奶粉中β-烟酰胺单核苷酸及其类似物的检测

何敏恒,罗玮倩*,陈禹莹,吴滋灵,何婉莜

(广州检验检测认证集团有限公司,广东 广州 511400)

摘 要:该文建立一种高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法同时测定奶粉中β-烟酰胺单核糖核苷酸及其类似物的方法。样品经去离子水提取后,添加45 mL 乙酸以沉淀蛋白质,经C18 固相萃取柱净化后采用Venusil HILIC 分析柱分离,β-烟酰胺单核糖核苷酸及其类似物经超纯水、乙腈和0.1%三氟乙酸水溶液梯度洗脱后,采用二极管阵列检测器进行检测。结果表明,该方法检测奶粉中的β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸、烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸在线性范围内的相关系数(R2)为0.999 1~0.999 7,方法检出限为0.030 8~0.635 0 mg/kg,定量限为0.102~2.120 mg/kg,回收率为80.4%~101.7%,日内精密度相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)(n=6)为1.22%~8.20%。该方法操作简便、准确度高、回收率高和重现性好,适合用于奶粉中烟酰胺单核糖核苷酸及其类似物的检测。

关键词:高效液相色谱法;二极管阵列检测器;β-烟酰胺单核糖核苷酸;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;奶粉

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是一种由烟酰胺基、核糖和磷酸基组成的天然生物活性核苷酸,具有αβ 两种异构体形式,其中β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的前体,在体内可将烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)转变为NAD+,与细胞和生物体的衰老过程息息相关[1]。研究表明,人体的衰老与其体内NAD+水平密切相关,随着年龄的增加,人体内NAD+水平将逐渐降低,这种NAD+合成与消耗平衡的打破最终将导致衰老[2-3]及相关疾病(如阿尔茨海默病[4])的产生。有研究指出,当通过某种方式(如膳食补充[5]、运动[6]等)提高体内NAD+含量,机体衰老过程将有所减缓,这是因为NAD+可通过修复DNA 损伤、改善线粒体功能、诱导细胞自噬等方式延缓机体衰老[7],因此,NAD+被认为是抗衰老的潜在靶标,其类似物烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(niacinamide guanine dinucleotide,NGD)、烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(nicotinamide hypoxanthine dinucleotide,NADH)、黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)具有与NAD+相似的性质,在抗衰老、预防老年疾病问题上具有相似的作用。

实际上,NMN 广泛存在于各种天然食品中,如西蓝花、牛油果和生牛肉等[8-9],但其含量相对较低,日常进食不足以达到延缓衰老的目的。2020 年3 月,日本厚生劳动省批准了NMN 在食品生产中的使用,从而掀起了“不老药”风潮。目前,市面上有含有NMN 活性物质的食品大多以功能食品的形式出售,尽管目前有大量研究表明膳食补充NMN 有助于提高体内NAD+水平,进而延缓衰老、改善神经性疾病[10],但关于NMN 摄入的最佳剂量范围及长期服用的安全性尚未有充分的临床研究[11]。NMN 在我国并未获得药品、功能食品、食品添加剂和新食品原料许可,即NMN 不能作为食品进行生产和经营,但对于NAD+类似物在食品中的添加,目前仍未见报道。因此,对于食品,尤其是宣称具有抗衰老、预防老年疾病功能食品中NMN 及NAD+类似物含量的监测显得尤为重要。

目前,国内外有关的研究主要集中在NMN 和NAD+的合成制备[12-13]、功 效成分分析[14-15]以及医学[16-18]、食品和化妆品[19]领域方面的研究,对其检验检测分析方法的研究较少,且大多集中在果蔬[8,20-21]、茶叶[22]等天然食品中,再加上NMN 难挥发、极性大、易溶于水但难溶于有机溶剂的特性,限制了许多常规定量方法的应用,我国至今仍未出台NMN、NAD+及其类似物的相关检测标准。目前NMN 的检测方法主要有毛细管电泳法[23]、定量核磁共振法[24]、荧光酶联免疫法[25]、高效液相色谱法[26-27]和液质联用法[28-29]等,其中高效液相色谱法和液质联用法由于操作简单、普适性强,适合用于食品中NMN、NAD+及其类似物含量的检测。奶粉作为人们营养补充的重要来源,是潜在的NMN 强化食品。基于此,本研究采用高效液相色谱法,对奶粉中NMN、NAD+及其类似物进行检测,通过优化前处理和色谱条件,建立一种可同时测定食品中NMN、NAD+及其类似物的高效液相色谱法,以期为营养强化奶粉产品的研发和监管提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶粉:市售;β-烟酰胺单核苷酸(纯度≥99.7%):上海安谱实验科技股份有限公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸标准溶液(纯度≥99.0%)、烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸标准溶液(纯度≥99.0%)、烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸标准溶液(纯度≥95.0%)、黄素单核苷酸标准溶液(纯度≥95.0%)、黄素腺嘌呤二核苷酸标准溶液(纯度≥97.0%):美国Sigma-Aldrich 公司;乙醇(纯度≥99.7%)、乙酸(纯度≥99.5%)、三氟乙酸(纯度≥99.0%)(均为分析纯):广州化学试剂厂;甲醇、乙腈、丙酮(均为色谱纯):德国Merck 公司。

1.2 仪器与设备

2695/2998 液相色谱/二极管阵列检测器系统(highperformanceliquidchromatography-photo-diodearra,HPLC-PDA)、T3 分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm):美国Waters 公司;Venusil HILIC 分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm):美国艾杰尔-飞诺美公司;氨基分析柱(Athena,4.6 mm×250 mm,3 μm):上海安谱实验科技股份有限公司;C18 分析柱(Syncronis,4.6 mm×250 mm,5 μm):美国赛默飞世尔科技公司;MS3 basic 涡旋混合器:德国IKA 公司;Milli-Q 去离子水发生器:美国Millipore 公司;C18 固相萃取柱(BOND HC-C18 SPE 小柱,500 mg,6 mL)、氨基固相萃取柱(BOND NH2 SPE 小柱,500 mg,6 mL)、HLB 固相萃取柱(Poly-Sery HLB Pro SPE 小柱,500 mg,6 mL)、MCX 固相萃取柱(Poly-Sery MCX SPE 小柱,150 mg,6 mL):德国CNW 公司;正压48 孔处理装置:美国安捷伦公司;KDC-400 低速离心机:科大创新股份有限公司;有机相针式滤器(13 mm×0.22 μm):上海安谱科学仪器有限公司;XS205DU 电子天平(0.01 mg):瑞士梅特勒托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱柱的选择

为考察色谱柱对NMN、NAD+及其类似物分离度影响,首先用初始流动相配制出浓度为50 mg/L 的NMN、NAD+及其类似物标液,然后分别选用C18 分析柱、T3 分析柱、氨基分析柱和Venusil HILIC 分析柱对其NMN、NAD+及其类似物进行分离,最终确定一条分离度最佳的色谱柱供后期试验使用。

1.3.2 提取溶剂的选择

为考察提取溶剂的种类及比例对NMN、NAD+及其类似物的影响,采用阴性样品加标回收的方式,探究添加量为10 μg/kg 条件下,去离子水、10%乙腈溶液、50%乙腈溶液、10%乙醇溶液、50%乙醇溶液、10%甲醇溶液和50% 甲醇溶液对奶粉中NMN、NAD+及其类似物提取效果的影响。

1.3.3 乙酸添加量的确定

为考察乙酸添加量对NMN、NAD+及其类似物的影响,本试验采用阴性样品加标回收的方式,探究添加量为10 μg/kg 条件下,在提取液中加入15、30、45、60、75 μL 乙酸对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响。

1.3.4 净化方式的选择

奶粉是复杂的食品体系,除蛋白质、多糖等高分子物质外,还含有大量易溶于水、可能对试验结果产生干扰的杂质,为进一步提高奶粉中NMN、NAD+及其类似物的测定准确性,需对样品进行进一步净化。考察C18、氨基、HLB 和MCX 4 种固相萃取柱对NMN、NAD+及其类似物加标回收率的影响。

1.3.5 线性关系及检出限的确定

在最优条件下,对质量浓度分别为5.00、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg/L 的NMN、NAD+及其类似物混合标准溶液进行分析,以NMN、NAD+及其类似物混合标准溶液的质量浓度X(mg/L)对峰面积Y 建立标准工作曲线。

1.3.6 方法日内精密度的测定

为了验证方法的准确性,对空白样品(奶粉)进行50、100、300 mg/kg 三水平的加标回收试验(n=6),考察方法日内精密度。

1.3.7 样品前处理

称取奶粉样品0.5 g(精确到0.01 mg)至10 mL 玻璃比色管,加入2.50 mL 去离子水和45 μL 乙酸,涡旋混匀后用去离子水定容至5 mL,涡旋1 min 以充分提取,于1 200 r/min 下离心2 min。C18 固相萃取柱经活化(分别用6 mL 甲醇和6 mL 水进行活化)后,取上清液至C18 固相萃取柱,收集洗脱液,过0.22 μm 滤膜后用于高效液相色谱分析。

1.3.8 仪器条件

Venusil HILIC 分析柱;流速为1 mL/min,自动进样量为10 μL,柱温25 ℃,二极管阵列检测器,检测波长为254 nm,梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution procedure

时间/min 0.00 2.00 5.00 28.00 28.10 40.00超纯水/%18 18 15 5 18 18乙腈/%57 57 50 25 57 57 0.1%三氟乙酸水溶液/%25 25 35 70 25 25

1.4 数据处理

使用Origin Pro 2017 进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

在液相色谱中,一般选用C18 分析柱、T3 分析柱、氨基分析柱和Venusil HILIC 分析柱等对目标物进行分离。尽管C18 分析柱对于极性和弱极性化合物适用性较高,在反相条件下适合大多数物质,但对于低pH 值、高水相比例的流动相耐受性较弱。T3 分析柱和氨基分析柱也是常见的液相色谱分析柱,尽管其与C18 分析柱相比具有更强的低pH 值及高水相耐受性,但在高水相条件下,其重现性和使用寿命不如Venusil HILIC 分析柱。Venusil HILIC 分析柱是一种键合中性酰胺基团的色谱柱,可保留或分离强极性、水溶性有机化合物,考虑到NMN、NAD+及其类似物具有极性大、易溶于水但难溶于有机溶剂的特性,且前处理过程中需要加乙酸以沉淀蛋白质,故本试验采用Venusil HILIC 分析柱对NMN、NAD+及其类似物进行分离,其标准溶液色谱图如图1 所示。

图1 NMN、NAD+及其类似物标准品色谱图
Fig.1 Chromatograms of NMN,NAD+,and analogue standards

2.2 提取溶剂的选择

提取溶剂对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响如图2 所示。

图2 提取溶剂对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响
Fig.2 Effects of different extracts on the recovery of NMN,NAD+,and analogues

由图2 可知,当提取溶剂中混入有机试剂时,NMN、NAD+及其类似物的回收率均低于采用去离子水提取的回收率,这可能是因为NMN、NAD+及其类似物亲水性强、易溶于水但不溶于有机溶剂,尽管乙腈的存在可能有利于奶粉中蛋白质、多糖等大分子物质的沉淀,但同时也降低了NMN、NAD+及其类似物在提取溶剂中的溶解度。因此,本研究最终选择去离子水作为提取溶剂。

2.3 乙酸添加量的确定

在样品含量为0.5 g、最终定容体积为5 mL 条件下,乙酸添加量对蛋白质、多糖等杂质沉淀效果的影响结果如图3 所示。

图3 不同乙酸添加量体系的外观图
Fig.3 Appearance of the systems supplemented with different amounts of acetic acid

由图3 可知,当体系中未添加乙酸时,体系外观呈均一的乳浊液状态,而当体系中分别添加15、30、45、60、75 μL 乙酸时,体系内的蛋白质、多糖等杂质迅速沉淀,经离心后可获得澄清透明的提取液,这可能是因为酸的添加降低了体系的pH 值,使蛋白质分子间的净电荷趋于零而发生沉淀,但从体系的外观上看,当乙酸添加量为15~75 μL 时,不同乙酸添加量对蛋白质的沉淀效果无明显差异。

为进一步考察乙酸添加量对NMN、NAD+及其类似物的影响,采用阴性样品加标回收的方式,探究在添加量为10 μg/kg 条件下,乙酸添加量对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响,结果如图4 所示。

图4 乙酸添加量对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响
Fig.4 Effects of different volumes of acetic acid on the recovery of NMN,NAD+,and analogues

由图4 可知,随着乙酸添加量的增加,NMN、NAD+及其类似物的回收率总体呈先上升后下降的趋势,当乙酸添加量为45 μL 时,NMN、NAD+及其类似物的加标回收率相对较高,这可能是因为当乙酸添加量为45 μL 时最接近蛋白质的等电点,沉降效果最好,故确定乙酸添加量为45 μL。

2.4 净化方式的选择

不同固相萃取柱对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响结果如图5 所示。

图5 不同固相萃取柱对NMN、NAD+及其类似物回收率的影响
Fig.5 Effects of different solid-phase extraction cartridges on the recovery of NMN,NAD+,and analogues

由图5 可知,采用氨基、HLB 和MCX 3 种固相萃取柱对样品进行净化时,NMN、NAD+及其类似物的回收率均低于C18 固相萃取柱,这可能是因为氨基固相萃取柱和MCX 固相萃取柱分别属于弱阴离子和强阳离子交换柱,在去除奶粉杂质的同时,可能对NMN、NAD+及其类似物也有一定的吸附,因此回收率较低。而HLB 固相萃取柱是一种亲水—亲脂平衡反相吸附柱,可吸附样品中的极性物质从而达到除去奶粉中极性物质的效果,但由于NMN、NAD+及其类似物也具有较强的极性,因此在净化时可能与极性杂质一同被吸附而导致回收率较低。C18 固相萃取柱的填料是一种十八烷基硅烷化键合的不规则硅胶颗粒,主要吸附体系中的疏水性化合物,如奶粉中的脂类杂质,而NMN、NAD+及其类似物属于亲水性化合物,在C18 固相萃取柱上几乎不被吸附,因此,在实现除杂的同时也能实现较高的回收率。

未经C18 固相萃取柱净化与经C18 固相萃取柱净化的色谱图见图6。

图6 奶粉经C18 固相萃取柱处理与未经C18 固相萃取柱处理的NMN、NAD+及其类似物色谱图
Fig.6 Chromatograms of NMN,NAD+,and analogues in milk powder before and after purification by C18 cartridges

由图6 可知,净化后的样品在出峰时间为4~5 min的杂质较未经C18 固相萃取柱净化的样品有明显减少,说明C18 固相萃取柱除杂效果良好。综合考虑,本试验采用C18 固相萃取柱对奶粉样品进行净化。

2.5 线性关系及检出限

线性方程、相关系数、方法检出限(method detection limits,MDLs)(S/N=3)及定量限(method quantification limits,MQLs)(S/N=10)如表2 所示。

表2 NMN、NAD+及其类似物线性方程、相关系数、检出限和定量限
Table 2 Linear equations,correlation coefficients(R2),MDLs,and LOQs of NMN,NAD+,and analogues

组分NMN NAD+NGD+FMN NADH FAD线性范围/(mg/L)5~30 5~30 5~30 5~30 5~30 5~30线性方程Y=116.30X-95.00 Y=71.52X-68.29 Y=57.87X-117.30 Y=98.82X-47.40 Y=71.30X+61.11 Y=108.65X-27.12相关系数(R2)0.999 6 0.999 7 0.999 1 0.999 3 0.999 1 0.999 6方法检出限/(mg/kg)0.380 0 0.198 0 0.391 0 0.030 8 0.635 0 0.157 0方法定量限/(mg/kg)1.270 0.660 1.300 0.102 2.120 0.525

由表2 可知,相关系数为0.999 1~0.999 7,线性关系良好。方法检出限为0.030 8~0.635 0 mg/kg,定量限为0.102~2.120 mg/kg。

2.6 方法日内精密度

方法日内精密度回收率及相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)结果见表3。

表3 方法日内精密度
Table 3 Intra-day precision

化合物NMN NAD+NGD+FMN NADH FAD 50 mg/kg回收率/%98.4 90.2 81.2 80.4 80.9 88.7 RSD/%3.11 7.14 7.53 6.38 5.13 8.20 100 mg/kg回收率/%101.7 94.6 83.9 84.6 83.1 84.5 RSD/%1.51 1.22 3.99 4.69 4.44 3.21 300 mg/kg回收率/%101.2 97.1 88.9 95.3 90.8 93.9 RSD/%1.32 1.70 3.89 3.22 2.60 3.38

由表3 可知,NMN、NAD+及其类似物的平均回收率为80.4%~101.7%,日内精密度RSD 为1.22%~8.20%,由此看出,本检测方法准确性较高、精密度良好,可用于奶粉中NMN、NAD+及其类似物的快速检测。

2.7 实际样品的测定结果分析

采用本方法对市售7 种不同种类的奶粉进行检测分析,在所检测的普通纯牛奶粉、婴儿配方奶粉、较大婴儿配方奶粉、幼儿配方奶粉、儿童奶粉、孕妇奶粉和中老年配方奶粉中,均未检测出NMN、NAD+及其类似物,对其进行加标检测,加标量为100 mg/kg,其回收率见表4。

表4 不同奶粉中NMN、NAD+及其类似物的回收率
Table 4 Recovery of NMN,NAD+,and analogues in different milk powder products

化合物NMN NAD+NGD+FMN NADH FAD添加水平/(mg/kg)100 100 100 100 100 100回收率/%普通纯牛奶粉87.2 87.3 90.2 81.4 85.6 83.3婴儿配方奶粉97.8 102.0 99.3 84.1 80.9 85.0较大婴儿配方奶粉91.4 105.0 94.1 89.6 82.0 83.5幼儿配方奶粉95.4 90.5 101.0 85.4 81.1 81.4儿童奶粉84.8 97.6 97.9 81.2 81.8 87.6孕妇奶粉87.4 89.5 84.5 81.1 82.7 80.7中老年配方奶粉91.9 82.7 81.3 95.5 86.9 80.1

由表4 可知,在加标量为100 mg/kg 的条件下,普通纯牛奶粉、婴儿配方奶粉、较大婴儿配方奶粉、幼儿配方奶粉、儿童奶粉、孕妇奶粉和中老年配方奶粉中NMN、NAD+及其类似物的回收率分别为81.4%~90.2%、80.9%~102.0%、82.0%~105.0%、81.1%~101.0%、81.2%~97.9%、80.7%~89.5% 和80.1%~95.5%,说明本方法适用于检测市售奶粉中NMN、NAD+及其类似物。

3 结论

本文建立了一种快速测定奶粉中NMN、NAD+及其类似物含量的高效液相色谱分析法,试样经去离子水提取后,添加45 mL 乙酸以沉淀蛋白质,经C18 固相萃取柱除去样品中的脂肪杂质后,采用Venusil HILIC 分析柱对6 种目标物进行分离,二极管阵列检测器进行检测。该检测方法检出限和定量限较低,其线性范围、精密度和回收率能满足日常检测所需。同时,对市面上不同类型的奶粉进行加标检测,结果表明,所选奶粉中均未检出NMN、NAD+及其类似物,在加标量为100 mg/kg 的条件下,回收率为80.1%~105.0%,说明本检测方法准确性高,适合大规模测定奶粉中NMN、NAD+及其类似物的含量,可为营养强化奶粉产品的研发和监管提供参考。

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Determination of β-Nicotinamide Mononucleotide and Its Analogues in Milk Powder

HE Minheng,LUO Weiqian*,CHEN Yuying,WU Ziling,HE Wanyou
(Guangzhou Inspection Testing and Certification Group Co.,Ltd.,Guangzhou 511400,Guangdong,China)

Abstract:A method for determining β-nicotinamide mononucleotide and its analogues in milk powder was established based on high performance liquid chromatography(HPLC). The sample was dissolved in deionized water,and 45 mL acetic acid was added for protein precipitation. The extract was then passed through a C18 solid-phase extraction cartridge. Gradient elution was carried out in the Venusil HILIC column with ultrapure water,acetonitrile,and 0.1% trifluoroacetic acid and the compounds were detected by a photo-diode array detector. The results showed that the correlation coefficients(R2)of β-nicotinamide mononucleotide and its analogues ranged from 0.999 1 to 0.999 7 within the linear range. The method detection limits(MDLs)and method quantification limits(MQLs)were 0.030 8-0.635 0 mg/kg and 0.102-2.120 mg/kg,respectively. The recovery of the compounds varied within the range of 80.4%-101.7%,and the intra-day precision(RSD)(n=6)of the established method was within the range of 1.22%-8.20%.This method is not only simple and cost-effective but also enjoys excellent precision,recovery,and reproducibility.Therefore,it is suitable for determining β-nicotinamide mononucleotide and its analogues in milk powder.

Key words:high performance liquid chromatography(HPLC);photo-diode array detector;β-nicotinamide mononucleotide;nicotinamide adenine dinucleotide;milk powder

DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2024.23.022

基金项目:广东省市场监督管理局科技项目(2022CS03)

作者简介:何敏恒(1984—),男(汉),高级工程师,硕士研究生,研究方向:食品安全检测技术。

*通信作者:罗玮倩(1995—),女(汉),工程师,硕士研究生,研究方向:食品质量安全。

引文格式:

何敏恒,罗玮倩,陈禹莹,等.奶粉中β-烟酰胺单核苷酸及其类似物的检测[J].食品研究与开发,2024,45(23):166-172.

HE Minheng,LUO Weiqian,CHEN Yuying,et al. Determination of β-Nicotinamide Mononucleotide and Its Analogues in Milk Powder[J].Food Research and Development,2024,45(23):166-172.

加工编辑:张昱

收稿日期:2023-08-30