米酒是世界上著名的酿造酒之一，是我国独有的酒种，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[1]。米酒是以糯米为主要原料，利用微生物发酵酿制的有一定酒精度的饮品，其酒精度低，富含蛋白质、多糖、多酚、氨基酸[2]等营养物质，米酒的酒精含量一般为14% vol～20% vol，属于低度酿造酒，长期微量饮用有益于人体健康，现在越来越受到广大消费者的喜爱，在业界被称为“液体蛋糕”[3-4]。目前，米酒产业呈差异化发展，传统米酒与现代米酒协同发展。传统米酒的文化底蕴深厚、风味独特、发展前景良好，但因其室外发酵的模式可能会引起品质不够稳定和风味不够丰富的问题[5]。米酒产业需要在保留传统酿造工艺的基础上，结合现代科学手段来完善传统米酒的风味特色，以保持传统米酒品质的稳定性，进一步优化其风味特色，更好地传承和发扬传统工艺，让“传统”更“经典”[6]。近年来，我国米酒产业发展较快，尤其是北方地区。随着米酒产业的快速发展，一系列问题也逐渐浮现，亟待解决。为了进一步提升米酒品质，研究人员围绕酿造原料、酒曲、加工工艺等多方面开展了新的探索[7]。
在酿酒工业中，酵母菌是整个发酵过程中的优势菌种，它在很大程度上决定了酒的品质，非酿酒酵母同样也起着非常重要的作用[8]。由于米酒酿造采用半开放式发酵模式，发酵初期酵母迅速进入对数生长期，细胞数量呈指数级增长。该阶段的快速扩增有助于酵母在微生态系统中占据优势地位，有效抑制乳酸菌、醋酸菌等杂菌的生长，从而降低发酵早期酸败的发生概率，维持发酵过程的稳定，保障产品品质[9-10]。为了与酵母的生长模式相匹配，通常情况下，将米酒酿造分成两个发酵阶段，分别是在28～30 ℃的前发酵阶段和15～20 ℃的低温长时间后发酵阶段[11-12]。在后发酵过程中，低温有利于减少酵母菌的代谢活动，使其产生香味，改善黄酒的口感[11]。米酒发酵采用同步进行糖化和发酵的“双边发酵”技术，可以有效避免发酵醪液中糖分浓度较高对酵母生长发酵的抑制作用，从而实现高效的高菌体浓度、高底物浓度的发酵过程[1，12]。在高浓度发酵过程中，微生物的生理代谢过程与一般的发酵过程有着明显不同，而这些不同也会对酒的风味物质和香气特点产生一定影响。在不同的发酵阶段，酵母菌的发酵性能在一定程度上影响着发酵效率和产品品质，酵母菌利用糖生成酒精，蛋白质和脂肪经微生物作用后转变为有机酸、氨基酸、酯及杂醇油[11]等，酵母菌发酵性能的优劣极大影响着酒发酵品质的好坏[11]，反映酿酒生产的技术水平[13]。随着发酵的进行，酵母菌生长环境的糖浓度、乙醇浓度随之升高，酵母菌的耐受能力是筛选的重要指标之一[14-15]。同时，酵母菌的发酵能力也是影响酒品质的关键因素。
在中国传统米酒的酿造过程中，微生物群落丰富多样，其中酿酒酵母作为最主要的产醇功能菌群起着关键作用。早期酵母的选育主要是为了提高产量，如今选育目标转变为改善产品风味、提升营养品质及确保产品安全性。研究人员将选育出具有发酵性能突出、乙醇耐受性强等特点的优良酵母作为研究目标。由此可见，培育优质的发酵酵母，对于生产优质米酒至关重要[16-17]。
本研究将水果、大麦苗、玫瑰果、老面团经自然发酵后进行菌株分离纯化，再利用杜氏小管、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyte trazoliumchloride，TTC）法、耐糖耐酒精特性筛选、发酵力试验和模拟发酵性能测试逐级筛选，得到起酵快、耐受性强、发酵性能优良的酵母菌株，以期为优质米酒生产提供重要保障。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蓝莓、杏子、樱桃：市售；大麦苗：临沂大学健康食品创新团队通过萌发技术培育；玫瑰果：采摘自临沂大学生态园（2024年9月）；老面团：临沂大学健康食品创新团队实验室自制；蛋白胨（生化试剂）：青岛海博生物技术有限公司；琼脂、丙三醇、酵母粉（均为生化试剂）、1-丙醇（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；TTC（生化试剂）：山东西亚化学有限公司；硫酸铵（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；3，5-二硝基水杨酸（化学纯）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市鑫铂特化工有限公司；葡萄糖（分析纯）：北京市陆桥技术股份有限公司；无水硫酸镁（分析纯）：西陇科学股份有限公司；真菌DNA提取试剂盒：美国OMEGA生物技术公司。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KBS型立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2F0洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；LRH-250F生化培养箱、HWS-24恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；7820A气相色谱仪：美国Agilent公司；752N Plus分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 培养基与试剂的配制
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，pH6.0，115 ℃湿热灭菌20 min[18]。
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（yeast extract peptone dextrose agar，YPD）培养基：蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸出粉5 g/L、琼脂14 g/L。
TTC上层培养基：葡萄糖5 g/L、琼脂15 g/L、TTC 0.5 g/L。
TTC下层培养基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母粉1.5 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、无水硫酸镁0.4 g/L、琼脂20 g/L，pH5.5～5.7，115 ℃灭菌20 min。
发酵培养基：葡萄糖200 g/L、酵母粉10 g/L、硫酸铵1 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸镁1 g/L，115 ℃灭菌20 min，糖度17.5 °Bx。
3，5-二硝基水杨酸溶液：将0.065 g/L的3，5-二硝基水杨酸加热溶解于水中，随后加入0.26 g/L氢氧化钠和0.45 g/L丙三醇，充分混合均匀。
葡萄糖标准溶液：精确称取0.01 g葡萄糖，以超纯水定容至1 L，获得0.01 g/L葡萄糖溶液。溶液现用现配。
1.3.2 酵母菌分离纯化
取自然发酵好的蓝莓、杏子、樱桃、大麦苗、玫瑰果和老面团进行梯度稀释后涂布于YPD固体培养基，于28 ℃静置培养24～48 h。用接种环挑取光滑湿润、中间隆起的酵母菌特征明显的单菌落，平板划线法重复分离纯化单菌落，经3次划线培养后得到初步纯化的菌株，将纯化后菌株用终浓度为40% 的丙三醇保藏于-80 ℃备用。
1.3.3 产气性能的筛选
将1.3.2纯化得到的菌株活化后，于28 ℃培养24 h制备种子液。将种子液以4%的接种量接种至附有杜氏小管的YEPD培养基中，28 ℃静置培养，每隔2 h观察杜氏小管内气体量。选出发酵快、产气多的菌株进行二级筛选，淘汰产气少或不产气的菌株[19]。
1.3.4 产酒精性能的筛选
利用TTC法，将1.3.3筛选得到的菌株活化后，取5 μL于TTC下层培养基上，28 ℃培养24～48 h后取出，倒入TTC上层培养基，于30 ℃避光保温2～3 h，观察TTC上层培养基中菌落显色反应情况。根据菌落呈色强弱判断酵母中呼吸酶活力的大小，从而评价菌株的产酒精能力。
1.3.5 抗逆耐受性能的筛选
1.3.5.1 耐葡萄糖试验
将1.3.4筛选得到的菌株进行耐糖特性评价，配制葡萄糖浓度为20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%的发酵培养基，置于三角瓶中115 ℃灭菌20 min，然后分装于1.5 mL微量离心管中，以2%的接种量接种活化后的菌株，28 ℃静置培养24 h，用分光光度计测OD600，以生长状况表征菌株对葡萄糖的耐受性。
1.3.5.2 耐酒精试验
将1.3.4筛选得到的菌株进行耐酒精特性评价，配制酒精浓度为0%、4%、6%、18%、20% 的YPD液体培养基，置于三角瓶中115 ℃灭菌20 min，然后分装于1.5 mL微量离心管中，以2% 的接种量接种活化后的菌株，28 ℃静置培养24 h，用分光光度计测OD600，以生长状况表征菌株对酒精的耐受性[20]。
1.3.6 模拟发酵性能试验
将1.3.4筛选所得菌株活化后，按2%接种量接种于400 mL发酵培养基中，称量原始质量并记录。然后于28 ℃恒温静置培养，分别于0、4、8、20、28、36、48、56、64、72 h称量总质量，并计算失重量。待失重量小于0.2 g时，认为达到发酵终点，记录失重总量。比较各菌株的失重情况，筛选出失重快和失重总量大的菌株。
1.3.7 分子鉴定
使用真菌DNA提取试剂盒提取1.3.6筛选出的酵母菌DNA，利用ITS1和ITS4通用引物对提取的DNA进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。将PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，再将其序列在国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行Blast比对。
1.3.8 发酵性能评价
利用水杨酸法测定发酵液的还原糖含量，其中葡萄糖标准曲线为y=0.376 3x+0.041 50（R2=0.990 5）；参考GB/T 13662—2018《黄酒》中的方法测定总酸含量；采用气相色谱仪以1-丙醇作为内标定量，分析发酵液中的酒精度。其中酒精度标准曲线为Y=8.127X+0.105 6（R2=0.971 0）。
1.4 数据处理
每组试验设置3个平行，试验数据采用Origin 9.0和SPSS 13进行处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1 菌株分离纯化情况
从自然发酵好的蓝莓、杏子、樱桃、大麦苗、玫瑰果、老面团中分离纯化出99株菌，根据来源将菌株进行编号，分别为大麦苗39株（D1～D39）、蓝莓8株（LM1～LM8）、杏 子6株（XZ1～XZ6）、老 面 团2株（LYCC90、LYCC97）、玫瑰果39株（M1～M39）、樱桃5株（YT1～YT5）。
2.2 产气性能筛选
酵母菌通过发酵作用将糖类转化为气体，其产气率和产气量能表征酵母菌的起酵能力，产生气体的速度越快、数量越多，说明酵母的起酵能力越强[21]。杜氏小管产气情况如表1所示。
表1 杜氏小管产气情况
Table 1 Gas production in Durham's tubes
编号XZ1 XZ2 XZ3 XZ4 XZ5 XZ6 LM1 LM2 LM3 LM4 LM5 LM6发酵时间/h 2N N N 4 8小气泡小气泡6++-小气泡小气泡小气泡+++++-+++++--+--++++++++++++++++--++-+++++++++++++++++++++++++++-+++-++++++++++++++++++
续表1 杜氏小管产气情况
Continue table 1 Gas production in Durham's tubes
注：++++表示杜氏小管内充满气体；+++表示杜氏小管内有3/4 的气体；++表示杜氏小管内有1/2 的气体；+表示杜氏小管内有1/4 的气体；-表示杜氏小管内有1/8 的气体；+-表示杜氏小管内有3/8 的气体；++-表示杜氏小管内有5/8 的气体；+++-表示杜氏小管内有7/8的气体；N 表示杜氏小管内没有气体。
编号LM7 LM8 YT4 M7 M8 M9 M12 M38 M39 D12 D14 D16 D17 D18 D23 D24 D25 D26 D27 D30 LYCC90 LYCC97发酵时间/h 2+++-++小气泡4 6 8+++--+-+-N++++-+++-+++++++-+++++++++N N N+---+++++++++++++++++-++++++++++++++-+++-++++++-++-+++-++-++++++++-+-++++-+++++++++++-++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
由表1可知，不同菌株产气能力不同。在8 h内产气菌株有34株，分别为XZ1、XZ2、XZ3、XZ4、XZ5、XZ6、LM1、LM2、LM3、LM4、LM5、LM6、LM7、LM8、YT4、M7、M8、M9、M12、M38、M39、D12、D14、D16、D17、D18、D23、D24、D25、D26、D27、D30、LYCC90、LYCC97。其余菌株在观察时间内并不产气，因此未列出。
2.3 酵母二级筛选
TTC在氧化态是无色的，可被氢还原成不溶性的红色三苯甲月替（tetrathiafulvalene，TTF），可与酵母菌的代谢产物乙醇发生显色反应，颜色越深表明酵母产酒精能力越强[22]。TTC培养基显色情况如表2所示。
表2 TTC 培养基显色情况
Table 2 Color development of TTC medium
编号XZ1 XZ2 XZ3 XZ4 XZ5 XZ6 LM1 LM2 LM3 LM4 LM5 LM6 LM7 LM8 YT4 M7 M8颜色深红深红深红不显色深红不显色粉红粉红红红红红不显色红红编号M9 M12 M38 M39 D12 D14 D16 D17 D18 D23 D24 D25 D26 D27 D30 LYCC90 LYCC97颜色红粉，边缘红红红，边缘红红粉，边缘红粉，边缘红粉，边缘红深红粉，边缘红粉，边缘红粉深红深红红深红深红
由表2可知，不同菌株的TTC显色情况差异明显，表明菌株产酒精能力存在差异。因TTC法用肉眼观察误差较大，因此将34株菌中TTC显色为深红、红的菌株（XZ1、XZ2、XZ3、XZ5、LM2、LM4、LM5、LM6、LM7、LM8、M7、M8、M9、M38、M39、D12、D18、D26、D27、D30、LYCC90、LYCC97）均进行下一步试验。
2.4 抗逆性能的筛选
2.4.1 耐糖特性筛选
米酒发酵过程中糖浓度较高，而糖又是酵母菌发酵所必需的营养物质，因此需要选择耐糖性强的酵母菌。酵母细胞具有适应不同渗透压环境的能力，当环境渗透压上升时，细胞会通过改变代谢途径和细胞形态使渗透压保持平衡，避免细胞大量脱水[23]。随着葡萄糖浓度的升高，会对酵母菌产生胁迫作用，不同酵母菌表现出不同的耐受性，结果如表3所示。
表3 菌株在不同葡萄糖浓度下的存活情况
Table 3 Survival of strains at different glucose concentrations
菌株编号XZ1 XZ2 XZ3 XZ5 LM2 LM4 LM5吸光度吸光度比值20%1.162 0.928 0.661 1.103 1.204 1.306 1.137 30%0.910 0.795 0.658 0.765 0.917 0.660 0.939 40%0.510 0.645 0.601 0.533 0.637 0.557 0.574 45%0.535 0.554 0.601 0.522 0.835 0.625 0.574 50%0.630 0.616 0.701 0.534 0.613 0.726 0.629 55%0.754 0.678 0.660 0.708 0.741 0.679 0.926 60%0.527 0.580 0.543 0.576 0.543 0.571 0.570 60%/20%0.454 0.625 0.821 0.522 0.451 0.437 0.501 50%/20%0.649 0.731 0.998 0.642 0.615 0.520 0.814
续表3 菌株在不同葡萄糖浓度下的存活情况
Continue table 3 Survival of strains at different glucose concentrations
菌株编号LM6 LM7 LM8 M7 M8 M9 M38 M39 D12 D18 D26 D27 D30 LYCC90 LYCC97吸光度吸光度比值20%1.222 1.195 1.093 1.27 1.261 1.303 1.207 1.142 1.440 1.059 0.682 0.773 0.943 1.098 1.413 30%0.847 0.840 0.619 0.958 0.823 0.794 0.677 0.734 0.365 0.809 1.260 0.336 1.126 1.244 1.066 40%0.576 0.556 0.647 0.375 0.515 0.459 0.505 0.454 1.164 1.009 0.897 0.413 0.524 0.753 0.594 45%0.572 0.637 0.665 0.454 0.531 0.409 0.644 0.544 0.827 0.984 0.945 0.474 0.414 0.618 0.464 50%0.632 0.618 0.702 0.564 0.53 0.583 0.575 0.576 0.716 0.627 0.865 0.587 0.598 0.599 0.695 55%0.639 0.684 0.708 0.679 0.659 0.618 0.692 0.621 0.771 0.594 0.757 0.560 0.812 0.676 0.715 60%0.668 0.596 0.568 0.536 0.559 0.675 0.631 0.571 0.589 0.590 0.599 0.481 0.618 0.578 0.498 60%/20%0.547 0.499 0.520 0.422 0.443 0.518 0.523 0.500 0.409 0.557 0.878 0.622 0.655 0.352 0.526 50%/20%0.523 0.572 0.648 0.535 0.523 0.474 0.573 0.544 0.535 0.561 1.110 0.724 0.861 0.506 0.616
由表3可知，随着葡萄糖浓度的升高，菌株OD600整体为下降趋势，葡萄糖浓度为20%、30%时，菌体整体耐受性较好，对于高浓度葡萄糖，菌株OD600较低。根据吸光度比值可知，XZ1、XZ2、XZ3、XZ5、LM2、LM5、LM8、M38、D18、D26、D27、D30、LYCC97对高浓度葡萄糖的耐受能力较强。
2.4.2 耐酒精特性筛选
随着发酵液中酒精浓度的升高，酵母菌无法充分利用剩余的还原糖，从而导致发酵停止，因此筛选出耐酒精性能优良的酵母菌至关重要。菌株在不同酒精浓度下的存活情况见表4。
表4 菌株在不同酒精浓度下的存活情况
Table 4 Survival of strains at different alcohol concentrations
菌株编号XZ1 XZ2 XZ3 XZ5 LM2 LM4 LM5 LM6 LM7 LM8 M7 M8 M9 M38 M39 D12 D18 D26 D27 D30 LYCC90 LYCC97吸光度0% vol 1.307 1.348 0.710 2.179 1.482 3.606 1.582 1.583 1.842 1.490 1.771 1.270 1.890 1.306 1.881 2.173 1.141 2.212 0.541 1.725 3.481 1.353 4% vol 1.015 0.699 0.951 0.622 0.914 1.112 1.203 1.155 0.844 1.301 0.627 1.182 1.146 0.797 1.027 1.056 1.144 0.869 0.579 1.225 1.002 1.229 8% vol 0.991 0.820 1.052 1.318 1.181 1.099 1.270 1.093 0.582 0.524 1.257 1.270 1.119 0.844 1.086 1.294 1.320 1.071 0.691 0.515 0.849 1.107 16% vol 0.868 0.266 0.416 0.286 0.759 1.083 0.397 0.288 0.420 0.978 0.748 0.400 0.994 0.334 0.313 1.053 1.082 1.006 0.365 0.682 1.093 0.695 20% vol 0.148 0.549 0.021 0.394 0.555 0.500 0.323 0.755 0.265 0.669 0.471 0.579 0.629 0.496 0.553 0.927 0.890 0.974 0.274 0.449 0.795 0.720吸光度比值20% vol/0% vol 0.113 0.407 0.030 0.181 0.374 0.139 0.204 0.477 0.144 0.449 0.266 0.456 0.333 0.380 0.294 0.427 0.780 0.440 0.506 0.260 0.228 0.532 16% vol/0% vol 0.664 0.197 0.586 0.131 0.512 0.300 0.251 0.182 0.228 0.656 0.422 0.315 0.526 0.256 0.166 0.485 0.948 0.455 0.675 0.395 0.314 0.514
由表4可知，随着酒精浓度的升高，酵母菌OD600整体下降，其中XZ1、XZ2、XZ3、LM2、LM6、LM8、M7、M8、M9、D12、D18、D26、D27、LYCC97在不同酒精浓度下菌株活性较好（吸光度比值较高）。综合考虑耐糖、耐酒精特性，筛选出XZ1、XZ2、XZ3、LM2、LM8、D18、D26、D27和LYCC97进行下一步发酵性能的测定。
2.5 模拟发酵性能分析
酵母在厌氧发酵条件下，不仅会产生酒精，还会产生CO2。随着发酵的进行，产生的CO2会从体系中排出，使得发酵体系质量减少。因此，可以根据发酵体系质量的减少量来判断酵母的发酵能力。不同菌株发酵体系总质量见图1。
图1 不同菌株发酵体系总质量
Fig.1 Total weights of fermentation systems of different strains
由图1可知，随发酵时间延长，酵母菌发酵速度逐渐减慢，与原始质量相比，发酵后失重较多的菌株，即为发酵能力较好的菌株，最终筛选出4株，分别LM8、D26、XZ1、LM2。
2.6 分子鉴定
提取LM8、XZ1、LM2和D26基因组DNA，利用通用引物ITS1和ITS4对上述4株菌株进行PCR扩增，分子鉴定结果见表5。
表5 分子鉴定结果
Table 5 Results of molecular identification
编号D26 LM2 LM8 XZ1菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）有孢汉生酵母（Hanseniaspora opuntiae）卡氏假丝酵母（Hanseniaspora opuntiae）
2.7 发酵性能评价
2.7.1 还原糖
发酵产物还原糖含量如图2所示。
图2 发酵产物还原糖含量
Fig.2 Reducing sugar content in the fermentation broth
发酵液中还原糖含量将影响米酒的甜度及风味，还原糖含量也影响底物的转化率。由图2可知，经过发酵LM2、LM8还原糖含量较高，D26还原糖含量最低，为11.89 mg/mL。
2.7.2 总酸含量
发酵产物总酸含量如图3所示。
图3 发酵产物总酸含量
Fig.3 Total acid content in the fermentation broth
酸类物质是黄酒中重要的风味物质，在黄酒中有增加浓厚感和减少甜味的作用[24]。由图3可知，XZ1产酸能力最强，LM8产酸能力最弱，D26、LM2产酸能力居中，总酸含量分别为0.67、0.60 mg/mL。
2.7.3 酒精度
发酵产物酒精度如图4所示。
图4 发酵产物酒精度
Fig.4 Ethanol concentration in the fermentation broth
由图4可知，D26发酵产物酒精度为12.8% vol，LM2发酵产物酒精度为7.3% vol，LM8发酵产物酒精度为2.7% vol，XZ1发酵产物酒精度为5.7% vol。
综上，选择酒精度高、还原糖含量低、总酸含量低的菌株D26，经18S rDNA鉴定为酿酒酵母。
3 结论
为筛选得到发酵能力好、性能优良的酿酒酵母，从自然发酵的蓝莓、杏子、樱桃、大麦苗、馒头、玫瑰果中分离纯化出99株菌，并探讨其发酵特性。通过杜氏小管、TTC法、耐糖、耐酒精特性试验以及发酵力试验，最终筛选出发酵性能优良的D26菌株，经过18S rDNA鉴定为酿酒酵母。D26发酵液中还原糖含量为11.89 mg/mL、总酸含量为0.67 mg/mL、酒精度为12.8% vol。D26具备发酵能力强、性能稳定等特点，产还原糖含量最低、产酸能力居中且产酒精能力较强，符合米酒对优良发酵特性酵母的要求，可用于米酒生产中提高米酒品质。在米酒生产中，可以复合D26酵母菌，以达到提高米酒产量、品质和风味的目的，其添加比例以及生产工艺有待进一步研究。
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