酵母菌的应用已有近万年的历史,其在应用开发和基础理论研究中均发挥着重要的作用。已发现的酵母菌可达1 500 种,仅占酵母菌总量的1%[1]。近年来随着生物多样性逐渐成为世界的主题,许多酿酒酵母和非酿酒酵母的生物多样性自然也越来越受到关注。现阶段,酿酒酵母的开发利用方面取得了巨大成功,特别是在酿酒酵母等现代生物技术的应用方面[2]。于淼等[3]利用基因工程构建菌株Y1-2 发酵生产低醇葡萄酒的工艺条件,能保留葡萄酒的风味和营养物质。Peng 等[4]报道了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)通过应用压力对涉及微生物的工业过程的影响,阐明细胞对高压反应的分子机制。Zeng 等[5]进行3 种不同分子量枸杞多糖的结构性质和生物活性的比较研究,研究人员筛选的野生酿酒酵母菌株驯化后,在高渗压下的麦芽转化率高于野生酿酒酵母。Tian 等[6]通过常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)、高通量筛选(hingh-throughput screening,HTS)和实验室适应性进化(laboratory adaptive evolution,ALE)组成的多步骤筛选策略,筛选在葡萄酒生产中表现更加优良的耐酸酵母菌株。
枸杞(Lycium barbarum)作为宁夏五大瑰宝之一,它具有广泛的药用特性,包括免疫调节、抗衰老、抗肿瘤和抗疲劳等[7],各种枸杞饮料和枸杞红酒等深加工产品也得到了推广[8]。王奇盛[9]对异常威克汉姆酵母的筛选及其对米酒发酵的风味进行研究。慕丽琴等[10]从色泽、香气、酸度等方面研究枸杞酒的酿造工艺,得到具有半透明红宝石色泽、酒香淡雅的枸杞酒。近些年,关于酿酒酵母的酒精耐受性、乙酸耐受性等基本耐受性的研究也逐渐增加[11]。
内生菌作为一种极其丰富的微生物资源,对生物体之间竞争与生存关系的了解以及丰富微生物多样性均具有重要的意义[12]。自然环境中分布着丰富的酵母菌,国内外学者从许多植物或果实中分离出具有多种生物活性成分的内生酵母菌,并广泛应用于癌症、传染病等的治疗和研究[13],以及食品着色剂[14]、酒精发酵[15]等研究中。目前,由于鲜枸杞采摘后很容易产生烂果现象,不易贮存和长途运输,导致菌株的适应性较低,酿造后风味不佳[16],严重抑制了枸杞的开发和应用。国内外对于枸杞的研究主要集中于酵母菌多样性及其相关应用。而对枸杞中另一类特殊的酵母菌——内生酵母菌的种类及其应用的研究较少。
本研究从宁夏地区鲜枸杞中筛选出内生酵母菌,进行分子生物学鉴定、生化分析、耐受性测定及发酵特性分析,以期获得可开发利用的发酵性能良好的枸杞酒专用酿造酵母菌菌种资源,提高枸杞酒的质量和风味,推动枸杞产业向多元化方向发展。
1.1.1 材料
枸杞:采集于宁夏枸杞产业发展中心青铜峡甘城子枸杞试验示范基地。采集的枸杞品种为‘宁杞七号’。
1.1.2 化学试剂
氯化钠、氢氧化钠(均为分析纯):徐州天鸿化工有限公司;酵母浸粉、磷酸二氢钾、浓盐酸、葡萄糖(均为分析纯):天津致远化学试剂有限公司;蛋白胨、琼脂:南京茂捷微生物科技有限公司;乳糖、D-半乳糖、蔗糖、柠檬酸、无水乙醇、硝酸钾(均为分析纯):天津市北辰方正试剂厂;甘露醇:北京索莱宝科技有限公司;酵母菌基因组提取试剂盒:北京天根生化科技有限公司。
1.1.3 培养基
YPD 培养基:1% 酵母浸粉,2% 葡萄糖,2% 蛋白胨,若制固体培养基,加入2% 琼脂粉,加蒸馏水定容至1 L。
WL 营养琼脂培养基:酵母浸粉5.0 g、酸水解酪蛋白5.0 g、氯化铁0.002 5 g、硫酸锰0.002 5 g、磷酸二氢钾0.55 g、氯化钾0.425 g、氯化钙0.125 g、硫酸镁0.125 g、溴甲酚绿0.022 g、葡萄糖50.0 g、琼脂20.0 g,加蒸馏水定容至1 L。
碳源同化试验培养基:硫酸氨2.0 g、硫酸镁0.2 g、磷酸二氢钠0.5 g、氯化钙0.1 g、磷酸氢二钾0.5 g、琼脂20.0 g,加蒸馏水定容至1 L。
以上培养基均于121 ℃灭菌20 min,pH 自然。
SW-CJ-1FD 型超净工作台:上海析牛科技公司;N4 型紫外分光光度计、HPS-250 型恒温恒湿培养箱、KG-SX-500 型全自动高压灭菌锅、TGL16 型高速离心机、G80F23CN1P-G5 型微波炉:上海仪电分析仪器有限公司;MotiConnect 型光学显微镜、CP224C 型电子天平:常州市幸运电子设备有限公司;BPG-9240A 型烘干箱:上海一恒科技有限公司;PHS-3C 型pH 计:雷磁分析仪器厂;VDRTEX Point-2 型振荡器:海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.3.1 枸杞内生酵母菌的分离、纯化
选取新鲜无烂果的枸杞果实10 g,清洗后,在无菌操作下用无菌水冲洗2~3 次,用75%乙醇溶液浸泡3 min,无菌水再次冲洗2~3 次,用次氯酸钠溶液消毒5 min,用无菌水漂洗3 次。消毒后置于100 mL 无菌水,加20 g 蔗糖,进行28 ℃摇床培养箱富集培养48~72 h,培养基变混浊,即有酵母菌生长。将培养箱中枸杞富集液取出,稀释浓度为10-1~10-8,选取10-5、10-6、10-7、10-8 梯度稀释液,分别吸取100 μL 稀释液在YPD固体培养基上进行涂布,培养时间为4 d,培养温度为28 ℃,从平板中挑取不同形态和颜色的单个菌落,分离纯化4 次以上,观察菌落形态并记录特征。
甘油低温冷冻保藏:将分离纯化好后的酵母菌,用YPD 液体培养基在28 ℃培养24~48 h,保藏在甘油中(菌液与60%甘油体积比为1∶1),冻存于-20 ℃冰箱,备用。
1.3.2 枸杞内生酵母菌的分子学鉴定
DNA 提取:使用酵母菌基因组提取试剂盒提取5 株内生酵母菌DNA,使用通用引物ITS1、ITS4 菌株DNA 进行扩增,引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系20 μL:10 μL Taq Plus Master Mix,正反向引物各1 μL,DNA 模板2 μL,双蒸水6 μL。
PCR 循环条件:预变性95 ℃5 min,变性95 ℃30 s,退火55 ℃30 s,延伸72 ℃10 min,35 个循环,修复延伸72 ℃10 min,终止反应4 ℃保存。将提取DNA的菌株进行PCR 后测序。
系统发育树构建:通过基因测序,登入NCBI 基因库,PCR 扩增所得5 个酵母菌基因序列提交至美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)中Blast 比对,比较测序菌株与已知的酵母菌基因库中序列之间的相近程度,选取Gen-Bank 中相似度最高的已知序列,通过ClustalX 比对后,应用MEGA 5.1 分析软件采用邻接法构建系统发育树。
1.3.3 生长曲线的绘制
配制YPD 液体培养基,灭菌,取50 支试管,在试管中分别加入150 μL 的酵母菌和4.5 mL 的液体培养基。在28 ℃的条件下连续培养40 h,分别在第0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 小时取菌液于比色皿中,并用YPD液体培养基作为对照,采用紫外分光光度计测定OD600 nm值,每个菌株做3 个重复,绘制酵母菌生长曲线。
1.3.4 碳源同化试验
选择7 种碳源,包括半乳糖、D-半乳糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、甘露醇。将用打孔器打有5 mm孔径的滤纸片灭菌,干燥后放置于不同碳源溶液中,分别将浸透后的滤纸片取出放置碳源培养基上,28 ℃培养3 d,取出后观察不同碳源培养基上酵母菌的生长状况,并分析最适合酵母菌所生长的碳源。每种菌株进行3 组平行试验,以无碳源的灭菌水作为空白对照[17]。
1.3.5 枸杞内生酵母菌耐受性测定
1.3.5.1 温度耐受性试验
取100 μL 待测菌液加入5 mL YPD 液体培养基中,分别在15、20、25、30、35、40 ℃下培养3 d,每个菌株重复3 次,用分光光度计测定OD600 nm 值。
1.3.5.2 低pH 耐受性试验
将YPD 液体培养基的pH 值分别调节为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0。取5 mL YPD 液体培养基分装于试管中加入100 μL 待测菌液放置于28 ℃下培养3 d,每个菌株重复3 次,用分光光度计测定OD600 nm 值。
1.3.5.3 酒精耐受性试验
在YPD 液体培养基内分别添加5%、10%、15%、20%、25% 的无水乙醇,每支试管中取5 mL YPD 液体培养基加100 μL 菌液放置于28 ℃培养3 d,每个菌株重复3 次,用分光光度计测定OD600 nm 值。
1.3.6 发酵性能测定
1.3.6.1 酒精发酵试验
分别挑纯化后的单菌落菌株于YPD 固体培养基,28 ℃静置发酵8 d,采用蒸馏测重法测量发酵液的酒精度。
1.3.6.2 糖发酵试验
将100 μL 菌悬液添加到发酵管内,并加入7.2 mL YPD 液体培养基和0.8 mL 10%的葡萄糖灭菌液,放入杜氏小管后密封,摇匀后将其放在28 ℃恒温培养箱中培养24~48 h,在培养过程中注意观察杜氏管内是否有气体积存积量。前3 d 每天记录一次,从第4 天开始每2 h 记录一次。每个菌株做3 组平行试验,以不加糖的发酵管为空白对照。
采用Excel 2016 软件进行统计分析及绘图;采用MEGA 5.1 软件构建系统发育树确定菌株种属名。
通过富集培养和划线分离,共分离得到酵母菌25 株。对菌株进行菌落形态和个体形态对比,最终得到5 株生长状况良好且形态不同的酵母,分别编号为M1、M9、M16、M17、M19。个体形态如图1 所示。
图1 YPD 平板划线分离纯化酵母菌个体形态
Fig.1 Individual morphology of isolated and purified yeasts through YPD plate streaking
由图1 可知,采用平板划线法,分离纯化酵母菌,得出M1 呈现2~4 mm 白色,圆形;M9 呈现2~6 mm乳白色,圆形;M16 呈现3~7 mm 乳白色,圆形;M17呈现2~6 mm 奶油色小圆形;M19 呈现2~8 mm 乳白色,扁平,菌落为圆形、光滑、有酒香味,细胞为椭圆形,符合酵母菌特征[18]。根据菌落培养基生长和细胞形态特征初步筛选出菌株M1、M9、M16、M17 和M19为酵母菌。
各菌株在WL 培养基上涂布培养3 d 后,M1、M9、M16、M17、M19 菌株的单菌落形态特征和显微镜下细胞形态如图2 和图3 所示。
图2 各菌株在WL 营养琼脂培养基上的菌落形态
Fig.2 Morphology of WL nutrient agar medium
图3 分离菌株的细胞形态(40 倍)
Fig.3 Cell morphology of isolated strains(×40)
由图2、图3 可知,M1 菌落呈深绿色,中间凸起,光滑,透明,乳白色,边缘光滑,M1 菌落形态为圆形,细胞形态为椭圆、有芽体。M9 菌落呈浅绿色,球形,凸起,表面光滑、不透明、乳白色,边缘光滑;菌株M9 的菌落形态为圆形,细胞为椭圆、有芽体。M16 菌落呈乳白色,透明发亮,呈浅绿色,呈球形和凸起,表面光滑、边缘光滑;菌株M16 的菌落形态为圆形,细胞为椭圆、有芽体。M17 菌落呈淡绿色,表面光滑,中心凸起,不透明,奶油状,边缘光滑;菌株M17 的菌落形态为圆形,细胞为圆形、有芽体。M19 菌落呈乳白色,球形凸起,表面光滑,不透明,奶油状;菌株M19 的菌落形态为椭圆形,细胞为椭圆中间凹陷、有芽体。
对样本的DNA 基因进行PCR 扩增,采用20 μL体系扩增ITS1、ITS4 区后,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图4 所示。
图4 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig.4 Results of agarose gel electrophoresis detection for amplified product
由图4 可知,菌株的扩增条带出现在500~750 bp,且十分明亮。因此达到了对酵母菌的26S rDNA 基因的PCR 扩增目的[16]。
酵母菌系统发育树见图5。
图5 酵母菌系统发育树
Fig.5 Phylogenetic tree of yeast
由图5 可知,M1 和OP795935.1 Saccharomyces cerevsiae 聚集在同一分支,亲缘关系近,其序列相似性达到95%。M17 和M9 和KT175181.1 Wickerhamomyces anomalus 聚集在同一分支,亲缘关系近,在Gen-Bank 数据库中进行对比,其序列相似性达到97%。M16 和OM523881.1 Clavispora lusitaniae isolate 聚集在同一分支,亲缘关系近,在GenBank 数据库中进行对比,其序列相似性达到99%。M19 和KY105893.1 Wickerhamomyces anomalus 聚集在同一分支,亲缘关系近,在GenBank 数据库中进行对比,其序列相似性达到98%。结合形态学鉴定,可将菌株分别鉴定为M1酿酒酵母(Saccharomyces cerevsiae)、M9、M17 和M19 为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、M16为葡萄牙麦棒孢酵母(Clavispora lusitaniae isolate)[19]。
3 株内生酵母菌的生长曲线见图6。
图6 3 株内生酵母菌的生长曲线
Fig.6 Growth curve of 3 endophytic yeasts
由图6 可知,3 株酵母菌在发酵40 h 内的生长曲线趋势大致相同。发酵液经过16 h 处理后,每株酵母菌的OD600 nm 值均剧增,此时是对数生长阶段,每个菌株都需要耗氧、糖和各种营养物质来快速生长[20]。各酵母菌株的OD600 nm 值均表现为32 h 时开始缓慢下降。此时酵母菌已经进入酒精发酵的厌氧呼吸阶段,将糖转化为酒精和二氧化碳,消耗大量糖类物质。每种酵母菌的积累和沉淀都有所减少,菌株培养液也逐渐澄清。因此,菌株M1 的生长速率最快,在8 h 时进入对数期生长阶段;24 h 时,所有菌株吸光度均达到最大值,M1 为6.425,之后进入稳定期,32 h 后所有菌株进入衰退期。
碳源同化试验见表1。
表1 碳源同化试验
Table 1 Carbon source assimilation test
注:+表示阳性反应,+数量越多表示酵母菌生长量越大。
碳源半乳糖D-半乳糖柠檬酸葡萄糖甘露醇乳糖蔗糖菌株编号M1++++++++++++M9++++++++++M16+++++++++++
碳是酵母细胞的重要组成部分,为酵母提供能量。酵母菌利用各种碳源,因酵母菌种类不同而最适利用的碳源也不同[21]。由表1 可知,M1、M9 和M16 菌株在任何碳源都可以生长,当碳源为葡萄糖时,酵母菌数量较多。
2.6.1 温度耐受性试验
内生酵母菌温度耐受性试验结果见图7。
图7 温度耐受性试验结果
Fig.7 Results of temperature resistance test
由图7 可知,在15~40 ℃试验范围内,大多数酵母菌的最佳生长温度为25~30 ℃。菌株M1 和M9 的OD600 nm 值在15~20 ℃增长较快,较其他菌株更耐低温。M16 的OD600 nm 值在15~20 ℃增长较缓,说明耐低温能力较差。菌株M1、M9 和M16 高温下仍然可以缓慢生长。酵母菌生长受温度影响,温度过低,容易抑制酶活力,导致细胞新陈代谢能力降低,延缓酵母菌的生长,浪费能源。而高温对酵母细胞有一定的破坏作用,温度升高,破坏正常的发酵活动,从而将消耗某些特定的香味物质和酒精。
2.6.2 低pH 耐受性试验
低pH 耐受性试验结果见图8。
图8 低pH 耐受性试验结果
Fig.8 Results of low pH resistance test
在pH 值为4.5~5.5 时酵母菌可以正常的进行生理和代谢。由于酸性环境中能够抑制杂菌的生长,因此筛选出具有耐酸的酵母菌对发酵产业有很大的意义。由图8 可知,随着pH 值的增大,OD600 nm 值增大。所有菌株在pH 值为2.0 以下时几乎不生长,在pH 值为2.0 以上时开始缓慢的生长。在pH3.0 时,菌株M1的OD600 nm 值最大,表明M1 的耐酸能力最好。
2.6.3 酒精耐受性试验
酒精耐受性试验结果见图9。
图9 酒精耐受性试验结果
Fig.9 Results of alcohol resistance test
由图9 可知,当酒精度升高时,酵母菌细胞的生长和发育受到抑制,发酵活性下降。可以说,酒精既是酵母菌发酵的产物,同时又是酵母菌的抑制剂。在酒精度为10% vol 时,菌株M9、M16 的OD600 nm 值为0.10,菌株M1 的OD600 nm 为1.50,菌株M1 酒精的耐受性高于其他菌株。酒精度高于20% vol 的情况下所有菌株不生长。
2.7.1 酒精发酵试验
酒精发酵试验结果见图10。
图10 酒精发酵试验结果
Fig.10 Result of alcohol fermentation test
在培养8 d 后菌株M1、M9、M16、M17、M19 都具浓郁酒香味和果香味。菌株M1、M16 和M9 的性能比较突出,因此用作比较酒精发酵试验,测定其酒精度。由图10 可知,M1 酒精度为1.1% vol、M9 酒精度为0.9% vol,M16 酒精度为1.53% vol,因此菌株M16 和M1 的性能比较突出。
2.7.2 糖发酵试验
本试验采用杜氏管发酵法观察5 株酵母菌的产气情况,从中筛选出具有产气性能且沉淀良好、发酵液气味适宜的酵母菌株。菌株糖发酵试验如图11 所示。
图11 菌株糖发酵试验结果
Fig.11 Results of strain sugar fermentation
由图11 可知,将菌种接入液体培养基中,接种24 h后开始产生气泡[图11(a)],48 h 时产生气泡较多[图11(b)],72 h 时气泡消失,发酵液表面无菌蹼,发酵结束后,培养基澄清,容器底部有乳白色沉淀物[图11(c)]。28 ℃培养3 d 后,菌株M9 产气量少,但沉淀良好,有一定的芳香味。菌株M1 和M16 具有较好的产气性能。
糖发酵试验是基于不同微生物具有不同酶系统的原理,检测不同微生物利用各种碳源的能力。绝大多数酵母可以利用糖作为碳源提供生长条件,但它们分解糖的能力各有不同,糖发酵试验结果见表2。
表2 糖发酵试验
Table 2 Sugar fermentation test
注:+表示产气,+数量越多表示产气量越大。
菌株编号M1 M9 M16产气情况+++++++++菌株凝聚性沉淀良好沉淀良好沉淀良好发酵液气味酒香味果香味酒香味浓郁
酵母菌株在发酵过程中起着至关重要的作用,广泛的应用于食品和工业生产中,需要满足发酵活性良好,耐受乙醇、低pH、乙酸等条件,才能更好地适应发酵的环境[21]。本研究耐受性测定结果表明,菌株M1和M16 有较好温度、酒精和pH 耐受性,可以满足枸杞酒发酵酿造的要求。通过发酵性能测试,菌株在相同发酵时间内,M1 和M16 发酵酒精度高,发酵的枸杞酒香气浓郁、具有枸杞典型风味,发酵性能均优于M9。均与李亚辉等[22]枸杞内生酵母菌的筛选及其发酵特性研究的结论一致。但本研究中对内生酵母菌进行了分子鉴定确定为酿酒酵母、葡萄牙麦棒孢酵母和异常威克汉姆酵母。冯炘等[16]对葡萄中酵母菌进行筛选及菌株鉴定,对分离出的9 株酵母菌进行碳源同化和糖发酵试验,结果表明,9 株酵母菌都可以利用葡萄糖进行发酵,并可在以葡萄糖、蔗糖和半乳糖为碳源的培养基上生长,生长状况良好,呈阳性,本研究碳源同化试验与其结果一致。目前,很多研究者从不同材料中挖掘筛选酵母菌,杜艾明等[23]用WL 培养基从黄鹤楼清香型白酒大曲和酒醅中共分离筛选得到119 株酵母菌,分为五大类型,分别为酿酒酵母、东方伊萨酵母(Issatchenkia)、异常威克汉姆酵母、扣囊腹膜孢酵母(Saccharomycopsis)和扁平云假丝酵母(Candida humilis),其中酿酒酵母和异常威克汉姆酵母在数量上占优势。Iturritxa 等[24]分析了森林和葡萄园生态系统野生酵母菌株的酿造能力,并与商品酵母菌株进行了比较。Ruggirello 等[25]从发酵和干燥可可豆中分离出酿酒酵母,并评估其抗真菌活性。Yalçin 等[26]从爱琴海和马尔马拉地区采集的树皮样本及腐烂水果样本中成功分离并筛选了1 种酵母菌株,并确定其产生工业上重要的细胞外酶的能力。而本研究从宁夏枸杞鲜果筛选酵母菌,通过分子鉴定技术筛选出酿酒酵母、葡萄牙麦棒孢酵母和异常威克汉姆酵母,并对其发酵特性进行研究,发现其可以产生酒香味和果香味。
本研究从宁夏枸杞‘宁杞7 号’分离的内生酵母菌,筛选出1 株酿酒酵母M1,筛选出1 株发酵性能良好的非酿酒酵母M9 为异常威克汉姆酵母和1 株葡萄牙棒孢酵母M16。酿酒酵母M1 具有较好的温度耐受性、pH 耐受性和酒精耐受性,因此M1 具有较好的耐受性。发酵性能测定表明菌株M16 和M1 发酵性能和产气能力比较突出。
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