蛋白酶解是制备生物活性肽的主要方法之一,微生物源蛋白酶具有生产成本低、方便提取、工艺简单等优点,是酶制剂的主要来源,并被广泛应用于工业中[1]。生物活性肽的开发是食品生物技术的研究热点,已发现其具有抗氧化[2]、抗高血压[3]、降血糖[4]、抗菌[5]、降胆固醇[6]、免疫调节、抗疲劳作用和抗衰老[7]等作用,还可开发功能性食品和营养药品用于预防和治疗慢性疾病。万端极等[8]利用低值海产品及海产品下脚料制备了功能性呈味肽;Jiang 等[9]从海马中提取出抗氧化肽;Yathisha 等[10]通过蛋白酶酶解鱼类副产物获得了抗高血压肽;Chen 等[11]从牡蛎水解物中制备活性肽可以促进哺乳。蛋白酶具有底物选择性,选用适宜的酶是制备生物活性肽的关键。
鲬鱼(Platycephalus indicus)俗称狗腿鱼,属于暖水性底层鱼类,分布于太平洋和印度洋,在我国黄海与渤海产量大,也是海州湾重要的经济鱼类之一[12]。鲬鱼价格低、蛋白质含量丰富,是具有开发潜力的鱼类资源。近年来,鲬鱼养殖和加工也逐渐成为沿海地区的新兴支柱产业之一[13]。然而,鲬鱼加工副产物利用率低,存在资源浪费和环境污染问题,亟需提高副产物的利用率[14]。目前,海洋生物来源的抗氧化肽成为新的研究热点[15]。鱼类及其副产品来源的抗氧化肽结构新颖、更益于人体健康,受到广泛的关注。余辉等[16]从细点圆趾蟹含肉下脚料酶解物中分离出一种新型抗氧化肽,其氨基酸序列被鉴定为Tyr-Glu-Gly(YEG),其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基表现出良好的清除活性。Rajapakse 等[17]从海洋蓝贻贝中分离得到一个七肽序列HFGBPFH,清除超氧化物、羟自由基、碳中心和DPPH 自由基的IC50值分别为21、34、52、96 μg/mL。综上,酶解海产品加工副产物具有较好的抗氧化活性,可以大幅提高产品的附加值,减少环境污染。
本文从海州湾海泥中筛选得到一株产蛋白酶的芽孢杆菌H-1,并对其产蛋白酶的条件和酶学性质进行研究,并利用该酶水解鲬鱼加工副产物制备生物活性肽,以期为鲬鱼加工副产物的精深加工和综合利用提供参考。
鲬鱼:市售,加工副产物制浆并冻干,于-80 ℃保存备用;福林(Folin)试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、酵母粉、NaOH、HCl、谷胱甘肽、β-巯基乙醇、半胱氨酸、变性剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、尿素、苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride,PMSF)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、TritionX-100、吐温80、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、乙酸乙酯:上海阿拉丁生化科技股份有限公司;革兰氏染色试剂盒、芽孢染色试剂盒:北京索莱宝科技有限公司;生理生化试剂管:杭州滨河微生物试剂有限公司;细菌DNA 提取试剂盒:天根生化科技有限公司;DPPH 自由基清除能力检测试剂盒:上海酶联生物科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
全波长酶标仪(UMR-960):美国赛默飞世尔科技公司;pH 计(FE28):上海仪电科学仪器股份有限公司;高速冷冻离心机(GL-21M):艾本德中国有限公司;真空冷冻干燥机(LEG-100FG):上海巴玖实业有限公司;恒温水浴锅(DK-8D):上海一恒科学仪器有限公司;扫描电子显微镜(JFC-1600):日本Tokyo 公司。
1.3.1 培养基制备
LB 培养基:酵母粉5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,氯化钠30 g/L,pH7.4。筛选培养基:酵母粉10 g/L,干酪素10 g/L,琼脂20 g/L,用陈海水(过滤)配制,pH7.2。种子培养基:酵母粉5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,陈海水配制,pH7.2。发酵产酶培养基:酵母粉10 g/L,干酪素10 g/L,陈海水配制,pH7.2。
1.3.2 蛋白酶活力测定
采用福林酚法[18]测定蛋白酶活性并进行适当修改。经过发酵48 h、10 000 r/min 离心后,得到1 mL 蛋白酶液,与1 mL 2% 酪蛋白溶液(pH8 硼酸缓冲液配制)在55 ℃水浴10 min 后,加入0.5 mL 福林试剂,在680 nm 处测定吸光度。一个单位的蛋白酶活性定义为每分钟酶解1 μg 酪氨酸的酶数量。
1.3.3 产蛋白酶菌株的筛选
初筛:称取1 g 的活性泥样,用无菌水梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 和10-6,用移液枪吸取200 μL于筛选培养基上涂布,于30 ℃培养48 h,对产生透明圈的菌株进一步分离纯化并保存。
复筛:将初筛得到的菌株接种培养,2%接种发酵产酶培养基,于35 ℃、180 r/min 培养48 h,5 000×g 离心30 min,取上清液(粗酶液)测定蛋白酶活力。
1.3.4 菌株的鉴定
将菌株接种于酪蛋白培养基,30 ℃培养24 h,观察菌落特征;通过染色和扫描电镜观察菌株形态。扫描电镜制样:将菌株接种于LB 培养基,置于30 ℃、180 r/min摇床培养12 h。7 000×g 离心3 min,弃上清液。用0.2 mol/L、pH7.4 的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗后,采用2.5% 戊二醛固定菌体,4 ℃固定12 h,然后,取5 μL 菌液,依次加入浓度为30%、50%、70%、80%、90%、100% 乙醇脱水[19],采用扫描电子显微镜观察菌株形态。
生理生化:取100 μL 种子液加入生理生化试剂管,于30 ℃培养24 h,根据使用说明书判断阳性或阴性。
分子生物学鉴定:采用试剂盒提取菌株的基因,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术对其16S rDNA 序列进行扩增。将PCR 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,将测序结果与国际生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库同源性进行比对,选取同源性高的菌株,用软件MEGA 7 的Neighbor-Joining 法绘制系统发育树。
1.3.5 菌株的产酶条件优化
将菌株制备种子液,以2% 接种量接种至发酵产酶培养基,将发酵液10 000 r/min 离心后得到上清液,测定不同碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木薯淀粉、可溶性淀粉、酵母粉、马铃薯淀粉、糊精)、不同氮源(氯化铵、尿素、牛肉浸膏、硫酸铵、蛋白胨、豆粕、鱼粉蛋白胨、酪蛋白、花生粕)、不同发酵温度(20、25、30、35、40、45、50 ℃)、不同初始pH 值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、不同发酵时间(0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h)、不同NaCl 浓度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%)下的相对酶活,研究菌株发酵产酶特性。其中2-氨基乙磺酸[2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid,MES]、、4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid,HEPES]、甘氨酸-氢氧化钠(glycine-NaOH,Gly-NaOH)缓冲液用于调节pH 值。
1.3.6 蛋白酶的性质测定
温度、pH 值对酶活力影响:将粗酶液置于不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65 ℃)、pH 值(5、6、7、8、9、10)条件下,根据下列公式测定蛋白酶活力,比较温度、pH 值对蛋白酶活力的影响。
式中:M 为酶活力,U/g;c 为由标准曲线得出的蛋白酶水解产生的L-酪氨酸浓度,μg/mL;V 为反应试剂的总体积,mL;n 为样品的稀释倍数;m 为样品的质量,g;10 为反应时间,min。
相对酶活计算公式如下。
式中:Y 为相对酶活,%;X 为未处理样品酶活力,U/g;M 为已处理样品酶活力,U/g。
温度、pH 值稳定性:将粗酶液于不同温度(45、50、55、60、65 ℃)、pH 值(5、6、7、8、9、10)条件下分别放置20、40、60、80、100 min,测定蛋白酶活力,比较酶的温度、pH 值的稳定性。
金属离子对酶活力影响:按照10 mmol/L 和50 mmol/L 的金属离子终浓度,选用Ca2+、K+、Fe3+、Co2+、Mg2+、NH4+、Li+、Mn2+等离子的氯化物配制金属离子溶液,测定两种浓度的不同金属离子对酶活力的影响。
还原剂、变性剂和有机溶剂等对蛋白酶活力的影响:参照Zhu 等[20]的方法并适当改动,选取还原剂谷胱甘肽、β-巯基乙醇、半胱氨酸,变性剂SDS、尿素,蛋白酶抑制剂PMSF、EDTA,表面活性剂TritionX-100、吐温80,有机溶剂甲醇、乙醇、二甲基亚砜、乙酸乙酯,并配制成相应浓度,测定各化合物对酶活力的影响。
1.3.7 鲬鱼副产物的酶解
称取鲬鱼副产物冻干粉1 g,固液比为1∶10(g/mL),酶添加量为5%,温度为55 ℃,pH8 酶解3 h,8 000×g离心30 min,上清液用8 kDa 膜超滤,分离得到分子量小于8 kDa 的组分R-1,冻干后保存于-80 ℃备用。
1.3.8 酶解产物组分R-1 的抗氧化活性
参照Hu 等[21]抗氧化活性的测定方法,并对其进行适当修改。将组分R-1 按照2、4、6、8、10 mg/mL 浓度配制成水溶液,测定抗氧化活性。
1.3.8.1 DPPH 自由基清除活性
采用DPPH 自由基清除能力检测试剂盒检测DPPH 自由基清除活性,0.4 mL 的组分R-1 与0.6 mL的工作液混合均匀,置于暗环境反应30 min,4 000×g离心5 min,测定517 nm 处吸光度。80% 甲醇和工作液为空白,样品和80%甲醇混合液为对照,DPPH 自由基清除率(X,%)计算公式如下。
式中:A 为DPPH 工作液和组分R-1 的混合物的吸光度;B 为组分R-1 和80%甲醇混合物的吸光度;C为DPPH 工作液和80%甲醇混合物的吸光度。
1.3.8.2 超氧阴离子自由基清除活性
将0.2 mL 组分R-1 和1 mL 50 mmol/L Tris-HCl 混合,25 ℃温育10 min,立即加入30 μL 6 mmol/L 邻苯三酚,室温放置30 min,测320 nm 处吸光度。超氧阴离子自由基清除率(Y,%)计算公式如下。
式中:A 为0.2 mL 组分R-1+1 mL Tris-HCl 缓冲液+30 μL 邻苯三酚溶液的吸光度;B 为0.2 mL 组分R-1+1 mL Tris-HCl 缓冲液+30 μLHCl 溶液的吸光度;C 为0.2 mL 水+1 mL Tris-HCl 缓冲液+30 μL 邻苯三酚溶液的吸光度。
1.3.8.3 羟基自由基清除活性
将0.1 mL 9 mmol/L FeSO4·7H2O、0.1 mL 9 mmol/L水杨酸、0.1 mL 组分R-1 和0.1 mL 0.03% H2O2 混匀,37 ℃下温育15 min,测定510 nm 处吸光度。羟基自由基清除率(Z,%)计算公式如下。
式中:A 为不加样品的吸光度;B 为加样品后的吸光度;C 为空白试剂的吸光度。
1.3.8.4 还原力
抗氧化剂能够将三价铁离子还原成二价铁离子,氧化铁与氯化铁反应可生成普鲁士蓝,利用普鲁士蓝在700 nm 处有最大吸收峰的原理,研究酶解产物R-1 的还原力。吸取0.20 mL 的组分R-1、0.20 mL 的0.2 mol/L PBS 溶液(pH6.6)、0.20 mL 的1% K3Fe(CN)6混匀,50 ℃下温育20 min。加入0.20 mL 10% 三氯乙酸,5 000×g离心10 min。取0.5 mL 上清液、2.5 mL 超纯水和0.1 mL 0.2% FeCl3 混匀。室温下放置10 min 后,测定700 nm处吸光度。
所有试验均设3 个平行,数据为平均值±标准差;采用SPSS 软件进行方差分析。
将复筛蛋白酶活力高的10 株菌接种于发酵培养基,于35 ℃、180 r/min 摇床中发酵48 h,将粗酶液酶解鲬鱼冻干粉,得到一株蛋白酶活力最高的菌株,命名为H-1,其菌落形态特征见图1。
图1 H-1 菌落形态特征
Fig.1 Colony and cell morphology of strain H-1
由图1 可知,H-1 菌落呈淡黄色,菌落较大,其菌落边缘不整齐,表面粗糙、有褶皱,在酪蛋白培养基上可以产生较大的透明圈。在扫描电镜及显微镜油镜下观察为杆菌、革兰氏阳性、有芽孢。
菌株H-1 生理生化结果见表1。
表1 菌株H-1 生理生化特性结果
Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain H-1
注:+表示阳性;-表示阴性。
项目革兰氏染色7% NaCl 耐盐pH5~8 生长V-P 试验明胶液化淀粉水解硝酸盐还原H2S 产气甲基红丙酸盐甘露醇山梨醇吲哚H-1+++++++-+-+ +-YJ15[22]+++++++-+-+ +-项目尿素葡萄糖蔗糖麦芽糖纤维二塘乳糖D-果糖木糖七叶苷水杨苷鸟氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶H-1++++++-++-- -YJ15[22]++++++-++-- -
由表1 可知,菌株H-1 的甲基红、V-P、硝酸盐还原、尿素等呈阳性,可在7% NaCl 条件下生长,可利用多种糖类,分泌尿素酶、淀粉酶等,与史璐欣[22]的研究结果基本一致。结合菌落形态特征和生理生化反应特征,参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》,初步鉴定菌株H-1 为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。
将菌株H-1 的16S rDNA 基因序列提交NCBI 数据库,在NCBI 数据库中Blast 的结果Jodi,其与Bacillus siamensis 的同源性为98%。选择MEGA7 构建系统进化树如图2 所示。
图2 菌株H-1 系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain H-1
由图2 可知,菌株H-1 与Bacillus siamensis 相聚。
2.2.1 碳源、氮源对菌株H-1 产酶性能的影响
碳源、氮源对菌株H-1 产酶性能的影响见图3。
图3 碳源、氮源对菌株H-1 产酶性能的影响
Fig.3 Effects of carbon and nitrogen sources on the protease production of strain H-1
如图3A 所示,菌株H-1 可在大部分碳源条件下产酶。最适碳源为酵母粉,其次是葡萄糖和麦芽糖,相对酶活大于80%。从图3B 可以看出,鱼粉蛋白胨为最适氮源,氯化铵、尿素、硫酸铵、牛肉浸膏、花生粕为氮源时,相对酶活较低。
2.2.2 发酵时间对菌株H-1 发酵产酶性能的影响
发酵时间对菌株H-1 产蛋白酶性能的影响见图4。
图4 发酵时间对菌株H-1 产酶的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the protease production of strain H-1
如图4 所示,在0~16 h,产酶速度缓慢,从16 h 到48 h 产酶逐渐增加,并在48 h 时达到最高。
2.2.3 发酵温度对菌株H-1 发酵产酶性能的影响
发酵温度对菌株H-1 产酶性能的影响如图5所示。
图5 发酵温度对菌株H-1 产酶的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on the protease production of strain H-1
如图5 所示,菌株在20~50 ℃均可产蛋白酶,25~35 ℃随发酵温度升高产酶速度加快,35 ℃后产酶速度逐渐变慢,最适发酵温度为35 ℃。
2.2.4 初始pH 值对菌株H-1 发酵产酶的影响
初始pH 值对菌株H-1 产蛋白酶的影响见图6。
图6 初始pH 值对菌株H-1 产酶的影响
Fig.6 Effect of initial pH on the protease production of strain H-1
如图6 所示,菌株H-1 在pH5~10 均可发酵产酶,在pH 值大于7 的条件下有利于产酶,最适产酶pH 值为8.0。
2.2.5 NaCl 浓度对菌株H-1 发酵产酶的影响
NaCl 浓度对菌株H-1 产酶的影响见图7。
图7 NaCl 浓度对菌株H-1 产酶的影响
Fig.7 Effect of NaCl concentration on the protease production of strain H-1
如图7 所示,菌株H-1 在NaCl 浓度为3% 时,菌株H-1 的产酶量最高。未添加NaCl 时不产酶,NaCl浓度大于3%时,产酶逐渐降低,NaCl 浓度过高不利于菌株产酶。这与Lu 等[23]的研究结果略有不同,可能是因为菌株的来源不同。
2.3.1 温度、pH 值对蛋白酶活性的影响
温度、pH 值对蛋白酶活性的影响见图8。
图8 温度、pH 值对蛋白酶活性的影响
Fig.8 Effects of temperature and pH on the protease activity
温度是影响酶活性的重要因素,如图8a 所示,蛋白酶在45~60 ℃相对酶活均在75% 以上,在55 ℃时相对酶活最高,60 ℃的相对酶活保持在80% 以上,比常见蛋白酶如中性蛋白酶(45~50 ℃)、碱性蛋白酶(40~55 ℃)、木瓜蛋白酶(50~60 ℃)更耐高温。如图8b所示,该酶在45~55 ℃下放置80 min 以内较为稳定,可保持50% 以上的相对酶活;在最适反应温度55 ℃下反应60 min,能够保持80% 以上的相对酶活;温度高于60 ℃时,相对酶活快速下降。
如图8c 所示,相对酶活在pH5~7 较低,pH8~10内较高,最适反应pH 值为8,结果表明该酶在弱碱性条件下活性较高。如图8d 所示,相对酶活在pH7~9时较高,pH>10 和pH<7 条件下相对酶活较低,在最适pH 值条件下100 min 可保持80%以上的活力。
2.3.2 金属离子对蛋白酶活性的影响
金属离子对蛋白酶活性影响如表2 所示。
表2 金属离子对蛋白酶活性的影响
Table 2 Effects of metal ions on the protease activity
金属离子空白Fe3+Co2+Mn2+Li2+K+NH4+Mg2+Ba2+Zn2+Ca2+相对酶活/%10 mmol/L 100.00±1.28 79.63±0.77 72.50±0.38 64.61±1.05 103.41±1.24 74.77±4.77 70.89±1.15 70.85±3.24 105.90±0.12 91.03±1.06 71.73±0.56 50 mmol/L 100.00±1.28 11.36±1.65 107.33±3.97 125.95±3.44 77.55±0.57 113.75±3.16 95.30±1.17 106.01±1.87 37.71±0.71 19.75±1.32 74.67±1.90
如表2 所示,在50 mmol/L 时,Co2+、Mn2+、K+、Mg2+对酶活有明显促进作用,Zn2+、Fe3+、Ba2+可以抑制该酶的活性。
2.3.3 化学试剂对蛋白酶活力的影响
化学试剂对蛋白酶活力的影响见表3。
表3 化学试剂对蛋白酶活力的影响
Table 3 Effects of chemical reagents on the protease activity
试剂种类空白还原剂变性剂蛋白酶抑制剂表面活性剂有机溶剂试剂名称超纯水谷胱甘肽β-巯基乙醇半胱氨酸SDS尿素EDTA PMSF TritonX-100吐温80甲醇乙酸乙酯二甲基亚砜乙醇乙醇乙醇终浓度10 mmol/L 10 mmol/L 10 mmol/L 10%4 mol/L 5 mmol/L 5 mmol/L 0.10%0.10%10%10%10%10%20%30%相对酶活/%100.00±0.47 93.32±1.58 89.41±1.22 98.63±2.12 71.00±0.48 78.32±1.65 79.27±2.56 52.75±0.78 77.83±1.50 119.89±2.61 113.24±1.55 45.43±1.48 111.58±2.87 104.31±0.45 29.90±1.23 21.33±0.84
如表3 所示,各种试剂对酶活力的影响较小,还原剂对蛋白酶没有促进作用,保留大部分活性;几种变性剂和蛋白酶抑制剂对酶均有抑制作用。有机溶剂中,乙酸乙酯对酶活力有较强抑制作用,10%终浓度二甲基亚砜、乙醇对酶活有促进作用,随着乙醇浓度的升高,乙醇对酶活力由促进转为抑制,且抑制效果逐渐明显。
2.3.4 酶解产物的抗氧化活性
酶解产物R-1 抗氧化活性结果见图9。
图9 酶解产物R-1 的抗氧化活性
Fig.9 Antioxidant activity of the enzymatic digestion product R-1
DPPH 是一种含有自由基的化合物,其性质稳定、价格低廉,常评估食品中各类物质的抗氧化活性[24]。如图9a 所示,DPPH 自由基清除率随着加样浓度升高而升高。当加样浓度10 mg/mL 时,产物R-1 的DPPH自由基清除率达80%,R-1 对DPPH 自由基的IC50 为1 mg/mL。
羟基自由基具有2.80 eV 的氧化电位,因而表现出极强的氧化能力,生物活性肽对羟基自由基具有较好的清除效果[25]。如图9b 所示,在加样浓度10 mg/mL 时,产物R-1 的羟基由基清除率达80%,略低于VC。
超氧阴离子自由基于生物体代谢过程中产生,使体内的蛋白质、脂质、核酸等生物大分子结构交链或断裂而丧失原有结构和活性功能,加速机体衰老,引起生物损伤和诱发疾病[26]。如图9c 所示,产物R-1 表现出较好的超氧阴离子自由基清除活性,在浓度10 mg/mL时其清除率达52.7%。
如图9d 所示,还原力随着加样浓度升高明显增大。 在加样浓度10 mg/mL 时,产物R-1 的还原力达0.51。
从海州湾海泥中筛选得到一株芽孢杆菌H1(Bacillus sp.),菌株H-1 蛋白酶的最适反应温度为55 ℃、pH 值为8,具有较好的温度和pH 稳定性,在谷胱甘肽、β-巯基乙醇等还原剂中具有良好的稳定性,50 mmol/L的CO2+、Mn2+、K+、Mg2+对酶活有明显促进作用,Fe3+、Ba2+、Zn2+对酶活力具有抑制作用。该蛋白酶水解鲬鱼加工副产物具有很好的抗氧化作用,其中,浓度为10 mg/mL 时,DPPH 自由基清除率80%、羟基自由基清除率80%、超氧阴离子自由基清除率52.7%,还原力0.51。该酶可以用于制备鲬鱼加工副产物的抗氧化肽。研究结果为鲬鱼精深加工、提高副产物的附加值和保护环境提供了依据。
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