCA plot of strawberry wine fermented with different yeast combinations
（a）QDA 雷达图；（b）PCA 图。*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异极显著，P＜0.01；***表示差异高度显著，P＜0.001。
由图5（a）可知，甜香、草莓香、水果香、酸气、果味和酸味在5种草莓果酒中存在显著性差异（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。与纯种S.c发酵草莓果酒相比，添加非酿酒酵母显著提高了草莓果酒的甜香、水果香、草莓香和果味，降低了酸味。尤其是M.p+S.c组表现出最高的甜香与草莓香强度。这表明它对草莓果酒的感官风味有积极影响。然而T.d+S.c组的酸气和发酵香强度较高，可能对感官品质产生不利影响。
PCA分析全面概括了采用不同酵母组合发酵草莓果酒的感官特征，PCA图能够涵盖整个感官风味体验，而不是仅关注样品的特定区别特性。由图5（b）可知，第一主成分占总方差的76.6%，S.c组和T.d+S.c组沿PC1与其他样本明显分离，说明这两个酒样与另外3个酒样的感官属性差异较大。其中S.c组样品具有明显的酸味和酒精味，T.d+S.c组样品酸气和发酵香较强。另一方面，M.p+S.c组位于第一象限，与水果香、甜香和草莓香密切相关，I.t+S.c组和S.p+S.c组处在第四象限，与草莓香、果味和甜味等感官属性更接近，这对草莓果酒的感官品质可能有积极的影响。虽然有研究表明T.d与S.c顺序接种发酵能提高果酒香气的复杂性，尤其是与纯种S.c相比能产生更高的果味特征[29]。本研究结果却发现，T.d酵母的引入虽然增加了水果香与果味，但同时也增加了酸气和发酵香。
3 结论
本文对比评估了4种非酿酒酵母（T.d、M.p、S.p和I.t）与S.c产糖苷酶的能力以及对发酵环境条件的耐受力，并分析4种非酿酒酵母与S.c混菌发酵对草莓果酒抗氧化活性和感官品质的影响。从累积酶活性看，4种非酿酒酵母产生的糖苷酶酶活性均高于S.c，其中I.t酵母产生的β-D-葡萄糖苷酶酶活性最高，M.p酵母产生的α-L-阿拉伯糖苷酶酶活性最高。在正常的发酵环境下，4种非酿酒酵母菌株均能正常生长。尤其是M.p，对高糖、高酸环境的耐受性较强。混菌发酵的草莓果酒中抗氧化成分含量和抗氧化活性均显著高于S.c组。M.p+S.c组和S.p+S.c组的抗氧化活性显著优于其他混菌发酵组。添加非酿酒酵母M.p、I.t混合发酵提高了草莓果酒的水果香、甜味和草莓香等宜人属性的强度，但T.d+S.c发酵草莓果酒则表现出更高的酸气。未来可以通过消费者偏好测试，筛选更适合生产草莓果酒的菌种组合。
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