青春双歧杆菌蔗糖磷酸化酶诱导表达条件的优化及其酶学性质

朱乐婷1,宋文军1,娄婷婷2,吴子健1,张宏宇1*,王丹芸1,张得光1,王亦心1,董淑元1

(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134;2.天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津 300457)

摘 要:蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase,SPase)不仅能够水解蔗糖产生α-葡萄糖-1-磷酸,还能对多种底物进行糖基化修饰。来源于青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium adolescentis sucrose phosphorylase,BaSP)的双突变体L341I_Q345S(BaSP-IS)对曲二糖的合成具有高选择性。为进一步挖掘BaSP-IS 合成曲二糖的潜力,该文将BaSP-IS 在大肠杆菌中异源表达,以水解活性为指标,通过单因素试验和响应面法对其诱导表达条件进行优化,并对其转糖基化活性及酶学性质进行研究。结果表明,BaSP-IS 的最佳表达条件为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)浓度0.4 mmol/L、诱导时间17 h、诱导温度25 ℃,在此条件下,粗酶液的水解活性达到11.88 U/mL。酶学性质研究结果表明,BaSP-IS 在合成曲二糖时的最适反应温度为55 ℃、最适反应pH 值为7.0,动力学参数Km 值为(145.749 78±7.897 30)mmol/L,最大反应速率Vmax 值为(0.091 57±0.001 72)mmol/(L·min)。

关键词:蔗糖磷酸化酶;曲二糖;大肠杆菌;异源表达;酶学性质

蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase,SPase,EC 2.4.1.7)属于糖苷水解酶家族GH13[1],由约500 个氨基酸组成,分子量为50~60 kDa[2]。作为一种碳水化合物活性酶,SPase 可以将普通食用糖生物催化转化为有吸引力的产品,其催化的反应包括磷酸化、水解以及转糖基化3 种类型[3-4],并且在反应过程中遵循双重置换机制。SPase 在多个行业中展现出广泛的应用潜力,具有较高的商业价值,其应用主要集中在以下3 个方面:1)糖苷类产物的合成。SPase 对氢醌进行葡萄糖基修饰后可制得有竞争力的美白添加剂熊果苷[5-6];SPase 催化蔗糖和甘油合成的甘油葡萄糖,可作为化妆品中的保湿剂[7];此外,该酶还具备催化抗坏血酸合成稳定性高且水溶性好的抗氧化剂2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G)的能力[8]。2)功能性低聚糖的合成。SPase 能以葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖等为受体,催化合成低聚糖[9],如以蔗糖和葡萄糖为底物转化生成曲二糖[10]。3)植物多酚糖基化产物的合成。白藜芦醇和儿茶素等植物多酚具有抗菌和抗肿瘤等活性,在医药领域展现出强大的应用潜力,但其固有的低水溶性限制了其工业应用,通过SPase 的催化作用,这些植物多酚可以转化为稳定性和水溶性改善的糖基化产物,如白藜芦醇3-α-葡萄糖苷和儿茶素-3-O-D-葡萄糖苷等[11-12]

SPase 主要来源于微生物[13],少量存在于植物细胞中,以单体或者同型二聚体形式发挥作用[14]。通常,野生型菌株发酵获得SPase 的效率较低,难以满足工业化生产的需求[15],其高效表达的一种有效途径是利用基因工程技术构建其过表达的重组工程菌[16]。目前多数研究倾向于利用大肠杆菌作为宿主进行SPase 的异源表达,如Kitao 等[17]以噬菌体为载体,在大肠杆菌中表达了来源于肠膜明串珠菌的SPase(Leuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase,LmSP),酶活达到55.7 U/mL,是在L.mesenteroides 中表达量的80 倍。Lee 等[18]E.coli BL21(DE3)中表达了来源于L. mesenteroides B-1149 的SPase,纯化后比酶活达到2.18 U/mg。Zhang等[19]将长双歧杆菌来源的SPase(Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSP)基因克隆并构建到E.coli BL 21 中,优化表达条件后,SPase 比活力为122.1 U/mg,比优化前提高了1.85 倍,回收率为86%。Yao 等[15]利用分子伴侣pGro7(GroES-GroEL)、pGKJE8(DnaK-DnaJ-GrpE and GroES-GroEL)和pG-TF2(GroES-GroEL-Tig)促进了来源于热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)的SPase 在大肠杆菌中的可溶性表达。部分研究将SPase 在枯草芽孢杆菌中进行表达,如王淼淼[20]将SPase L341I_Q345S双突变体在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行表达,该突变体以胞外酶形式高效表达,粗酶活性达到5.3 U/mL。

本研究对源于青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium adolescentis sucrose phosphorylase,BaSP)的双突变体L341I_Q345S(BaSP-IS)进行异源表达,表达系统选择E.coli BL21(DE3)。为提高该双突变体的可溶性表达量,探究诱导时间、诱导温度和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)浓度等条件对表达的影响,以确定最佳诱导表达条件;镍离子柱亲和层析纯化BaSP-IS 后,对其转糖基化活性及酶学参数进行表征,以期为该酶后续的应用及分子改造提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

E. coli BL21(DE3)菌株:保存于天津商业大学生物技术与食品科学学院实验室;3-吗啉丙磺酸(3-morpholinopropanesulfoinc acid,MOPS)、琼脂粉、LB 肉汤、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS):北京索莱宝科技有限公司;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)缓冲液、蛋白上样缓冲液:南京金斯瑞生物科技有限公司;HyPur T Ni-NTA 6FF(His-Tag)预装重力柱、咪唑、卡那霉素、IPTG:生工生物工程(上海)股份有限公司;DL2500 DNA Marker、蛋白分子量Marker:上海百赛生物技术股份有限公司;超滤管(截留分子量30 kDa):美国Millipore 公司;质粒小提试剂盒、高效感受态细胞制备试剂盒、改良型二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司。以上化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(Flexlid):德国Eppendorf 公司;高速低温离心机(LegendMicro 21R):美国Thermo Fisher 公司;超声波细胞破碎仪(Scientiz-IID):宁波新芝生物科技股份有限公司;恒温培养箱(SPX-100B-D):上海博迅实业有限公司;恒温振荡摇床(ZQTY50N):知楚生物科技(上海)有限公司;超微量分光光度计(NanoPhotometer®N60):德国Implen GmbH 公司;蛋白电泳仪(PowerPac Universal):美国BIO-RAD 公司;高效液相色谱仪(EClassical 3100):大连依利特分析仪器有限公司;色谱柱(NH2-50 4E):昭和电工科学仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BaSP-IS 表达体系的构建

1.3.1.1 重组质粒的构建

从美国国家生物技术中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中下载BaSP 基因序列(GenBank:AF543301.1),进行密码子优化后,将第341、345 位氨基酸的密码子分别替换为异亮氨酸和丝氨酸,并在基因序列的5′端和3′端分别引入Nde I(CATATG)和BamH I(GGATCC)两个酶切位点,得到全长1 524 bp 的BaSP-IS 基因序列。重组质粒pET-28a/BaSP-IS 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,并保存于克隆宿主E.coli DH5α 中。

1.3.1.2 BaSP-IS 的基因检测及测序验证

将含重组质粒pET-28a/BaSP-IS 的E. coli DH5α甘油菌在含卡那霉素(50 μg/mL)的LB 固体培养基上划线培养12 h,挑取单菌落转接到含相同抗生素浓度的LB 液体培养基中,37 ℃、200 r/min 摇床培养,设计扩增BaSP 基因的引物(上游引物F:5′-CGCGGC AGCCATATGAAGAACAAA-3′,下游引物R:5′-CGGATCCTTATGCAACAACCGG-3′),菌液PCR 验证阳性后,使用质粒小提试剂盒提取质粒,进行测序验证。

1.3.1.3 重组菌的诱导表达及粗酶液的制备

将测序验证无误的质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中并验证和保种,将含重组质粒pET-28a/BaSP-IS 的E. coli BL21(DE3)甘油菌在含卡那霉素(50 μg/mL)的抗性平板上培养12 h,挑取单菌落转接到含相同抗生素浓度的LB 液体培养基中,37 ℃、200 r/min 过夜培养,按1%接种量将过夜培养的单克隆菌液转接至50 mL 的LB 液体培养基(含50 μg/mL 卡那霉素)中,37 ℃、200 r/min 摇床培养,OD600 值约为0.6时,加入IPTG 至终浓度为0.5 mmol/L,25 ℃、200 r/min诱导培养12 h,诱导完毕后10 000 r/min、4 ℃离心10 min 收集菌体。利用50 mmol/L pH7.0 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)将菌体进行两次洗涤与离心处理。将洗涤后的菌体重悬于5×PBS 缓冲液中,加入终浓度为1 mmol/L 的蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),超声破碎细胞(95 W,超声时间2.5 s,间歇时间3 s,共计10 min),随后离心裂解液(10 000 r/min,4 ℃,10 min),上清液部分即为粗酶液。

1.3.2 重组BaSP-IS 诱导表达条件的优化

1.3.2.1 BaSP-IS 水解活性的测定

BaSP-IS 水解活性的测定采用DNS 还原糖测定法[21]。反应体系:25 μL 适当稀释的粗酶液,225 μL PBS(50 mmol/L,pH7.0),250 μL 的5%(质量浓度)蔗糖溶液,55 ℃水浴10 min 后,加入750 μL DNS 试剂,沸水浴10 min,冷却后在波长540 nm 处测定吸光度。制备不同浓度的果糖溶液在相同条件下与DNS 试剂反应,得到标准曲线y = 1.066 9x - 0.389(R2=0.999 9)。BaSP-IS 水解活性的单位(U)定义:每分钟水解蔗糖生成1 mmol 果糖所需的酶量。

1.3.2.2 单因素试验

通过单因素试验策略,针对不同变量(IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间)进行诱导表达,以粗酶液的水解活性为指标,分析不同变量对BaSP-IS 表达的影响,从而确定其最佳诱导表达条件。1)在25 ℃、诱导时间12 h 条件下,加入不同浓度的IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L);2)加入终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG,诱导时间12 h,设置不同诱导温度(16、20、24、28、32 ℃);3)加入终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG,诱导温度为25 ℃,设置不同诱导时间(8、12、16、20、24 h)。每个试验重复3 次,结果取平均值。

1.3.2.3 响应面试验

在单因素试验的基础上,以BaSP-IS 水解活性为响应值,IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间为变量,进行三因素三水平响应面试验,通过Design-Expert 8.0 统计分析软件建立Box-Behnken 模型,确定BaSP-IS 重组菌诱导表达的最佳条件[22]。响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验设计
Table 1 Response surface design

水平-1 0 1因素A 诱导温度/℃20 24 28 B 诱导时间/h 12 16 20 C IPTG 浓度/(mmol/L)0.2 0.4 0.6

1.3.3 重组BaSP-IS 的纯化

将粗酶液用0.22 μm 微孔滤膜过滤后与结合缓冲液(300 mmol/L 氯化钠、50 mmol/L 磷酸钠缓冲液、20 mmol/L 咪唑,pH7.4)按体积比为1∶1 混合,然后上样到已用结合缓冲液平衡后的镍柱中。混合液以0.5 mL/min 流速通过层析柱,全部流穿后封闭上下柱头,孵育1 h,用洗涤缓冲液(300 mmol/L 氯化钠、50 mmol/L 磷酸钠缓冲液、100 mmol/L 咪唑,pH7.4)去除杂蛋白,再用洗脱缓冲液(300 mmol/L 氯化钠、50 mmol/L 磷酸钠缓冲液、300 mmol/L 咪唑,pH7.4)洗脱并收集目的蛋白。透析处理收集到的洗脱液,用超滤管进行离心(4 500×g,4 ℃,20 min)浓缩得到纯蛋白,根据实际情况增加离心次数,至蛋白浓度大于2 mg/mL。将浓缩后的纯酶液进行SDS-PAGE 电泳,分析目的蛋白浓度。

1.3.4 重组BaSP-IS 蛋白浓度测定

使用改良型BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定重组BaSP-IS 的蛋白浓度。配制不同浓度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)为标准蛋白,使用超微量分光光度计测定562 nm 处的吸光度,以蛋白浓度为横坐标(x),吸光度为纵坐标(y),测得标准曲线为y =0.000 4x + 0.018 8(R2=0.999 9)。

1.3.5 重组BaSP-IS 的转糖基化活性及酶学性质测定

测定BaSP-IS 转糖基化活性的反应体系设为600 μL,其中含有150 μL 2 mol/L 蔗糖溶液(pH7.0 的100 mmol/L MOPS 缓冲液配制)、150 μL 2 mol/L 葡萄糖溶液(pH7.0 的100 mmol/L MOPS 缓冲液配制)、添加纯化后的酶溶液至终浓度为0.25 mg/mL,不足部分用MOPS 缓冲液(100 mmol/L,pH7.0)补足。体系在55 ℃条件下反应36 h 后,100 ℃煮沸10 min 灭活酶,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法检测曲二糖含量。色谱柱Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6 mm×250 mm),流动相为75% 乙腈溶液和水,流速为1 mL/min,柱温35 ℃。转糖基化活性单位定义:在特定条件下,每分钟产生1 μmol 曲二糖所需的酶量。

1.3.5.1 不同温度对BaSP-IS 合成曲二糖含量的影响

将上述反应体系混合后分别在40、45、50、55、60 ℃下反应36 h。反应结束后100 ℃煮沸10 min 使酶灭活,并使用HPLC 法测定曲二糖的含量,测定3 次计算平均值。

1.3.5.2 不同pH 值对BaSP-IS 合成曲二糖含量的影响

为探究pH 值对曲二糖合成的影响,分别使用pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的100 mmol/L MOPS 缓冲液配制2 mol/L 蔗糖溶液和2 mol/L 葡萄糖溶液。将纯酶与不同pH 值的蔗糖和葡萄糖溶液混合后,在55 ℃条件下反应36 h。反应结束后使用HPLC 法测定曲二糖的含量,测定3 次计算平均值。

1.3.5.3 重组BaSP-IS 的酶促反应动力学测定

在55 ℃下,使用以下条件对酶进行转糖基化动力学参数的测定,总体系为200 μL,包含80 μL 浓度500 mmol/L 的蔗糖溶液、100 μL 浓度0~500 mmol/L 的葡萄糖溶液、20 μL 蛋白浓度为1 mg/mL 的纯酶。孵育1 h 后煮沸10 min,使用HPLC 法测定曲二糖的含量,测定3 次计算平均值。

1.4 数据处理

为确保试验结果的可靠性,每组试验重复3 次取平均值,单因素试验结果的分析和制图利用Origin 2024 软件,采用Design-Expert 8.0 软件设计响应面试验并分析试验数据。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET-28a/BaSP-IS 的验证与表达

重组质粒pET-28a/BaSP-IS 的验证与表达结果见图1。

图1 重组质粒pET-28a/BaSP-IS 的验证与表达结果
Fig.1 Validation and expression results of recombinant plasmid pET-28a/BaSP-IS

由图1A 可知,对已转入重组质粒pET-28a/BaSPIS 的生长到对数期的E.coli DH5α 菌液,进行菌液PCR验证,在约1 500 bp 处出现条带与目标产物(1 524 bp)大小一致。提取质粒进行测序,测序结果显示序列正确后,将其转化到E.coli BL21(DE3)感受态中,以单克隆菌液为模板,再次进行菌液PCR 验证,由图1B 可知,重组E. coli BL21(DE3)/pET-28a/BaSP-IS 构建成功。

诱导表达重组BaSP-IS 后,使用SDS-PAGE 分析BaSP-IS 的表达情况,结果见图2。

图2 BaSP-IS 在E.coli BL21(DE3)中诱导表达的SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE of induced expression of BaSP-IS in E.coli BL21(DE3)

由图2 可知,在约56 kDa 处出现了目的条带,与预测的蛋白质分子量大小一致,表明BaSP-IS 成功在E.coli BL21(DE3)中表达。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 IPTG 浓度对重组BaSP-IS 表达的影响

为探究不同IPTG 浓度对重组BaSP-IS 表达量的影响,分别添加浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的IPTG,制备粗酶液后,对其水解活性进行测定,结果见图3。

图3 IPTG 浓度对BaSP-IS 水解活性的影响
Fig.3 Effect of IPTG concentration on hydrolytic activity of BaSP-IS

如图3 所示,IPTG 浓度为0.2~0.4 mmol/L 时,BaSP-IS 的水解活性明显上升,在0.4 mmol/L 时达到峰值,当IPTG 浓度大于0.4 mmol/L 时,随着IPTG 浓度的增加,水解活性明显下降。主要是因为IPTG 会影响蛋白的表达速率、溶解度和活性,添加较高浓度的IPTG,会使BaSP-IS 的表达速度加快,造成BaSP-IS 蛋白质的错误折叠增多,产生包涵体[23];适宜的IPTG 浓度,可缓解大肠杆菌细胞的代谢压力从而提高BaSP-IS的表达量[24]。因此,选择BaSP-IS 的IPTG 浓度为0.2、0.4、0.6 mmol/L 进行响应面试验。

2.2.2 诱导温度对重组BaSP-IS 表达的影响

设置诱导温度为16、20、24、28、32 ℃,探究不同诱导温度对重组BaSP-IS 表达量的影响,结果见图4。

图4 诱导温度对BaSP-IS 水解活性的影响
Fig.4 Effect of induction temperature on hydrolytic activity of BaSP-IS

如图4 所示,诱导温度从16 ℃上升到24 ℃,水解活性上升;诱导温度从24 ℃上升到32 ℃,水解活性下降。这可能是因为菌体生长速度受诱导温度影响较大,诱导温度较低不利于E.coli BL21(DE3)的生长,重组蛋白质的合成速度降低;诱导温度较高时,重组蛋白质的合成速度较快,可能导致酶蛋白质的错误折叠,形成不活跃的包涵体[25]。因此,选择BaSP-IS 的诱导温度为20、24、28 ℃进行响应面试验。

2.2.3 诱导时间对重组BaSP-IS 表达的影响

设置诱导时间为8、12、16、20、24 h,探究不同诱导时间对重组BaSP-IS 表达量的影响,结果见图5。

图5 诱导时间对BaSP-IS 水解活性的影响
Fig.5 Effect of induction time on hydrolytic activity of BaSP-IS

如图5 所示,当诱导时间为8~16 h 时,随着诱导时间的延长,BaSP-IS 的水解活性呈增加趋势,在16 h时达到最大值;在16~20 h 时,BaSP-IS 的水解活性略微下降;在20~24 h 时,BaSP-IS 的水解活性急剧降低,可能是长时间培养改变了培养基中营养物质,导致菌体衰老、自溶[19,26]。因此,选择BaSP-IS 的诱导时间为12、16、20 h 进行响应面试验。

2.3 响应面试验结果分析

在上述单因素试验结果的基础上,设计三因素三水平的响应面试验来进行诱导表达条件的优化,以诱导温度(A)、诱导时间(B)、IPTG 浓度(C)为变量,BaSPIS 水解活性(Y)为响应值,响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface test

序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17因素A 诱导温度/℃24 24 28 28 20 24 24 24 24 24 20 28 24 20 28 24 20 B 诱导时间/h 16 12 20 16 12 16 16 20 12 20 16 12 16 20 16 16 16 C IPTG 浓度/(mmol/L)0.4 0.2 0.4 0.6 0.4 0.4 0.4 0.2 0.6 0.6 0.2 0.4 0.4 0.4 0.2 0.4 0.6 Y BaSP-IS水解活性/(U/mL)11.70 10.44 10.54 9.29 9.69 11.98 11.97 10.75 9.51 10.69 9.51 10.06 11.63 9.77 10.49 11.96 9.63

使用Design-Expert 8.0 软件对表2 结果进行分析,得到二次多项回归方程:Y=-47.218 50+3.786 37A+1.020 81B+22.111 25C+0.006 250AB-0.412 500AC+0.271 875BC-0.076 578A2-0.037 984B2-22.318 75C2。对回归模型进行方差分析,结果见表3。

表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of the regression model

注:*表示影响显著(P<0.05);**表示影响极显著(P<0.01)。

来源模型A B C AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项绝对误差总和平方和14.54 0.40 0.53 0.54 0.04 0.44 0.19 6.32 1.56 3.36 0.25 0.14 0.11 14.8自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方1.62 0.40 0.53 0.54 0.04 0.44 0.19 6.32 1.56 3.36 0.036 0.047 0.029 F 值44.41 10.89 14.44 14.72 1.10 11.97 5.20 173.75 42.75 92.24 1.64 P 值<0.000 1 0.013 1 0.006 7 0.006 4 0.329 2 0.010 5 0.056 6<0.000 1 0.000 3<0.000 1 0.315 2显著性**************

由表3 可知,该模型的P 值<0.000 1,失拟项P=0.315 2>0.05,表明该模型差异极显著且受其他因素干扰不显著。决定系数R2=0.982 8,校正决定系数R2Adj=0.960 7,证明该回归方程可信度高,可用于预测BaSPIS 的水解活性。一次项A、交互项AC 影响显著(P<0.05),一次项BC、二次项A2B2C2 影响极显著(P<0.01)。根据F 值大小可知,对BaSP-IS 的水解活性的影响主次顺序为A(诱导温度)<B(诱导时间)<C(IPTG浓度)。

利用Design-Expert 8.0 统计分析软件,对诱导温度、诱导时间、IPTG 浓度3 个因素之间两两交互作用进行分析,并绘制三维响应面图和等高线图,见图6。

图6 各因素相互作用
Fig.6 Interactions between factors

如图6 所示,IPTG 浓度和诱导时间的等高线呈圆形,说明IPTG 浓度和诱导时间交互作用不显著;当考察诱导时间和诱导温度的交互作用时,随着两个参数的逐渐增加,水解活性出现先增大后减小的变化趋势,且对应的等高线图呈圆形,表示这两个因素间的交互作用不显著;诱导温度、IPTG 浓度的等高线图呈椭圆形,说明两者的交互作用显著(P<0.05)。这与方差分析结果一致。

2.4 验证试验

结合上述构建的回归模型,预测优化后的条件为IPTG 浓度0.37 mmol/L、诱导温度24.47 ℃、诱导时间16.78 h,此条件下BaSP-IS 粗酶液的水解活性可达到11.9 U/mL。根据实际情况,将条件设定为IPTG 浓度0.40 mmol/L、诱导温度25 ℃、诱导时间17 h。经验证,BaSP-IS 粗酶液的水解活性达到11.88 U/mL,与模型预测值基本一致,说明该模型的预测准确,可用于后续试验。

2.5 重组BaSP-IS 的转糖基化酶学性质分析

2.5.1 不同温度对BaSP-IS 合成曲二糖含量的影响

在基于酶法合成曲二糖的工业应用中,适当的温度不仅能够防止微生物的污染,而且能够降低糖类物质的黏度,加速反应速率,缩短反应进程,提高产物的转化率。但是过高的温度可能引起蛋白质变性,进而影响产物的产量。温度对BaSP-IS 合成曲二糖含量的影响见图7。

图7 温度对BaSP-IS 合成曲二糖含量的影响
Fig.7 Effect of reaction temperature on the yield of kojibiose synthesized under the catalysis by BaSP-IS

由图7 可知,在40~55 ℃时,伴随温度的上升,BaSP-IS 合成曲二糖的含量逐渐提高,在55 ℃时达到峰值;当温度达到60 ℃时,BaSP-IS 合成曲二糖含量急剧下降,可能是因为在60 ℃条件下,BaSP-IS 部分转糖基化活性丧失。因此,BaSP-IS 合成曲二糖的温度应该控制在55 ℃左右,此温度既能够满足工业生产温度的需求,同时能防止酶活性的丧失以及曲二糖含量的下降。

2.5.2 不同pH 值对合成曲二糖含量的影响

pH 值会影响酶分子侧链上极性基团的解离,改变其带电状态,从而使酶活性中心的结构发生变化,影响酶的稳定性。当pH 值过高或过低时,酶分子侧链上极性基团的解离状态发生改变,底物分子与酶结合力降低,酶反应速度降低。pH 值对曲二糖含量的影响见图8。

图8 pH 值对BaSP-IS 合成曲二糖含量的影响
Fig.8 Effect of pH on the yield of kojibiose synthesized under the catalysis by BaSP-IS

由图8 可知,在pH 值为7.0 时,BaSP-IS 合成曲二糖含量达到最大值72.3 mg/mL;在pH 值为7.5~8.0 时合成曲二糖的含量基本接近,说明BaSP-IS 在碱性条件下合成曲二糖仍然具有较强的稳定性;在pH 值为6.0~6.5 时,BaSP-IS 合成曲二糖的含量较低,说明该酶在偏酸性条件下曲二糖合成会受到较大影响。因此,BaSP-IS 合成曲二糖的pH 值应该控制在7.0 左右。

2.6 重组BaSP-IS 的酶促反应动力学结果分析

重组BaSP-IS 以不同浓度葡萄糖为底物,利用HPLC 法测定曲二糖的生成量,从而反映BaSP-IS 与葡萄糖的亲和力,使用Origin 2024 软件对不同葡萄糖浓度下的初始速率进行非线性拟合,结果如图9 所示。

图9 BaSP-IS 的转糖基化反应动力学
Fig.9 Transglycosylation kinetics of BaSP-IS

由图9 可知,BaSP-IS 动力学参数Km为(145.749 78±7.897 30)mmol/L,最大反应速率Vmax 为(0.091 57±0.001 72)mmol(/L·min)。

3 结论

本研究成功实现了BaSP-IS 在大肠杆菌中的异源表达。通过单因素及响应面试验优化确定了重组BaSP-IS 的表达条件为IPTG 浓度0.40 mmol/L、诱导温度25 ℃、诱导时间17 h,在该条件下,BaSP-IS 粗酶液的水解活性达到11.88 U/mL。BaSP-IS 的转糖基化活力结果表明,该酶在pH7.0 时合成曲二糖含量达到最大值72.3 mg/mL,在55 ℃时合成曲二糖含量达到最大值74.58 mg/mL。BaSP-IS 的酶促反应动力学分析结果表明,以葡萄糖作为底物时,Km 为(145.749 78±7.897 30)mmol/L,Vmax 为(0.091 57±0.001 72)mmol/(L·min)。本研究优化了BaSP-IS 的异源表达条件,并进行了转糖基化相关酶学性质的测定,为该酶后续的应用以及通过蛋白质工程策略改进其热稳定性和催化活性提供参考。

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Induced Expression Condition Optimization and Enzymatic Property Characterization of Sucrose Phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis

ZHU Leting1,SONG Wenjun1,LOU Tingting2,WU Zijian1,ZHANG Hongyu1*,WANG Danyun1,ZHANG Deguang1,WANG Yixin1,DONG Shuyuan1

(1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,School of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,School of Biological Engineering,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

Abstract:Sucrose phosphorylase(SPase)can hydrolyze sucrose to produce α-glucose-1-phosphoric acid and perform glycosylation on various substrates. The mutant L341I_Q345S of sucrose phosphorylase derived from Bifidobacterium adolescent L341I_Q345S(BaSP-IS)had high selectivity for the synthesis of kojibiose.The potential of BaSP-IS in the synthesis of kojibiose was explored. The BaSP-IS gene was expressed in Escherichia coli,and the induced expression conditions were optimized by single factor experiments and response surface methodology with the hydrolytic activity as an indicator.Furthermore,the transglycosylation activity and enzymatic properties were studied.The results showed that the optimal expression conditions for BaSP-IS were isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG)concentration of 0.4 mmol/L,induction time of 17 h and induction temperature of 25 ℃.Under these conditions,the hydrolytic activity of the crude enzyme reached 11.88 U/mL.Enzymatic property studies showed that the optimal reaction conditions for BaSP-IS was 55 ℃and pH7.0. The kinetic parameters Km and Vmax values of BaSP-IS were(145.749 78±7.897 30)mmol/L and(0.091 57±0.001 72)mmol(/L·min),respectively.

Key words:sucrose phosphorylase;kojibiose;Escherichia coli;heterologous expression;enzyme properties

DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2024.23.026

基金项目:大学生创新创业训练计划项目(202410069212、202310069097);天津市科技计划项目(20YFZCSN00630)

作者简介:朱乐婷(2000—),女(汉),硕士研究生,研究方向:食品酶资源的挖掘及应用。

*通信作者:张宏宇(1984—),男(汉),副教授,博士,研究方向:食品酶资源的挖掘及应用。

引文格式:

朱乐婷,宋文军,娄婷婷,等.青春双歧杆菌蔗糖磷酸化酶诱导表达条件的优化及其酶学性质[J].食品研究与开发,2024,45(23):194-202.

ZHU Leting,SONG Wenjun,LOU Tingting,et al. Induced Expression Condition Optimization and Enzymatic Property Characterization of Sucrose Phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis[J]. Food Research and Development,2024,45(23):194-202.

加工编辑:张昱

收稿日期:2024-07-03