刺梨（Rosa roxburghii Tratt）为蔷薇科蔷薇属植物，属于药食两用植物，含有丰富的多酚、三萜、超氧化物歧化酶、多糖等活性成分[1-2]。本课题组前期采用酵素化发酵工艺对刺梨鲜果进行深加工，通过酵母菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌混合发酵制得一种口感优良、保健作用强的刺梨酵素[3]，然而在发酵过程中，多种因素导致发酵液浑浊，絮状物过多，有杂质。刺梨酵素浑浊原因主要可能有3个方面：微生物、大分子物质以及金属离子浑浊沉淀[4]。1）刺梨酵素所用的发酵菌种酵母菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌在参与发酵的同时进行代谢繁殖，使发酵液组成成分和胶体平衡遭到破坏，微生物与刺梨中的酶类相互作用，产物或间接产物引起其中大分子物质之间的相互转化、分解及络合而使其浑浊；2）刺梨原料成分较复杂，多种单宁、果胶、蛋白质、酚类物质等成分在电离作用下会相互反应易形成大分子物质或络合其他物质而沉淀析出；3）刺梨中含有多种微量元素以及有机酸[5]，两者相互反应易形成不溶性盐类而产生沉淀；4）刺梨果经压榨后产生的细胞碎片进入了果汁等多种原因导致了刺梨酵素液体浑浊，影响整体美观性及经济价值。参照韦唯等[6]对刺梨果醋的外观评价，去除果汁中的悬浮物及不稳定的胶体，刺梨酵素良好感官品质应达到色泽金黄，组织形态澄清透明。
目前常用的澄清方法有自然澄清、机械澄清以及化学澄清[7]，自然澄清耗时长、澄清效果不理想，机械澄清会使果酒色香味损失较大，化学澄清效果相对较好，如使用硅藻土、壳聚糖、皂土、明胶、果胶酶[8]等物质进行果汁果酒类饮料的澄清。目前吴翔等[9]、Osorio-Macías等[10]、Zhong等[11]使用皂土、膨润土、壳聚糖对刺梨果酒、白葡萄酒、木瓜汁及葡萄酒进行澄清，结果表明这些澄清剂澄清效果较好。目前将鲜果加工后的副产物用作澄清剂已有一些文献报道，张宁波等[12]、沈王庆等[13]利用酿酒葡萄皮渣、柠檬渣对葡萄酒、甘蔗汁进行澄清，结果证实了澄清效果较好，葡萄酒、甘蔗汁透光率大于80%。刺梨发酵果渣是刺梨果实经活菌发酵后所剩下的固态部分，包括果皮、果肉、果籽、果梗等，且刺梨鲜果经发酵后产生的果渣，相较于直接产生的果渣的废渣状，更易于凝集成表面带孔的带刺颗粒状，在物理性质上空间结构更易于吸附刺梨酵素中漂浮的杂质。
本文以刺梨发酵果渣、壳聚糖、壳聚糖+刺梨发酵果渣、硅藻土、硅藻土+刺梨发酵果渣作为刺梨酵素的澄清剂，以透光率为第一指标，总酸、总酚、可溶性固形物、维生素C含量保留率为第二指标，筛选出对刺梨酵素具有较好澄清作用的澄清剂，以期为新型绿色澄清剂的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与设备
1.1.1 材料与试剂
刺梨：市售；发酵剂：贵州省天然产物研究中心实验室自制（其中酵母菌、乳酸菌、醋酸杆菌的质量比为1∶1∶1）；水溶性壳聚糖（食品级，淡黄色粉末，pH3.67、水分含量8.9%、灰分含量＜0.1%、黏度23%、密度0.39 g/m3，主要成分有脱乙酰度≥85.0%，质量符合标准）：山东铭盛生物科技有限公司；硅藻土（食品级，粉末，pH6.6、渗透率0.055、振实密度0.40 g/m3，主要成分为二氧化硅及水可溶物）：吉林天元药业有限公司；没食子酸标准品（纯度≥99.7%）、抗坏血酸标准品（纯度≥99.9%）：中国食品药品检定研究所；碳酸钠、福林酚、0.1 mol/L NaOH溶液、酚酞指示剂（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.1.2 主要仪器与设备
紫外可见分光光度计（Cary60）：美国安捷伦公司；双光束紫外可见分光光度计（HP-8453）：惠普公司；测糖仪（PAL-1）：深圳市雅戈科技有限公司；高速离心机（5430 r）：艾本德（上海）国际贸易有限公司。
1.2 刺梨酵素及发酵果渣的制备
1.2.1 工艺流程
刺梨鲜果→清洗→破碎→接种→酵素化发酵→过滤→成品。
1.2.2 操作要点
1）清洗：挑选品质优良的刺梨鲜果，用清水清洗干净后晾干、称质量。
2）破碎：破碎后按照1∶3（g/mL）的比例加水备用。
3）接种：将酵素发酵剂（酵母菌∶乳酸菌∶醋酸杆菌的质量比为1∶1∶1）采用温水活化后，按照0.02%的质量分数添加，搅拌均匀后移至发酵间。
4）酵素化发酵：添加质量分数为10% 的蔗糖，在（25±2） ℃恒温下有氧发酵20 d，期间每隔3 d搅拌一次，待固形物含量为7%～8%，pH值为4左右完成发酵[14]。
5）过滤：以上步骤得到的发酵物通过300目滤网过滤，得到的上清液为果醋，固态部分（包括果皮、果肉、果籽、果梗等）为刺梨发酵果渣，将果渣烘干至恒重，用作后续澄清剂原料。
1.3 澄清试验方法
1.3.1 澄清剂配制
1% 壳聚糖溶液：精密称取6.5 g羧甲基化的水溶性壳聚糖溶于650 mL去离子水中，搅拌至全部溶解、备用[15-16]。
1.3.2 澄清剂筛选试验
以750 mL刺梨酵素为澄清原液，共78份，分为自然澄清组（N）、1%壳聚糖组（K）、1%壳聚糖+刺梨发酵果渣组（KG）、刺梨发酵果渣组（GZ）、硅藻土组（G）、硅藻土+刺梨发酵果渣组（GG），自然澄清组不添加澄清剂，其他组澄清剂添加量见表1。
表1 澄清剂筛选试验设计
Table 1 Experimental design of clarifiers
刺梨发酵果渣添加量/g 0.00 15.00 30.00 45.00 60.00 75.00 1%壳聚糖添加量/g 0.00 14.00 28.00 42.00 56.00 70.00 1%壳聚糖+刺梨发酵果渣添加量/g 0.00+0.00 7.00+7.50 14.00+15.00 21.00+22.50 28.00+30.00 35.00+37.50硅藻土添加量/g 0.00 1.50 1.65 1.80 1.95 2.10硅藻土+刺梨发酵果渣添加量/g 0.00+0.00 0.75+7.50 0.82+15.00 0.90+22.50 0.97+30.00 1.05+37.50
分别按不同剂量添加澄清剂，用保鲜膜密封，静置澄清7 d，将静置澄清后的澄清液盛放于25 mL具塞试管中，肉眼观察对比其色泽透明度，测定透光率，筛选出透光率最好的添加量组，用于总酸、总酚、可溶性固形物、维生素C含量的检测。
1.4 理化指标测定方法
1.4.1 透光率检测
透光率用紫外可见分光光度计于625 nm处进行检测[17-18]。
1.4.2 可溶性固形物含量检测
可溶性固形物含量使用测糖仪检测，检测前吸取纯净水进行调零，吸取待测液体2～3滴于镜面并记录可溶性固形物含量以及监测温度，根据可溶性固形物含量温度矫正表进行校正后得出最终值[19]。
1.4.3 总酚含量检测
根据T/GZCX 020—2022《刺梨及其制品中总酚含量的测定》，以没食子酸含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，于波长760 nm处测定吸光度，得回归方程Y=8.456X+0.129 6，相关系数R2=0.995 2，以没食子酸标准曲线计算刺梨酵素中总酚含量[20]。
1.4.4 总酸含量测定
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》理化分析中总酸的测定方法测定总酸含量，总酸含量以酒石酸计，计算公式如下[21]。
式中：X为样品中总酸的含量，g/L；C为氢氧化钠标准滴定液浓度，mol/L；V1为样品消耗氢氧化钠标准滴定液的体积，mL；V0为空白消耗氢氧化钠标准滴定液的体积，mL；V2为吸取样品的体积；mL；75为酒石酸的摩尔质量，g/mol。
1.4.5 维生素C含量检测
根据文献[22]方法进行检测，以抗坏血酸浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，于波长267 nm处测定吸光度，得回归方程Y=0.089 2X+0.246 4，相关系数R2=0.992 2，以抗坏血酸标准曲线计算刺梨酵素中维生素C含量。
1.5 数据处理
以上试验重复进行3次，采用SPSS 2020对数据进行差异性显著性分析，Origin 2021绘图。
2 结果与讨论
2.1 不同澄清剂对刺梨酵素澄清效果的影响
挑选肉眼观察不同澄清剂对刺梨酵素澄清效果最优组进行比较，结果如图1所示。
图1 不同澄清剂对刺梨酵素澄清效果的影响
Fig.1 Clarification performance of different clarifiers for Rosa roxburghii fruit ferment
GZ 为刺梨发酵果渣添加量30 g；G 为硅藻土添加量1.50 g；GG 为硅藻土+刺梨发酵果渣添加量（0.75±7.50） g；K 为1%壳聚糖添加量28.00 g；KG 为1%壳聚糖+刺梨发酵果渣添加量（14.00±15.00） g。
由图1可知，刺梨发酵果渣组色泽呈淡黄较透明，相较于自然澄清组澄清效果较明显；硅藻土组、硅藻土+刺梨发酵果渣组整体色泽在淡黄与暗黄之间且不透明，澄清效果较差；壳聚糖组、壳聚糖+刺梨发酵果渣组呈较好的亮黄色且透明，感官较好。自然澄清组色泽呈暗黄不透明，整体澄清效果偏差。综上，从感官观察得刺梨酵素澄清效果：壳聚糖+刺梨发酵果渣组、壳聚糖组＞刺梨发酵果渣组＞硅藻土+刺梨发酵果渣组、硅藻土组＞自然澄清组。
2.2 不同澄清剂对刺梨酵素透光率的影响
不同澄清剂添加量对刺梨酵素透光率的影响如图2所示。
图2 不同澄清剂的相应浓度对刺梨酵素透光率的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of clarifiers on the light transmittance of Rosa roxburghii fruit ferment
不同小写字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。A. 刺梨发酵果渣组（GZ）；B. 1%壳聚糖组（K）；C. 为硅藻土组（G）；D. 1%壳聚糖+刺梨发酵果渣组（KG）；E. 硅藻土+刺梨发酵果渣组（GG）。
由图2可知，自然澄清组刺梨酵素透光率最低为47.72%，由图2A可知，刺梨发酵果渣组（GZ）添加量在30.00 g时，透光率达到最大，为85.45%，随着果渣添加量继续增加，透光率先下降后增加，可能是由于果渣在45.00 g时添加量过大导致过多的果渣屑分散在酵素中从而透光率达最低，随着果渣添加量继续增加，残渣沉降在底部或被吸附而使透光率增大。研究表明，果渣中含有大量的多糖类高分子化合物官能团可吸附微生物发酵降解后漂浮在果醋中的小分子物质，具有较好的吸附澄清作用，但果渣在发挥吸附作用的同时也在吸水膨胀，造成原料损失，因此果渣添加量不宜过多[23-24]，综合考虑果渣添加量为30.00 g较好。由图2B可知，1% 壳聚糖添加量为28.00 g时刺梨酵素透光率达到最大，为93.78%，澄清效果达到最好；随着壳聚糖添加量继续增大，透光率整体下降。研究表明，水溶性壳聚糖是阳离子絮凝剂，可与单宁、果胶、蛋白质等带负电荷物质凝聚、沉淀[25]；但壳聚糖超过一定量时反而使果酒澄清度下降，这可能由于壳聚糖本身也是增稠剂，过量的壳聚糖溶解于酵素中会形成相对稳定的絮凝体系而不利于发挥澄清作用[26]。由图2C可知，在硅藻土添加量为1.50 g时透光率达到最高，为76.22%，随着添加量继续增加，透光率整体降低，研究表明硅藻土主要带负电荷[27-28]，能吸附液体中相反电荷的杂质粒子[29]，而引起刺梨酵素浑浊的物质大多是一些带负电的胶体以及蛋白质，对此的吸附能力并不是很好，而且硅藻土中含有一些金属元素，会造成液体的不稳定性。由图2D可知，1% 壳聚糖+刺梨发酵果渣添加量在（14.00+15.00） g时透光率达到最大，为93.73%，随着添加量继续增加，透光率逐整体低。由图2E可知，硅藻土+刺梨发酵果渣添加量在（0.75+7.50） g时透光率达到最大（78.39%），随着添加量继续增加，透光率整体降低。
综上，自然澄清组透光率为47.72%，1%壳聚糖组（K）、1% 壳聚糖+刺梨发酵果渣组（KG）、刺梨发酵果渣组（GZ）、硅藻土组（G）、硅藻土+刺梨发酵果渣组（GG）添加量分别在28.00、（14.00+15.00）、30.00、1.50、（0.75+7.50） g，刺梨酵素透光率达到最大，分别为93.78%、93.73%、85.45%、78.39%、76.22%，硅藻土组（G）、硅藻土+刺梨发酵果渣组（GG）刺梨酵素透光率小于80.00%，不适合用作刺梨酵素的澄清剂。
2.3 不同澄清方式对刺梨酵素营养物质的影响
澄清方式对刺梨酵素营养物质的影响如图3所示。
图3 澄清方式对刺梨酵素营养物质的影响
Fig.3 Effects of clarification methods on the nutrient content in
Rosa roxburghii fruit ferment
不同小写字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。A. 总酸含量；B. 总酚含量；C. 可溶性固形物含量；D. 维生素C 含量。
由图3可知，本试验采用的刺梨酵素是以刺梨为原料通过酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、纤维素酶复合发酵而成，其营养成分总酸、总酚和维生素C含量分别为1.54、1.34、469.20 mg/mL，可溶性固形物含量为4.27%。由图3A可知，刺梨酵素总酸含量顺序为N＞GG＞KG＞G＞K＞GZ，总酸含量保留率均大于85%。由图3B可知，刺梨酵素总酚含量顺序为N＞K＞GZ＞KG=G＞GG，总酚含量保留率均大于95%。由图3C可知，刺梨酵素可溶性固形物含量顺序为GG＞GZ＞KG＞G＞N＞K，可溶性固形物含量保留率均大于95%，且含有果渣澄清剂的刺梨酵素中可溶性固形物含量增加，可能是由于刺梨果渣本身也含有丰富的多糖、多酚、维生素C[30-31]，浸泡在刺梨酵素中时，果渣中的一些可溶性固形物溶解于刺梨酵素中所致。由图3D可知，刺梨酵素维生素C含量顺序为N＞G=GG＞GZ＞K＞KG，维生素C含量保留率分别为100%、97.61%、97.61%、86.78%、79.13%、67.51%。因此，5种澄清剂对刺梨酵素中总酸、总酚、可溶性固形物含量影响较小，对维生素C含量影响较大，KG组澄清剂刺梨酵素的维生素C含量损失较大，不适合作刺梨酵素的澄清剂使用。
3 结论
本研究探究5种澄清剂对刺梨酵素的澄清效果，通过透光率作为筛选刺梨酵素澄清剂的第一指标，1%壳聚糖组（K）、1% 壳聚糖+刺梨发酵果渣组（KG）、刺梨发酵果渣组（GZ）添加量分别在28.00、（14.00+15.00）、30.00 g时，刺梨酵素透光率超过80%，分别为93.78%、93.73%、85.45%，3种均可作为刺梨酵素的澄清剂使用；通过总酸、总酚、可溶性固形物、维生素C含量作为筛选刺梨酵素澄清剂的第二指标，1%壳聚糖组（K）、1% 壳聚糖+刺梨发酵果渣组（KG）、刺梨发酵果渣组（GZ）对刺梨酵素中总酸、总酚、可溶性固形物含量影响较小，维生素C含量保留率分别为79.13%、67.51%、86.78%，只有刺梨发酵果渣组（GZ）维生素C含量保留率大于80%。综合分析，刺梨发酵果渣可作为刺梨酵素的澄清剂使用。
刺梨发酵果渣是刺梨鲜果经发酵后产生的果渣，将它开发成一种绿色环保的澄清剂，一方面为刺梨副产物的综合利用实现绿色、可持续的全产业发展模式提供一定的理论参考和实际应用价值；另一方面为新型绿色澄清剂的开发提供一种新的研究方向，后续将对刺梨发酵果渣的澄清条件进行优化，澄清机理进行研究，旨在为新型绿色澄清剂的开发提供理论基础。
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