紫苏[Perilla frutescens （L.） Britt.]为唇形科一年生草本植物，收载于《中国药典》、《名医别录》等，又名赤苏、红苏、桂荏、白苏，在中国、日本、韩国、越南、印度等亚洲国家被广泛种植[1]。紫苏叶为紫苏的干燥叶（或带嫩枝）。传统医学认为，紫苏叶味辛、微温，无毒，归肺、脾经，具有发表散寒、理气和营、行气宽中、和胃止呕、行气安胎及解鱼蟹毒的作用[2]。由于紫苏叶具有诱人的色泽风味，清香扑鼻，因此，在我国及东南亚地区具有悠久的食用历史，被列入我国国家卫生部公布的《药食同源物品名录》，为药食两用物质[3]。
现代研究表明，紫苏叶具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗肿瘤、镇静等作用[4-9]。紫苏叶中化学成分主要包括挥发油类、黄酮类、酚酸类、花色苷类、三萜类[10]。研究发现，紫苏叶中的木犀草苷、迷迭香酸、木犀草素、紫苏醛等是其主要的活性成分[11-14]。目前，紫苏叶中有效成分的检测方法有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法、气相色谱-质谱（gass chromatographymass spectrometry，GC-MS）法等[15-17]。紫苏叶产地众多，不同产地的样品有效成分含量存在差异，因此，本研究以咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、木犀草素、紫苏醛的含量作为指标成分，建立同时检测6 种有效成分的HPLC 方法，并对不同产地紫苏叶中的6 种有效成分进行分析，旨在建立一种简单、灵敏、准确的紫苏叶有效成分分析方法，为紫苏叶质量评价和控制提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
紫苏叶：来自山东、河南、河北、安徽等11 个地区。迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛（均为分析纯，≥98%）：兰州植纯生物科技有限责任公司；甲醇、甲酸（均为色谱纯）：天津市富宇精细化工有限公司；试验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
HITACHI 型高效液相色谱仪：日本株式会社日立高新技术科学那珂事业所；RE2000A 型选装蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；DHG-9075A 型鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；AX224ZH 型电子天平：奥豪斯仪器常州有限公司；SZCL-2 型数显智能控温磁力搅拌器：青岛蓝特恩科教仪器设备有限公司；Orbitrap Fusion Lumos 型超高分辨液质联用仪：美国赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 供试品溶液的制备和对照品溶液的配制
分别精确称取不同产地紫苏叶0.5 g，加入80%甲醇溶液50 mL，加热回流提取2 h，收集上清液定容至50 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤，收集滤液备用。
精确称取迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛对照品，加80%甲醇溶液溶解定容，得到5 mg/mL 的对照品溶液。分别精密吸取适量上述对照品溶液，配制混合对照品溶液，得到迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛的浓度分别为0.5、0.5、0.5、0.5、0.6、0.6 mg/mL。
1.4 HPLC 分析方法
选用Sino Chrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱方法见表1；流速为1.0 mL/min，检测波长330 nm，柱温25 ℃，进样量为10 μL。
表1 梯度洗脱方法
Table 1 Gradient elution method
时间/min 0 5 6 8 10 15 20 25 30 35 40 50流动相A/%5 5 15 20 30 40 50 60 70 80 95 95流动相B/%95 95 85 80 70 60 50 40 30 20 5 5
1.5 方法学考察
1.5.1 专属性考察
取1.3 制备的供试品溶液和对照品溶液，按1.4 中的方法进样，分析该方法的专属性。
1.5.2 线性关系考察
分别配制10、20、40、60、80、100 μg/mL 的对照品溶液，按1.4 中的方法进行分析，分别记录迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛的峰面积。以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。
1.5.3 精密度试验
取对照品溶液，按1.4 中的方法重复进样6 次，分别记录各成分的峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的精密度。
1.5.4 重复性试验
取同一批次紫苏叶，按照1.3 中的方法平行制备6 份供试品溶液，按1.4 中的方法进行分析，分别记录迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛的峰面积，计算RSD，考察方法的重复性。
1.5.5 加样回收率试验
精密称取已知成分含量的紫苏叶供试品3 份，每份约0.5 g，加入对照品溶液，按照1.3 中的方法制备供试品溶液，按1.4 中的方法进行分析，分别记录迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛的峰面积，计算RSD，考察方法的准确性。
1.6 不同产地紫苏叶中有效成分的检测
分别准确称取11 个不同产地紫苏叶，按1.3 中的方法制备样品溶液，常温放置，按1.4 中的方法进行分析，分别记录迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛的峰面积，根据相应的回归方程，计算不同产品紫苏叶有效成分的含量。
1.7 紫苏叶中6 种有效成分的鉴定
采用超高分辨液质联用仪对紫苏叶进行分析，选择正、负离子模式，分别对紫苏叶的供试品溶液进行扫描。
1.8 不同产地紫苏叶的聚类分析
运用SPSS 20.0 软件对11 个产地紫苏叶的指纹图谱进行聚类分析。共有峰设置为10 个， 数据经标准化处理，聚类方法采用组间连接法及平方欧式距离。
1.9 不同产地紫苏叶的质量分析
根据《中华人民共和国药典》，紫苏叶的指标成分为迷迭香酸，因此，设定迷迭香酸的权重为25%，其他成分包括木犀草苷、木犀草素、咖啡酸、阿魏酸、紫苏醛分别设定为15%，并计算11 个产地紫苏叶的质量系数，记作y，对不同产地的紫苏叶进行质量分析。
式中：y 为质量系数，%；a、b、c、……、n 为有效成分的含量，%；m 为权重。
1.10 数据分析
使用SPSS 20.0 对数据进行统计分析，并使用Origin 2021 绘图。
2 结果与分析
2.1 专属性试验
紫苏叶样品与混合对照品溶液的HPLC 图见图1。
图1 紫苏叶样品与混合对照品溶液的HPLC 图
Fig.1 HPLC diagram of Perilla frutescens leaf samples and mixed control products
如图1 所示，混合对照品溶液中各有效成分的保留时间与供试品的保留时间一致，且6 种有效成分能够达到基线分离，因此，该方法具有良好的专属性。
2.2 线性关系考察
以对照品溶液质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到紫苏叶中6 种有效成分的线性回归方程见表2。
表2 紫苏叶中6 种有效成分的线性回归方程
Table 2 Linear regression equation of six effective components in Perilla frutescens leaves
成分阿魏酸咖啡酸迷迭香酸木犀草苷木犀草素紫苏醛回归方程Y=-7 031.523 81+5 110.697 14X Y=-25 425.2+5 595.58X Y=9 661.8+5 458.66X Y=132 162.8+4 535.85X Y=177 130.6+5 340.44X Y=61 696.9+5 240.456X R2 0.998 71 0.997 77 0.997 53 0.996 45 0.997 80 0.999 59
表2 结果显示，迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛在10～100 μg/mL 浓度范围内线性关系良好。
2.3 精密度试验
对照品迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛6 次进样所得的平均峰面积分别为1 383 915.6、17 993 735.3、12 072 335.5、1 630 269.7、15 735 706.5、23 596 672.7，RSD 分别为1.34%、1.45%、2.37%、2.76%、2.71%、1.96%，均小于3%，表明该方法精密度良好。
2.4 重复性试验
同一批次紫苏叶6 次平行试验中迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛的平均峰面积分别为8 215 336.5、213 594.4、73 054.6、412 265.5、32 236.7、57 163.4，RSD 分别为1.45%、1.78%、2.03%、2.16%、1.24%、1.92%，表明该方法的重复性良好。
2.5 加样回收率试验
紫苏叶中6 种有效成分的加样回收率见表3。
表3 紫苏叶中6 种有效成分的加样回收率
Table 3 Simple recovery rate of six effective components in Perilla frutescens leaves
化合物迷迭香酸阿魏酸咖啡酸木犀草素木犀草苷紫苏醛编号1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3取样量/mg 0.599 0.602 0.586 0.281 0.268 0.271 0.267 0.270 0.278 0.324 0.320 0.325 0.254 0.247 0.240 0.151 0.145 0.153对照品添加量/mg 0.132 0.132 0.132 0.260 0.260 0.260 0.203 0.203 0.203 0.342 0.342 0.342 0.251 0.251 0.251 0.196 0.196 0.196测得量/mg 0.727 0.729 0.715 0.532 0.516 0.521 0.464 0.468 0.473 0.660 0.651 0.657 0.499 0.494 0.492 0.342 0.339 0.345回收率/%96.96 96.21 97.72 96.53 95.38 96.15 97.53 96.05 95.82 98.24 96.78 97.07 97.61 97.60 97.72 97.45 98.98 97.96平均回收率/%96.96 96.02 96.87 97.36 97.74 98.13 RSD/%2.73 1.68 1.97 1.83 2.87 1.98
由表3 可知，供试品加入对照品溶液，所得样品中迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、紫苏醛的平均回收率分别为96.96%、96.02%、96.87%、97.36%、97.74%、98.13%，RSD 分别为2.73%、1.68%、1.97%、1.83%、2.87%、1.98%，表明该方法的准确性良好。
2.6 不同产地紫苏叶中有效成分的含量
不同产地紫苏叶HPLC 图谱见图2。紫苏叶中6 种有效成分的含量见表4。
图2 不同产地紫苏叶HPLC 图谱
Fig.2 HPLC diagram of Perilla frutescens leaves from different regions
表4 紫苏叶中6 种有效成分的含量
Table 4 Content of six effective components in Perilla frutescens leaves
产地安徽亳州山东东营河南辉县河北安国广东清远陕西西安云南昭通广西全州湖南邵阳安徽大别山辽宁铁岭迷迭香酸/%0.32 0.26 0.25 0.16 0.18 0.12 0.24 0.13 0.22 0.09 0.11木犀草苷/%0.21 0.23 0.22 0.13 0.12 0.09 0.08 0.06 0.11 0.09 0.08木犀草素/%0.08 0.12 0.02 0.03 0.05 0.06 0.08 0.06 0.06 0.07 0.06阿魏酸/%0.12 0.16 0.13 0.06 0.05 0.06 0.04 0.05 0.06 0.07 0.06咖啡酸/%0.07 0.06 0.08 0.03 0.06 0.03 0.04 0.03 0.05 0.04 0.03紫苏醛/%0.04 0.07 0.06 0.03 0.10 0.03 0.12 0.04 0.06 0.03 0.05
由图2 和表4 可知，安徽亳州和山东东营的紫苏叶中迷迭香酸含量较高，分别为0.32%和0.26%；山东东营、河南辉县的紫苏叶中木犀草苷含量较高，分别为0.23%和0.22%；山东东营、安徽亳州和云南昭通的紫苏叶中木犀草素含量较高，分别为0.12%、0.08% 和0.08%；山东东营和河南辉县的紫苏叶中阿魏酸含量较高，分别为0.16%和0.13%；河南辉县和安徽亳州的紫苏叶中咖啡酸含量较高，分别为0.08%和0.07%；云南昭通和广东清远的紫苏叶中紫苏醛含量较高，分别为0.12%和0.10%。
2.7 紫苏叶中6 种有效成分的鉴定
紫苏叶中6 种有效成分的超高分辨液质联用仪鉴定结果见表5。
表5 紫苏叶中6 种有效成分的超高分辨液质联用仪鉴定结果
Table 5 Identification results of six effective components in Perilla frutescens leaves by liquid chromatograph/mass spectrometer with ultrahigh resolution
峰号P1 P2 P3 P4 P5 P6时间/min 18.13 21.34 24.30 25.74 30.73 35.51理论值（m/z）184.731 3 179.652 5 448.100 2 360.086 0 286.048 8 153.742 5实测值（m/z）185.637 2 178.463 7 447.092 9 361.093 2 287.056 1 154.842 1误差2.56-0.73-0.80 4.24 3.82-1.42峰面积3 742 943.95 523 276.82 780 195.62 671 339.18 356 705.95 6 326 783.63电离形式[M-H]-[M-H]-[M-H]-[M-H]+[M-H]+[M-H]-分子式C10H10O4 C9H8O4 C21H20O11 C18H16O8 C15H10O6 C10H14O化合物阿魏酸咖啡酸木犀草苷迷迭香酸木犀草素紫苏醛
由表5 可知，通过数据处理系统查找质谱响应较高的成分的精确分子质量，经过超高分辨质谱数据库检索、查阅相关文献以及与混合对照品溶液的HPLC图谱比较进行进一步验证，鉴定出6 种有效成分，分别为阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、迷迭香酸、木犀草素以及紫苏醛。
2.8 不同产地紫苏叶的聚类分析
不同产地紫苏叶聚类分析树状图见图3。
图3 不同产地紫苏叶聚类分析树状图
Fig.3 Cluster analysis tree diagram of Perilla frutescens leaves from different regions
由图3 可知，当欧氏距离为12 时，11 个地区样品被划分为三大类。安徽大别山、辽宁铁岭、广西全州、河南辉县、安徽亳州、陕西西安为第一类；广东清远、河北安国、湖南邵阳、云南昭通为第二类；山东东营为第三类。11 个地区样品中第一类相似度在0.842～0.874；第二类相似度在0.732～0.754。第一类、第二类与第三类地区的紫苏叶存在差异性。
2.9 不同产地紫苏叶的质量分析
不同产地紫苏叶质量系数见图4。
图4 不同产地紫苏叶质量系数
Fig.4 Quality coefficient of Perilla frutescens leaves from different regions
由图4 可知，山东东营地区质量系数最大，安徽大别山地区质量系数最小。
3 讨论
研究发现，6 种有效成分在不同产地的紫苏叶中含量差异较大，迷迭香酸含量最高的是安徽亳州（0.32%），其次为山东东营（0.26%），闫钰等[18]采用HPLC 法测得不同产地紫苏叶中迷迭香酸的含量为0.04%～1.57%；木犀草苷含量最高的是山东东营（0.23%），其次为河南辉县（0.22%）；木犀草素含量最高的是山东东营（0.12%），其次为云南昭通和安徽亳州（0.08%），范高福等[19]采用 反相高效液相色谱法测得紫苏叶中木犀草素含量为0.009%、代沙[20]采用HPLC法测得紫苏叶中木犀草素含量为0.24%～4.51%；阿魏酸含量最高的是山东东营（0.16%），其次为河南辉县（0.13%），代沙[20]采用HPLC 法测得紫苏叶中阿魏酸含量为0.39%～3.86%；咖啡酸含量最高的是河南辉县（0.08%），其次为安徽亳州（0.07%），闫钰等[18]采用HPLC 法测得紫苏叶中咖啡酸的含量为0.006%～0.07%；紫苏醛含量最高的是云南昭通（0.12%），其次为广东清远（0.10%）。结果表明紫苏叶化学成分含量受产地影响较大，山东东营和安徽亳州紫苏叶种植前景较好，但由于取样数量相对较少，该数据是否具有代表性，有待扩大试验批次和产地进一步研究。
4 结论
本研究建立了高效液相色谱法同时测定紫苏叶中咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、木犀草素、紫苏醛6 种有效成分的分析方法，通过超高分辨液质联用仪鉴定了6 种有效成分，并对不同产地的紫苏叶中有效成分含量进行检测，该方法简便易行、灵敏度高、结果准确。同时，对不同产地紫苏叶进行了聚类分析，为紫苏叶的质量评价和控制提供技术支撑。
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