烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是一种由烟酰胺基、核糖和磷酸基组成的天然生物活性核苷酸,具有α 和β 两种异构体形式,其中β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的前体,在体内可将烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)转变为NAD+,与细胞和生物体的衰老过程息息相关[1]。研究表明,人体的衰老与其体内NAD+水平密切相关,随着年龄的增加,人体内NAD+水平将逐渐降低,这种NAD+合成与消耗平衡的打破最终将导致衰老[2-3]及相关疾病(如阿尔茨海默病[4])的产生。有研究指出,当通过某种方式(如膳食补充[5]、运动[6]等)提高体内NAD+含量,机体衰老过程将有所减缓,这是因为NAD+可通过修复DNA 损伤、改善线粒体功能、诱导细胞自噬等方式延缓机体衰老[7],因此,NAD+被认为是抗衰老的潜在靶标,其类似物烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(niacinamide guanine dinucleotide,NGD)、烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(nicotinamide hypoxanthine dinucleotide,NADH)、黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)具有与NAD+相似的性质,在抗衰老、预防老年疾病问题上具有相似的作用。
实际上,NMN 广泛存在于各种天然食品中,如西蓝花、牛油果和生牛肉等[8-9],但其含量相对较低,日常进食不足以达到延缓衰老的目的。2020 年3 月,日本厚生劳动省批准了NMN 在食品生产中的使用,从而掀起了“不老药”风潮。目前,市面上有含有NMN 活性物质的食品大多以功能食品的形式出售,尽管目前有大量研究表明膳食补充NMN 有助于提高体内NAD+水平,进而延缓衰老、改善神经性疾病[10],但关于NMN 摄入的最佳剂量范围及长期服用的安全性尚未有充分的临床研究[11]。NMN 在我国并未获得药品、功能食品、食品添加剂和新食品原料许可,即NMN 不能作为食品进行生产和经营,但对于NAD+类似物在食品中的添加,目前仍未见报道。因此,对于食品,尤其是宣称具有抗衰老、预防老年疾病功能食品中NMN 及NAD+类似物含量的监测显得尤为重要。
目前,国内外有关的研究主要集中在NMN 和NAD+的合成制备[12-13]、功 效成分分析[14-15]以及医学[16-18]、食品和化妆品[19]领域方面的研究,对其检验检测分析方法的研究较少,且大多集中在果蔬[8,20-21]、茶叶[22]等天然食品中,再加上NMN 难挥发、极性大、易溶于水但难溶于有机溶剂的特性,限制了许多常规定量方法的应用,我国至今仍未出台NMN、NAD+及其类似物的相关检测标准。目前NMN 的检测方法主要有毛细管电泳法[23]、定量核磁共振法[24]、荧光酶联免疫法[25]、高效液相色谱法[26-27]和液质联用法[28-29]等,其中高效液相色谱法和液质联用法由于操作简单、普适性强,适合用于食品中NMN、NAD+及其类似物含量的检测。奶粉作为人们营养补充的重要来源,是潜在的NMN 强化食品。基于此,本研究采用高效液相色谱法,对奶粉中NMN、NAD+及其类似物进行检测,通过优化前处理和色谱条件,建立一种可同时测定食品中NMN、NAD+及其类似物的高效液相色谱法,以期为营养强化奶粉产品的研发和监管提供参考。
奶粉:市售;β-烟酰胺单核苷酸(纯度≥99.7%):上海安谱实验科技股份有限公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸标准溶液(纯度≥99.0%)、烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸标准溶液(纯度≥99.0%)、烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸标准溶液(纯度≥95.0%)、黄素单核苷酸标准溶液(纯度≥95.0%)、黄素腺嘌呤二核苷酸标准溶液(纯度≥97.0%):美国Sigma-Aldrich 公司;乙醇(纯度≥99.7%)、乙酸(纯度≥99.5%)、三氟乙酸(纯度≥99.0%)(均为分析纯):广州化学试剂厂;甲醇、乙腈、丙酮(均为色谱纯):德国Merck 公司。
2695/2998 液相色谱/二极管阵列检测器系统(highperformanceliquidchromatography-photo-diodearra,HPLC-PDA)、T3 分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm):美国Waters 公司;Venusil HILIC 分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm):美国艾杰尔-飞诺美公司;氨基分析柱(Athena,4.6 mm×250 mm,3 μm):上海安谱实验科技股份有限公司;C18 分析柱(Syncronis,4.6 mm×250 mm,5 μm):美国赛默飞世尔科技公司;MS3 basic 涡旋混合器:德国IKA 公司;Milli-Q 去离子水发生器:美国Millipore 公司;C18 固相萃取柱(BOND HC-C18 SPE 小柱,500 mg,6 mL)、氨基固相萃取柱(BOND NH2 SPE 小柱,500 mg,6 mL)、HLB 固相萃取柱(Poly-Sery HLB Pro SPE 小柱,500 mg,6 mL)、MCX 固相萃取柱(Poly-Sery MCX SPE 小柱,150 mg,6 mL):德国CNW 公司;正压48 孔处理装置:美国安捷伦公司;KDC-400 低速离心机:科大创新股份有限公司;有机相针式滤器(13 mm×0.22 μm):上海安谱科学仪器有限公司;XS205DU 电子天平(0.01 mg):瑞士梅特勒托利多公司。
1.3.1 色谱柱的选择
为考察色谱柱对NMN、NAD+及其类似物分离度影响,首先用初始流动相配制出浓度为50 mg/L 的NMN、NAD+及其类似物标液,然后分别选用C18 分析柱、T3 分析柱、氨基分析柱和Venusil HILIC 分析柱对其NMN、NAD+及其类似物进行分离,最终确定一条分离度最佳的色谱柱供后期试验使用。
1.3.2 提取溶剂的选择
为考察提取溶剂的种类及比例对NMN、NAD+及其类似物的影响,采用阴性样品加标回收的方式,探究添加量为10 μg/kg 条件下,去离子水、10%乙腈溶液、50%乙腈溶液、10%乙醇溶液、50%乙醇溶液、10%甲醇溶液和50% 甲醇溶液对奶粉中NMN、NAD+及其类似物提取效果的影响。
1.3.3 乙酸添加量的确定
为考察乙酸添加量对NMN、NAD+及其类似物的影响,本试验采用阴性样品加标回收的方式,探究添加量为10 μg/kg 条件下,在提取液中加入15、30、45、60、75 μL 乙酸对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响。
1.3.4 净化方式的选择
奶粉是复杂的食品体系,除蛋白质、多糖等高分子物质外,还含有大量易溶于水、可能对试验结果产生干扰的杂质,为进一步提高奶粉中NMN、NAD+及其类似物的测定准确性,需对样品进行进一步净化。考察C18、氨基、HLB 和MCX 4 种固相萃取柱对NMN、NAD+及其类似物加标回收率的影响。
1.3.5 线性关系及检出限的确定
在最优条件下,对质量浓度分别为5.00、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg/L 的NMN、NAD+及其类似物混合标准溶液进行分析,以NMN、NAD+及其类似物混合标准溶液的质量浓度X(mg/L)对峰面积Y 建立标准工作曲线。
1.3.6 方法日内精密度的测定
为了验证方法的准确性,对空白样品(奶粉)进行50、100、300 mg/kg 三水平的加标回收试验(n=6),考察方法日内精密度。
1.3.7 样品前处理
称取奶粉样品0.5 g(精确到0.01 mg)至10 mL 玻璃比色管,加入2.50 mL 去离子水和45 μL 乙酸,涡旋混匀后用去离子水定容至5 mL,涡旋1 min 以充分提取,于1 200 r/min 下离心2 min。C18 固相萃取柱经活化(分别用6 mL 甲醇和6 mL 水进行活化)后,取上清液至C18 固相萃取柱,收集洗脱液,过0.22 μm 滤膜后用于高效液相色谱分析。
1.3.8 仪器条件
Venusil HILIC 分析柱;流速为1 mL/min,自动进样量为10 μL,柱温25 ℃,二极管阵列检测器,检测波长为254 nm,梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution procedure
时间/min 0.00 2.00 5.00 28.00 28.10 40.00超纯水/%18 18 15 5 18 18乙腈/%57 57 50 25 57 57 0.1%三氟乙酸水溶液/%25 25 35 70 25 25
使用Origin Pro 2017 进行数据处理。
在液相色谱中,一般选用C18 分析柱、T3 分析柱、氨基分析柱和Venusil HILIC 分析柱等对目标物进行分离。尽管C18 分析柱对于极性和弱极性化合物适用性较高,在反相条件下适合大多数物质,但对于低pH 值、高水相比例的流动相耐受性较弱。T3 分析柱和氨基分析柱也是常见的液相色谱分析柱,尽管其与C18 分析柱相比具有更强的低pH 值及高水相耐受性,但在高水相条件下,其重现性和使用寿命不如Venusil HILIC 分析柱。Venusil HILIC 分析柱是一种键合中性酰胺基团的色谱柱,可保留或分离强极性、水溶性有机化合物,考虑到NMN、NAD+及其类似物具有极性大、易溶于水但难溶于有机溶剂的特性,且前处理过程中需要加乙酸以沉淀蛋白质,故本试验采用Venusil HILIC 分析柱对NMN、NAD+及其类似物进行分离,其标准溶液色谱图如图1 所示。
图1 NMN、NAD+及其类似物标准品色谱图
Fig.1 Chromatograms of NMN,NAD+,and analogue standards
提取溶剂对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响如图2 所示。
图2 提取溶剂对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响
Fig.2 Effects of different extracts on the recovery of NMN,NAD+,and analogues
由图2 可知,当提取溶剂中混入有机试剂时,NMN、NAD+及其类似物的回收率均低于采用去离子水提取的回收率,这可能是因为NMN、NAD+及其类似物亲水性强、易溶于水但不溶于有机溶剂,尽管乙腈的存在可能有利于奶粉中蛋白质、多糖等大分子物质的沉淀,但同时也降低了NMN、NAD+及其类似物在提取溶剂中的溶解度。因此,本研究最终选择去离子水作为提取溶剂。
在样品含量为0.5 g、最终定容体积为5 mL 条件下,乙酸添加量对蛋白质、多糖等杂质沉淀效果的影响结果如图3 所示。
图3 不同乙酸添加量体系的外观图
Fig.3 Appearance of the systems supplemented with different amounts of acetic acid
由图3 可知,当体系中未添加乙酸时,体系外观呈均一的乳浊液状态,而当体系中分别添加15、30、45、60、75 μL 乙酸时,体系内的蛋白质、多糖等杂质迅速沉淀,经离心后可获得澄清透明的提取液,这可能是因为酸的添加降低了体系的pH 值,使蛋白质分子间的净电荷趋于零而发生沉淀,但从体系的外观上看,当乙酸添加量为15~75 μL 时,不同乙酸添加量对蛋白质的沉淀效果无明显差异。
为进一步考察乙酸添加量对NMN、NAD+及其类似物的影响,采用阴性样品加标回收的方式,探究在添加量为10 μg/kg 条件下,乙酸添加量对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响,结果如图4 所示。
图4 乙酸添加量对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响
Fig.4 Effects of different volumes of acetic acid on the recovery of NMN,NAD+,and analogues
由图4 可知,随着乙酸添加量的增加,NMN、NAD+及其类似物的回收率总体呈先上升后下降的趋势,当乙酸添加量为45 μL 时,NMN、NAD+及其类似物的加标回收率相对较高,这可能是因为当乙酸添加量为45 μL 时最接近蛋白质的等电点,沉降效果最好,故确定乙酸添加量为45 μL。
不同固相萃取柱对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响结果如图5 所示。
图5 不同固相萃取柱对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响
Fig.5 Effects of different solid-phase extraction cartridges on the recovery of NMN,NAD+,and analogues
由图5 可知,采用氨基、HLB 和MCX 3 种固相萃取柱对样品进行净化时,NMN、NAD+及其类似物的回收率均低于C18 固相萃取柱,这可能是因为氨基固相萃取柱和MCX 固相萃取柱分别属于弱阴离子和强阳离子交换柱,在去除奶粉杂质的同时,可能对NMN、NAD+及其类似物也有一定的吸附,因此回收率较低。而HLB 固相萃取柱是一种亲水—亲脂平衡反相吸附柱,可吸附样品中的极性物质从而达到除去奶粉中极性物质的效果,但由于NMN、NAD+及其类似物也具有较强的极性,因此在净化时可能与极性杂质一同被吸附而导致回收率较低。C18 固相萃取柱的填料是一种十八烷基硅烷化键合的不规则硅胶颗粒,主要吸附体系中的疏水性化合物,如奶粉中的脂类杂质,而NMN、NAD+及其类似物属于亲水性化合物,在C18 固相萃取柱上几乎不被吸附,因此,在实现除杂的同时也能实现较高的回收率。
未经C18 固相萃取柱净化与经C18 固相萃取柱净化的色谱图见图6。
图6 奶粉经C18 固相萃取柱处理与未经C18 固相萃取柱处理的NMN、NAD+及其类似物色谱图
Fig.6 Chromatograms of NMN,NAD+,and analogues in milk powder before and after purification by C18 cartridges
由图6 可知,净化后的样品在出峰时间为4~5 min的杂质较未经C18 固相萃取柱净化的样品有明显减少,说明C18 固相萃取柱除杂效果良好。综合考虑,本试验采用C18 固相萃取柱对奶粉样品进行净化。
线性方程、相关系数、方法检出限(method detection limits,MDLs)(S/N=3)及定量限(method quantification limits,MQLs)(S/N=10)如表2 所示。
表2 NMN、NAD+及其类似物线性方程、相关系数、检出限和定量限
Table 2 Linear equations,correlation coefficients(R2),MDLs,and LOQs of NMN,NAD+,and analogues
组分NMN NAD+NGD+FMN NADH FAD线性范围/(mg/L)5~30 5~30 5~30 5~30 5~30 5~30线性方程Y=116.30X-95.00 Y=71.52X-68.29 Y=57.87X-117.30 Y=98.82X-47.40 Y=71.30X+61.11 Y=108.65X-27.12相关系数(R2)0.999 6 0.999 7 0.999 1 0.999 3 0.999 1 0.999 6方法检出限/(mg/kg)0.380 0 0.198 0 0.391 0 0.030 8 0.635 0 0.157 0方法定量限/(mg/kg)1.270 0.660 1.300 0.102 2.120 0.525
由表2 可知,相关系数为0.999 1~0.999 7,线性关系良好。方法检出限为0.030 8~0.635 0 mg/kg,定量限为0.102~2.120 mg/kg。
方法日内精密度回收率及相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)结果见表3。
表3 方法日内精密度
Table 3 Intra-day precision
化合物NMN NAD+NGD+FMN NADH FAD 50 mg/kg回收率/%98.4 90.2 81.2 80.4 80.9 88.7 RSD/%3.11 7.14 7.53 6.38 5.13 8.20 100 mg/kg回收率/%101.7 94.6 83.9 84.6 83.1 84.5 RSD/%1.51 1.22 3.99 4.69 4.44 3.21 300 mg/kg回收率/%101.2 97.1 88.9 95.3 90.8 93.9 RSD/%1.32 1.70 3.89 3.22 2.60 3.38
由表3 可知,NMN、NAD+及其类似物的平均回收率为80.4%~101.7%,日内精密度RSD 为1.22%~8.20%,由此看出,本检测方法准确性较高、精密度良好,可用于奶粉中NMN、NAD+及其类似物的快速检测。
采用本方法对市售7 种不同种类的奶粉进行检测分析,在所检测的普通纯牛奶粉、婴儿配方奶粉、较大婴儿配方奶粉、幼儿配方奶粉、儿童奶粉、孕妇奶粉和中老年配方奶粉中,均未检测出NMN、NAD+及其类似物,对其进行加标检测,加标量为100 mg/kg,其回收率见表4。
表4 不同奶粉中NMN、NAD+及其类似物的回收率
Table 4 Recovery of NMN,NAD+,and analogues in different milk powder products
化合物NMN NAD+NGD+FMN NADH FAD添加水平/(mg/kg)100 100 100 100 100 100回收率/%普通纯牛奶粉87.2 87.3 90.2 81.4 85.6 83.3婴儿配方奶粉97.8 102.0 99.3 84.1 80.9 85.0较大婴儿配方奶粉91.4 105.0 94.1 89.6 82.0 83.5幼儿配方奶粉95.4 90.5 101.0 85.4 81.1 81.4儿童奶粉84.8 97.6 97.9 81.2 81.8 87.6孕妇奶粉87.4 89.5 84.5 81.1 82.7 80.7中老年配方奶粉91.9 82.7 81.3 95.5 86.9 80.1
由表4 可知,在加标量为100 mg/kg 的条件下,普通纯牛奶粉、婴儿配方奶粉、较大婴儿配方奶粉、幼儿配方奶粉、儿童奶粉、孕妇奶粉和中老年配方奶粉中NMN、NAD+及其类似物的回收率分别为81.4%~90.2%、80.9%~102.0%、82.0%~105.0%、81.1%~101.0%、81.2%~97.9%、80.7%~89.5% 和80.1%~95.5%,说明本方法适用于检测市售奶粉中NMN、NAD+及其类似物。
本文建立了一种快速测定奶粉中NMN、NAD+及其类似物含量的高效液相色谱分析法,试样经去离子水提取后,添加45 mL 乙酸以沉淀蛋白质,经C18 固相萃取柱除去样品中的脂肪杂质后,采用Venusil HILIC 分析柱对6 种目标物进行分离,二极管阵列检测器进行检测。该检测方法检出限和定量限较低,其线性范围、精密度和回收率能满足日常检测所需。同时,对市面上不同类型的奶粉进行加标检测,结果表明,所选奶粉中均未检出NMN、NAD+及其类似物,在加标量为100 mg/kg 的条件下,回收率为80.1%~105.0%,说明本检测方法准确性高,适合大规模测定奶粉中NMN、NAD+及其类似物的含量,可为营养强化奶粉产品的研发和监管提供参考。
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Determination of β-Nicotinamide Mononucleotide and Its Analogues in Milk Powder
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