角蛋白（keratin）是一种具有极强抗性、难生物降解的硬蛋白，主要来自动物的羽毛、羊毛和指甲中，具有不溶于水和抗分解的性质，其结构稳定，不易降解。我国家禽养殖规模化会产生大量角蛋白类废物，如不及时处理，将造成局部环境的严重污染和较大的蛋白质资源浪费[1-2]。自然界中某些微生物可利用自身分泌的角蛋白酶（keratinase）将角蛋白特异性地分解利用，转化为一种良好的饲料蛋白来源，从而使角蛋白酶在饲料工业、医药工业、食品工业及环境治理等方面具有广阔的应用前景，因此，角蛋白的微生物降解与利用引起了人们的广泛关注[3-4]。
国内外报道中大多数能降解角蛋白的真菌是具有致病性的皮肤性真菌，如Sharif 等[5]和Mini 等[6]在鸡羽毛粉培养基中分离出的黄曲霉可分泌角蛋白水解酶。许多放线菌也可以降解角蛋白，主要见于链霉菌属（Streptomyces）。权金盼等[7]发现链霉菌B221 可产角蛋白酶，发酵降解羊毛中的角蛋白。Gong 等[8]以羊毛作为唯一碳源，分离出的金色链霉菌K13 对降解角蛋白效果同样显著。可降解角蛋白的细菌大多是革兰氏阳性细菌，El-Refai 等[9]发现短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus FH9）在37 ℃条件下培养48 h 可获得较高的角蛋白酶活性。黄妙容等[10]发现铜绿假单胞菌对降解角蛋白具有良好的作用。不同来源的角蛋白酶有着不同的性质和应用范围，目前还存在着微生物产角蛋白酶活力不高、降解效果不理想等情况。因此，分离筛选具备抗逆性强、稳定效果好、产高活性特性的角蛋白酶芽孢杆菌，对进一步发掘微生物降解角蛋白的特性，探讨工业生产中的应用前景具有重要的意义。本试验利用1 942 株动物粪便源芽孢杆菌，进行产高活性角蛋白酶菌株的筛选分离和初步鉴定，以期为后续发掘酶的性质和用途奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试菌株：河南牧业经济学院食品与生物工程学院微生物实验室保存的动物粪便源的1 942 株芽孢杆菌；参比菌株[枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC6633]：中国普通微生物菌种保藏管理中心；鸡毛粉：取自河南田中禾农牧有限公司的鸡毛，清洗干净自然风干，用粉碎机粉碎后过60 目筛备用。
丙酸、乙酸：郑州派尼化学试剂厂；苯甲酸、丁二酸：天津市永大化学试剂有限公司；尿素：南京化学试剂股份有限公司；葡萄糖、NaCl：北京化工集团有限责任公司；细菌DNAout 革兰氏阳性菌试剂盒：青岛天泽生物技术有限公司；考马斯亮蓝G-250：天津市光复精细化工研究所；吐温-80：河北百灵威超精细材料有限公司；蛋白胨、酵母浸粉：北京陆桥技术股份有限公司；淀粉、琼脂：天津市致远化学试剂有限公司；赖氨酸：上海麦克林生化科技有限公司；精氨酸、几丁质、明胶、酪素、木聚糖、纤维素、锇酸：国药集团化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺、溶菌酶（100 mg/mL）：北京索莱宝科技有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电热恒温培养箱（SKP-02）：湖北黄石医疗仪器厂；超净工作台（DL-CJ-1N）、全温振荡器（HZQ-Q）：哈尔滨市东联电子技术开发设备有限公司；显微摄像系统（Motic B Series）：日本Panasonic 公司；高速离心机（TGL-16E）：北京京立离心机有限公司；电热式压力蒸汽消毒器（BXM-30R）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；离心机（TGL-16C）：上海安亭科学仪器厂；电泳仪（DYC 23B）：北京六一仪器厂；粉碎机（HY-04B）：北京环亚天元机械技术有限公司；二氧化碳临界点干燥仪（CPD 030）：北京裕隆时代科技有限公司；离子溅射仪（Eiko IB5）：日本Eiko 公司；扫描电子显微镜（S-570）：日本Hitachi 公司；透射电镜（JEOL JEM-F200）：日本电子株式会社；凝胶成像系统（Biosens SC810）：上海山富科学仪器有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（Primus 96 Advanced）：德国Peqlab 公司；紫外可见分光光度计（UV759CRT）：上海佑科仪器仪表有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 培养基
角蛋白酶筛选培养基：鸡毛粉1 g，NaCl 0.05 g，K2HPO4 0.03 g，KH2PO4 0.04 g，琼脂1.5～2.0 g，蒸馏水100 mL，pH7.2，121 ℃灭菌20 min。种子液培养基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水100 mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20 min。角蛋白酶发酵培养基：鸡毛粉1 g，NaCl 0.05 g，K2HPO4 0.03 g，KH2PO4 0.04 g，蒸馏水100 mL，pH7.2，121 ℃灭菌20 min。液体培养基：0.5 g 葡萄糖，0.5 g 蛋白胨，0.5 g 酵母浸粉，1 g 氯化钠，100 mL 水，121 ℃灭菌20 min；保藏培养基为液体培养基中添加2%琼脂粉制得。
1.3.2 产角蛋白酶菌株初筛
将供试1 942 株芽孢杆菌采用灭菌竹签点种于角蛋白酶筛选培养基平皿中，置于37 ℃培养箱中培养24 h，观察菌株生长状况和透明圈大小。并记录透明圈与菌落直径之比，挑取比值较大的单个菌落，划线接种于角蛋白酶筛选培养基平皿，37 ℃培养22～24 h，传代培养2 次，保存备用。
1.3.3 产角蛋白酶芽孢杆菌复筛
将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中，培养至菌落数为106 CFU/mL 左右，按2%的接种量接种于100 mL 角蛋白酶发酵培养基，37 ℃摇瓶发酵72 h，每12 h 取一次样。发酵液于4 ℃、12 000 r/min 条件下离心15 min 后取上清液，测定角蛋白酶的活性。复筛得到的菌株接种于保藏培养基上，保存备用。
1.3.4 生理生化测定
将复筛获得的菌株划线接种于保藏培养基平皿上，37 ℃培养24 h，观察细胞和菌落形态，同时进行生理生化试验：碳水化合物产酸试验、淀粉水解试验、酪素水解试验、明胶水解试验、吐温-80 降解试验、几丁质降解试验、木聚糖降解试验、纤维素降解试验、赖氨酸脱羧酶试验、精氨酸水解酶试验、NaCl 适应性试验、温度生长试验、V.P.试验、柠檬酸盐试验、有机酸利用试验、0.1%刚果红耐受试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验、核糖核酸酶试验、尿素降解试验、石蕊牛奶试验、吲哚试验[11-14]。
1.3.5 电镜观察
1.3.5.1 扫描电镜观察
样品固定：从保藏培养基上选取复筛获得的单菌落切下，用2.5%戊二醛固定4 h，磷酸缓冲液（pH 值为7.0～7.4）清 洗3 次，每次15～20 min；再用1% 锇酸（OsO4）固定2～4 h，磷酸缓冲液清洗3 次，每次15 min。乙醇脱水：依次用30%、50%、70%、85%、95% 的乙醇溶液各脱水1 次，每次15～20 min，再用无水乙醇脱水2 次，每次15～20 min。用乙酸异戊酯置换2 次，每次15 min。二氧化碳临界点干燥，使用离子溅射仪喷金镀膜，扫描电镜观察照相。
1.3.5.2 透射电镜观察
复筛后获得的菌株接种于液体培养基，37 ℃培养48 h 后，6 000 r/min 条件下离心20 min 收集菌体，参照Nam 等[15]方法制备透射电镜样品。样品制备完毕后，用透射电镜观察照相。
1.3.6 全细胞蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel slectrophoresis，SDS-PAGE）
1.3.6.1 细胞蛋白提取液的制备
复筛获得的菌株按1% 接种量接种于液体培养基，37 ℃、140 r/min 振荡培养18 h。7 000 r/min 离心15 min 得到菌体，加入10 mg/mL 溶菌酶溶液2 mL，振荡使菌体悬浮，37 ℃温育2 h。加入10% SDS 溶液0.3 mL，剧烈振荡，12 000 r/min、4 ℃下离心15 min 得上清液。取1 mL 上清液到1.5 mL 离心管，加入100%三氯乙酸溶液0.1 mL，混合均匀，4 ℃下11 000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀用0.1 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液溶解后为细胞蛋白提取液。以B. subtilis ATCC6633 菌株作为参比菌株。
1.3.6.2 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
采用10%的分离胶和5%的浓缩胶制作凝胶，在加样孔上样后，设定电压为70 V 进行电泳，结束后将凝胶取出，用考马斯亮蓝G-250 进行染色，弃去染液用脱色液脱色[16]。
1.3.7 细菌16S rDNA 鉴定及系统发育树
将复筛获得的菌株按1%接种量接种于液体培养基，37 ℃、140 r/min 振荡培养16～18 h。使用DNAout革兰氏阳性菌试剂盒提取基因组DNA。DNA 产物保存于-20 ℃。PCR 扩增引物为27F（5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3′）和1541R（5′ - AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′），由六合华大基因科技有限公司合成。PCR 扩增体系：10×buffer 5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，引物27F 0.5 μL，引物1541R 0.5 μL，DNA模板1 μL，dNTPs 1 μL，用ddH2O 将体系补至50 μL。PCR 扩增程序：开始94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min。完成30 个循环后，72 ℃延伸10 min。
经过PCR 扩增得到的目的基因片段送六合华大基因科技有限公司进行测序。将得到的序列在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库使用Blast 进行同源性比对，并用MEGA 7.0 软件构建系统发育树[17-18]。
1.3.8 角蛋白酶活力的测定
角蛋白酶的活力采用Riffel 等[19]以偶氮角蛋白作为底物的方法进行测定。首先配制10 g/L 偶氮角蛋白溶液，然后将200 μL 的角蛋白酶溶液（1.3.3 方法中的上清液）加入到1.6 mL 10 g/L 偶氮角蛋白的Tris 溶液中充分振荡使其混匀，将混合液置于60 ℃的水浴中反应15 min；向反应体系中加入三氯乙酸至100 g/L 时终止反应。10 000 r/min 离心15 min 得反应上清液，在440 nm 测其吸光值。一个酶活单位即为60 ℃反应15 min 后，吸光值在440 nm 改变0.01 所需要的酶量。
1.4 数据处理
试验数据均以平均数±标准差表示。采用SPSS 22 和Origin 2018 软件进行数据处理和绘图。
2 结果与讨论
2.1 产角蛋白酶芽孢杆菌的初筛
从分离自动物粪便的1 942 株芽孢杆菌中，初步分离到在角蛋白酶筛选培养基上能产生透明圈的菌株196 株，经过3 次平行试验，其中活力透明圈直径与菌落直径比值大于5.0 的有18 株，结果见表1，其中3 株菌株的透明圈情况见图1。
图1 产生透明圈的部分菌株
Fig.1 Strains with hydrolysis zones
表1 产较高活性角蛋白酶的分离菌株
Table 1 Isolates with high keratin-degrading activity
注：a 为透明圈直径与菌落直径的比值。
菌株编号39-6 50-3 53-1 54-5 56-5 124-6 134-2 54-10 156-1 117-4 112-4 127-3 122-4 78 110 113 83 87透明圈直径/mm 17.00±0.03 19.00±0.26 15.00±0.08 20.50±0.34 16.00±0.07 15.00±0.16 11.00±0.48 15.80±0.21 15.00±0.16 14.00±0.22 18.20±0.03 14.00±0.07 14.00±0.13 14.00±0.35 16.00±0.61 16.00±0.28 14.60±0.33 18.20±0.04菌落直径/mm 3.00±0.07 2.00±0.03 2.00±0.05 3.20±0.16 3.00±0.22 3.00±0.17 2.00±0.08 2.50±0.05 3.00±0.13 2.60±0.04 3.40±0.11 2.50±0.14 2.20±0.06 2.50±0.09 2.50±0.23 3.00±0.07 2.40±0.04 2.60±0.12比值a 5.7 9.5 7.5 6.4 5.3 5.0 5.5 6.3 5.0 5.4 5.4 5.6 6.4 5.6 6.4 5.3 6.1 7.0动物粪便来源黑猩猩变色树蜥双峭冠蜥金黄领蜥红头石龙子雪豹鹌鹑金黄领蜥蓝马鸡朝鲜豹青狼小朝鲜豹朝鲜豹赤狐骆驼美洲虎羚牛羚牛
2.2 产角蛋白酶芽孢杆菌的复筛
将初筛得到的18 株酶活力较高的芽孢杆菌，经传代培养后得到遗传特性较稳定的5 株芽孢杆菌，菌株编号为50-3、53-6、124-6、113 和87。5 株菌分别经摇瓶发酵72 h，每12 h 测定一次角蛋白酶活力，其产酶情况见图2。
图2 不同菌株的产酶情况比较
Fig.2 Keratinase activities of different isolates
由图2 可知，活力较高的菌株为50-3，其在36 h产生的角蛋白酶活力可达（694±15）U/mL。因此将对菌株50-3 作进一步研究。结合表1 可知，菌株50-3分离自杂食类动物变色树蜥的粪便。变色树蜥的主要食物为昆虫类（如蟋蟀、甲壳虫、蜘蛛等），这些昆虫的鳞翅主要是由角蛋白构成。因此，在变色树蜥的消化道中可能存在着大量能分泌角蛋白酶的菌株来帮助消化食物[20-21]。
菌株50-3 在只有鸡毛粉作为角蛋白酶诱导底物的培养基上，37 ℃发酵36 h 角蛋白酶活力可以达到（694±15）U/mL。Lin 等[22]分离的Bacillus licheniformis在发酵60 h 时的角蛋白酶活力为11.1 U/mL；Riffel等[19]的研究发现的菌株Chryseobacterium sp. strain kr6在发酵48 h 时所产的角蛋白酶活力为70 U/mL；Sangali 等[23]的研究发现菌株Vibrio sp.kr2 发酵30 h 产的角蛋白酶的活力为50 U/mL。与国内外报道相比，本试验中的菌株50-3 产生的角蛋白酶具有较高酶活力。
2.3 菌株50-3 的初步鉴定
2.3.1 菌株细胞形态特征
菌株50-3 的细胞形态特征见图3。
图3 菌株50-3 的形态
Fig.3 Morphology of the strain 50-3
由图3 可知，菌株50-3 革兰氏染色为阳性，芽孢中生膨大，菌体个体较小，短杆状，大小一般在（0.8～1.5）μm×（0.2～0.8）μm。由图3b 可以看出，菌株细胞黏连在一起，呈矩阵排列。
2.3.2 菌株的生理生化试验测定
对50-3 菌株进行部分生理生化特征测定，结果见表2。
表2 菌株50-3 的部分生理生化特性
Table 2 Physiological and biochemical properties of strain 50-3
注：+为阳性；-为阴性。
试验项目D-木糖产酸半乳糖产酸D-果糖产酸甘露糖产酸甘露醇产酸纤维二糖产酸麦芽糖产酸棉子糖产酸D-海藻糖产酸蔗糖产酸5%NaCl 7%NaCl 10%NaCl H2O2 酶试验氧化酶试验硝酸盐还原试验刚果红耐受试验10 ℃生长55 ℃生长试验结果+++++++-++++-++++++试验项目V.P.试验柠檬酸盐试验丙酸利用乙酸利用苯甲酸利用丁二酸利用明胶水解试验淀粉水解试验酪素水解试验Tween-80 降解试验赖氨酸脱羧酶精氨酸水解酶几丁质降解试验木聚糖降解试验纤维降解试验石蕊牛奶试验尿素降解试验RNA 酶试验吲哚试验试验结果+-++-+++++++-+-++++
由表2 可知，菌株50-3 不能耐受10%的NaCl，能在10～55 ℃下生长，并且能降解木聚糖，但是不能利用纤维素和几丁质。参照《常见细菌系统鉴定手册》，初步推断50-3 菌株为芽孢杆菌，暂时命名为Bacillus sp.50-3。经生理生化试验结果比较发现，菌株Bacillus sp.50-3 与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进化分支中的越南芽孢杆菌（Bacillus velezensis）[24]和死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）[25]相似度相对较高。
2.3.3 全细胞蛋白电泳
同种的不同菌株的全细胞蛋白电泳图谱相似性较高，如果两个菌株的电泳图谱差异较大，则可断定不是同种[26]。图4 为Bacillus sp.50-3 与枯草芽孢杆菌标准菌株B.subtilis ATCC6633 的电泳图谱。
图4 B.subtilis ATCC6633 和B.sp 50-3 全细胞蛋白电泳条带比较
Fig.4 Comparison of whole-cell protein SDS-PAGE of B.subtilis ATCC6633 and B.sp 50-3
由图4 电泳条带可见，菌株50-3 的全细胞蛋白电泳条带与枯草芽孢杆菌B.subtilis ATCC6633 的条带略有不同，B. subtilis ATCC6633 的全细胞蛋白电泳条带在大分子量区间的条带比菌株50-3 的多，说明Bacillus sp.50-3 区别于枯草芽孢杆菌。
2.3.4 16s rDNA 序列分析
扩增后Bacillus sp.50-3 的16s rDNA 的片段长度为1 477 bp，在GenBank 中经Blast 比较后，发现其与枯草芽孢杆菌进化分支的菌株同源性较高，在Gen-Bank 中申请序列号为EU365432。选取同源性相近的菌株作系统发育树，见图5。
图5 菌株50-3 的系统发育树
Fig.5 Phylogenetic tree of strain 50-3
由图5 可知，菌株50-3 与越南芽孢杆菌（B.velezensis）、死亡谷芽孢杆菌（B.vallismortis）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）的相似度均在99%以上，超过了相似度为98.7%的能鉴定到种的范围[27]。越南芽孢杆菌（B.velezensis）、死亡谷芽孢杆菌（B. vallismortis）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）、莫哈韦芽孢杆菌（B.mojavensis）、马拉加芽孢杆菌（B.malacitensis）、埃卡萨昆芽孢杆菌（B.axarquiensis）、杀线虫芽孢杆菌（B.nematocida）均是枯草芽孢杆菌进化分支中的种，其16S rDNA 相似度均在98%以上，通过16S rDNA 序列难以准确鉴定[26，28-29]。对菌株50-3 的准确鉴定，还需要做如DNA 杂交、细胞脂肪酸分析等研究，因此将菌株50-3 初步鉴定为枯草芽孢杆菌群中的一个种，命名为Bacillus sp.50-3。
3 结论
从动物粪便源分离的1 942 株芽孢杆菌中通过初筛得到产角蛋白酶的菌株196 株，对其中活力较高的18 株，又通过传代培养和液体发酵复筛获得菌株50-3，其36 h 产角蛋白酶活力可达（694±15）U/mL，具有较高酶活力。通过形态观察、生理生化分析、全细胞蛋白电泳和16S rDNA 序列分析，初步鉴定菌株50-3 为枯草芽孢杆菌进化分支中的一个种，将其命名为Bacillus sp.50-3。它与越南芽孢杆菌（B.velezensis）、死亡谷芽孢杆菌（B.vallismortis）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的相似度均大于99%，对菌株50-3 的准确鉴定还需做进一步的研究，如DNA 杂交、细胞脂肪酸分析等。
[1] LI Z L, REIMER C, PICARD M, et al. Characterization of chicken feather biocarbon for use in sustainable biocomposites[J]. Frontiers in Materials,2020,7:3.
[2] FERRARO V, ANTON M, SANTÉ-LHOUTELLIER V. The ′sisters′ α-helices of collagen, elastin and keratin recovered from animal by-products: Functionality, bioactivity and trends of application[J].Trends in Food Science&Technology,2016,51:65-75.
[3] SANTHA KALAIKUMARI S, VENNILA T, MONIKA V, et al. Bioutilization of poultry feather for keratinase production and its application in leather industry[J]. Journal of Cleaner Production,2019,208:44-53.
[4] BORDEL S, MARTÍN-GONZÁLEZ D, MUÑOZ R, et al. Genome sequence analysis and characterization of Bacillus altitudinis B12,a polylactic acid- and keratin-degrading bacterium[J]. Molecular Genetics and Genomics,2023,298(2):389-398.
[5] SHARIF S, SHAH A H, FARIQ A, et al. Optimization of amylase production using response surface methodology from newly isolated thermophilic bacteria[J].Heliyon,2023,9(1):e12901.
[6] MINI K,Kalady K,MATHEW J.Purification of keratinase from Aspergillus flavus S125[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology Research,2017,6(1):17-21.
[7] 权金盼, 李玉妹, 龙宏艳, 等. 链霉菌B221 与地衣芽孢杆菌NJU-1411-1 固体发酵废弃羊毛角蛋白工艺优化和工业化产品分析[J].江苏农业科学,2019,47(2):153-156.QUAN Jinpang, LI Yumei,LONG Hongyan,et al. Optimization of wool keratin solid state fermentation process by Bacillus licheniformis NJU-1411-1 and Streptomyces sp. B221 and industrial keratin product analysis[J].Jiangsu Agricultural Sciences,2019,47(2):153-156.
[8] GONG J S, WANG Y, ZHANG D D, et al. Biochemical characterization of an extreme alkaline and surfactant-stable keratinase derived from a newly isolated actinomycete Streptomyces aureofaciens K13[J].RSC Advances,2015,5(31):24691-24699.
[9] EL-REFAI H A,ABDELNABY M A,GABALLA A,et al.Improvement of the newly isolated Bacillus pumilus FH9 keratinolytic activity[J].Process Biochemistry,2005,40(7):2325-2332.
[10] 黄妙容,钟楚红,任广彩,等.一株产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的分离鉴定[J].中国畜牧兽医,2017,44(3):920-927.HUANG Miaorong, ZHONG Chuhong, REN Guangcai,et al. Isolation and identification of a keratinase-producing strain of Pseudomonas aeruginosa B1-2[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2017,44(3):920-927.
[11] EZEBUIRO V,OBICHI E A,MINIMAH S O,et al.Optimization of α-amylase production by Enterobacter cloacae strain D1 isolated from cassava effluent-impacted soil using response surface methodology[J]. Asian Journal of Biotechnology and Bioresource Technology,2022,8(4):68-80.
[12] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社,2001.DONG Xiuzhu, CAI Miaoying.Handbook of identification of common bacterial systems[M].Beijing:Science Press,2001.
[13] YUAN H L,TU R,TONG X W,et al.Ultrahigh-throughput screening of industrial enzyme-producing strains by droplet-based microfluidic system[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2022,49(3):kuac007.
[14] ROSA MARTINS P H, RABINOVITCH L, OREM J C, et al. Biochemical, physiological, and molecular characterisation of a large collection of aerobic endospore-forming bacteria isolated from Brazilian soils[J]. Neotropical Biology and Conservation, 2023, 18(1):53-72.
[15] NAM G W, LEE D W, LEE H S, et al. Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1,a newly isolated keratinaseproducing thermophilic anaerobe[J]. Archives of Microbiology,2002,178(6):538-547.
[16] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2000.WANG Jiazheng, FAN Ming. Protein technical manual[M]. Beijing:Science Press,2000.
[17] KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution,2016,33(7):1870-1874.
[18] ABDELAZIZ T, ASSIA M. Comparison of IncL/M plasmids using the neighbor-joining method on basis repA and excA genes[J]. Current Research in Bioinformatics,2019,8(1):14-17.
[19] RIFFEL A,LUCAS F,HEEB P,et al.Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin[J].Archives of Microbiology,2003,179(4):258-265.
[20] DE ANGELIS M, SIRAGUSA S, BERLOCO M, et al. Selection of potential probiotic lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding[J]. Research in Microbiology, 2006, 157(8):792-801.
[21] BEVILACQUA L,OVIDI M,DI MATTIA E,et al.Screening of Bifidobacterium strains isolated from human faeces for antagonistic activities against potentially bacterial pathogens[J]. Microbiological Research,2003,158(2):179-185.
[22] LIN X,INGLIS G D,YANKE L J,et al.Selection and characterization of feather-degrading bacteria from canola meal compost[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1999, 23(2):149-153.
[23] SANGALI S, BRANDELLI A. Feather keratin hydrolysis by a Vibrio sp. strain Kr2[J]. Journal of Applied Microbiology, 2000, 89(5):735-743.
[24] KABEER F A, JOHN N, ABDULLA M H. Biodegradation of malachite green by a newly isolated Bacillus vietnamensis sp. MSB17 from continental slope of the Eastern Arabian Sea: Enzyme analysis, degradation pathway and toxicity studies[J]. Bioremediation Journal,2019,23(4):334-342.
[25] CHEBOTAR V K,GANCHEVA M S,CHIZHEVSKAYA E P,et al.Draft genome sequence of Bacillus vallismortis strain BL01, isolated from Artemisia lerchiana web. roots[J]. Microbiology Resource Announcements,2022,11(11):1-2.
[26] 孟令缘,牛沁雅,廉鲁昕,等.基于16S rDNA 序列、MALDI-TOFMS 和VITEK 的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的鉴定[J].中国食品学报,2021,21(10):197-205.MENG Lingyuan,NIU Qinya, LIAN Luxin, et al. Identification of Salmonella and Staphylococcus aureus using 16S rDNA sequencing, MALDI-TOF-MS and VITEK system[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2021,21(10):197-205.
[27] ERKO S,EBERS J.Taxonomic parameters revisited:Tarnished gold standards[J].Microbiology Today,2006,33:152-155.
[28] THIRUVENGADAM R,GANDHI K,VAITHIYANATHAN S,et al.Complete genome sequence analysis of Bacillus subtilis Bbv57, a promising biocontrol agent against phytopathogens[J]. International Journal of Molecular Sciences,2022,23(17):9732.
[29] 李书颖,朱天辉.杜仲黑斑病菌(Pestalotiopsis trachicarpicola)拮抗细菌的分离和鉴定[J].微生物学通报,2020,47(2):469-480.LI Shuying, ZHU Tianhui. Isolation and identification of antagonistic bacterial strain against Pestalotiopsis trachicarpicola[J].Microbiology China,2020,47(2):469-480.