八角茴香及其易混品的DNA 条形码鉴别

八角茴香，又称八角、大料、大茴香和五香八角等[1]。八角茴香之名始见于南宋杨士瀛的《仁斋直指方论》[2]，八角之名出自清赵其光的《本草求原》[3]，大茴香出自南宋朱佐的《类编朱氏集验方》[4]。大料是北方民间对八角茴香的习称，五香八角是南方民间对八角茴香的习称。《中华人民共和国药典》2020 版规定，药材八角茴香Illicium verum 来源于木兰科植物八角茴香（Illicium verum Hook.f.）的干燥成熟果实，具有温阳散寒、理气止痛的作用，用于寒疝腹痛、肾虚腰痛、胃寒呕吐、脘腹冷痛[5]。八角茴香除了作为日常调料和药材，还作为经济树种，其果皮、种子、叶都含芳香油，称八角茴香油，是制造化妆品、啤酒和食品工业的重要原料。八角茴香木材可供细木工、家具、箱板等用材[6-7]。八角茴香还可作为牙膏等物品中的香料，还可用于制药行业，是抗癌药“派路克萨龙”、抗禽流感药“达菲”、雌性激素“己烯雌酚”的主要合成原料[7-8]。八角茴香除国内需用外，也是重要的出口物资，我国八角茴香占世界市场的85%以上，是唯一一个能大规模生产和提供八角茴香的国家[8]。因此，八角茴香的发展前景广阔，开发潜力较大。

八角茴香的常见易混品有红茴香（Illicium henryi Diels.）、红毒茴（Illicium lanceolatum A.C.Smith）、野八角（Illicium simonsii Maxim.）、大八角（Illicium majus Hook.f.et Thoms.）、厚皮香八角（Illicium ternstroemioides A.C.Smith）、红花八角（Illicium dunnianum Tutch.）、台湾八角（Illicium arborescens Hayata）和茴香（F.vulgare Mill.）[5]，且常见易混品大多有毒，特别是红茴香有剧毒。我国古代本草所称的“莽草”是八角茴香最常见的易混品，实则为红茴香或红毒茴[6]。

分子水平鉴定物种已广泛应用，matK、ITS2、psbAtrnH 等分子标记在植物上的应用范围不断扩大[9-12]。与ITS2 核苷酸序列相比，其二级结构有助于提高系统发育的识别能力[13-14]。补偿性碱基替换（compensatory base changes，CBC）分析是利用二级结构中配对碱基的变化来分析遗传距离很近物种的差异，在昆虫及植物上都能很好地区分种属关系[15-16]，有时也会出现半补偿性碱基替换（hemi-compensatory base change，hCBC），即配对的双方仅一方发生突变，从而使得该位点处于一种配对中间体的状态[17]。这使ITS2 二级结构在物种鉴别上的应用越来越受到人们的关注。

本研究利用ITS2、psbA-trnH 和matK 序列从遗传距离、二级结构、NJ（neighbor joining）树和PNJ（profile neighbor joining）树等不同层次对八角茴香及其易混品进行鉴别，以期为八角茴香的安全提供有效保障。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究材料包含八角茴香、红茴香、红毒茴、野八角、大八角、厚皮香八角、红花八角、台湾八角和茴香共9 个物种89 条序列（ITS2：32 条，psbA-trnH：27 条，matK：30 条）。八角茴香药材的基原植物八角茴香：来源于广西玉林，详细信息见表1。所有研究材料经西安医学院药学院生药教研室汪兴军老师鉴定，并保存于-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 植物样本准备与DNA 提取

将试验用具进行高压灭菌，用75%乙醇擦拭新鲜植物材料的叶片表面。取约150 mg 材料于1.5 mL 灭菌离心管中，迅速放入液氮中冷冻。在液氮环境下，用灭菌小木棒研磨植物材料至粉末状。按照DP320 植物基因组DNA 提取试剂盒说明书操作提取八角茴香植物的总DNA。

1.2.2 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、测序和校正

对八角茴香植物的ITS2、psbA-trnH 和matK 序列进行PCR 扩增，序列扩增的PCR 条件见表2。PCR 产物由北京擎科泽西生物科技有限公司完成Sanger 测序，每个样本重复3 次测序。通过Contig Express 软件去除每条序列的两端引物区，检查测序峰图并进行人工校正，最终得到全部序列。

1.2.3 序列获得、筛选和比对

从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）Nucleotide 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）中下载8 种分类群的ITS2、psbA-trnH 和matK 序列，利用BLAST功能筛选剔除可疑序列，共获得80 条序列。检查测序结果的峰图，去除两端低质量部分，并对剩余部分进行质量评估。将下载所得序列连同测序序列在ITS2 Database（http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）中基于隐马尔可夫模型（Hidden Markov model，HMM）对数据进行分析，去除序列两端的5.8S 和28S 基因区，获得标准的ITS2 基因间隔区序列。另外，将下载所得序列连同测序序列根据GenBank 数据库中同属物种psbA-trnH 的注释，去除序列两端的psbA 和trnH基因，获得标准的psbA-trnH 基因间隔区。同时，将下载所得序列连同测序序列根据GenBank 数据库中同科物种matK 的注释，获得标准的matK 片段。利用Clustal Omega（http：//www.clustal.org/omega/）在线软件对所有ITS2、psbA-trnH 和matK 序列进行比对校正。

1.2.4 序列分析、遗传距离计算及NJ 进化树构建

采用MEGA 11 软件分析比对所得序列，统计碱基G、C 含量、序列长度、变异位点等序列特征信息。基于K2P（Kimura 2-Parameter）模型计算各物种的种内、种间遗传距离，构建NJ 系统发育树，Bootstrap 1 000 次重复检验分支系统发育的可靠性。

1.2.5 ITS2 二级结构预测及PNJ 系统发育树构建

利用ITS2 Database 预测各物种的ITS2 二级结构，获得一级结构和二级结构的联合矩阵，将所有研究材料的联合矩阵输入4Sale 1.7.1 软件中进行比对，将比对好的结果导入ProfDist 0.9.9 软件基于距离法构建PNJ 系统发育树，Bootstrap 1 000 次重复检验分支系统发育的可靠性。

2 结果与分析

2.1 序列特征及差异分析

将测序获得的ITS2、psbA-trnH 和matK 序列在NCBI 数据库中进行BLAST，相似性最高的序列对应的物种为八角茴香Illicium verum Hook. f.。八角茴香及其易混品的ITS2、psbA-trnH 和matK 序列差异分析见表3。

由表3 可知，不同物种的ITS2 序列长度在210～228 bp 之间，其中厚皮香八角和八角茴香分别为最短和最长；红茴香、红毒茴、大八角、台湾八角的序列长度同为225 bp。多重比对后序列长度为241 bp。除厚皮香八角外，八角茴香与其易混品的序列长度非常相近。序列的碱基G、C 含量范围为54.63%～60.95%，保守位点多集中在135 bp 处，变异位点和简约信息位点多集中在90 bp 处，自裔位点个数为0。变异位点和简约信息位点均为93 个。各物种的psbA-trnH 序列的平均长度为367 bp，比对后长度为407 bp。平均碱基G、C含量为31.44%。所有物种的matK 序列平均长度为777 bp，八角茴香的matK 序列长度最短731 bp，序列碱基G、C 含量多集中在36%左右。

2.2 遗传距离分析

八角茴香与其易混品的遗传距离见图1。

由图1 可知，各分类群的种内遗传距离都为0。八角茴香与野八角的种间遗传距离为0.01，小于八角茴香与其他易混品种；野八角分别与厚皮香八角和红花八角、台湾八角分别与厚皮香八角和红花八角的ITS2 种间遗传距离均为0.005；同属物种的ITS2 种间遗传距离比较相近。其次，八角茴香与其易混品种的psbA-trnH 种间遗传距离普遍大于ITS2 的种间遗传距离，其中八角茴香与茴香的种间psbA-trnH 遗传距离最小为1.048。另外，八角茴香与其易混品种的matK种间遗传距离也普遍较大，种间最小仍为与茴香的遗传距离1.147，八角茴香与其同属易混品的matK 种间遗传距离集中在1.163，但其他同属物种的种间距离集中在0.001。因此，3 种DNA 条形码均可将八角茴香与其易混品从遗传距离水平上区分开。

2.3 聚类分析

基于ITS2 序列（一级结构）和ITS2 一级结构与二级结构联合矩阵，分别构建NJ 和PNJ 系统发育树结果见图2。

由图2 可知，在NJ 进化树中，八角茴香单独聚为一支；同科属易混品共聚为一大支，厚皮香八角与红花八角聚为一支，这与种间遗传距离相近相一致；大八角、野八角、台湾八角各聚为一小支。在PNJ 进化树中，八角茴香、大八角各聚为一小支后与野八角共聚为一支；红茴香、红毒茴各聚为一小支后共聚为一大支；红花八角、台湾八角单独聚为一支；厚皮香八角聚为一支。由此可得，ITS2 可以准确鉴别八角茴香与其易混品。如图2C 所示，八角茴香、野八角、红毒茴、茴香均独立成分支；厚皮香八角、台湾八角聚为一小支后共聚为一大支。如图2D 所示，八角茴香、茴香独立分支后汇聚为一大分支；红毒茴、野八角、大八角、厚皮香八角、台湾八角共聚为一大支。综上所述，ITS2、psbAtrnH 和matK 序列适用于区别八角茴香与其易混品。

2.4 ITS2 二级结构分析

所有分类群的ITS2 二级结构见图3。

由图3 可知，所有分类群的ITS2 二级结构均呈典型的“一环四臂”（1 个中心环和4 个螺旋区）形态，其中，臂Ⅲ最长，但同时各种间二级结构均有较大差异，差异主要体现在内环、凸环、自由单链上。臂Ⅰ上内环最多的是八角茴香，除茴香是只有1 个内环外，其他都有3 个内环。臂Ⅱ上内环最少的是红花八角，除茴香是有1 个内环外，其他均有2 个内环。臂Ⅲ变异较大，内环数1 到6 个不等，大八角内环最多，其他大多都有4 个内环。臂Ⅳ上内环数1 到3 个不等，大多均有2 个内环。没有凸环的有大八角和茴香。有凸环的，凸环均在臂Ⅲ上，且除红花八角的凸环在臂Ⅲ和臂Ⅳ之间外，其他均在臂Ⅱ和臂Ⅲ之间。只有八角茴香和茴香在臂Ⅰ和臂Ⅳ之间有一段富含嘧啶的单链结构，且茴香的ITS2 二级结构比八角茴香的整体大。另外，各物种二级结构间的差异还体现在茎环大小、旋臂长度、旋臂间夹角、内环大小及位置等方面。CBC 模型的统计结果显示，八角茴香与红茴香在臂Ⅳ区具有1 个hCBC，与红毒茴在臂II 区具有1 个hCBC。综上所述，ITS2 序列的二级结构的分子形态差异可以区分八角茴香与其易混品。

3 讨论与结论

本研究分析比较了ITS2、psbA-trnH 和matK 条形码对八角茴香及其易混品的遗传距离、系统发育树、二级结构等方面，结果显示这3 种DNA 条形码均能区分开八角茴香与其易混品，但在八角属同属易混品的区分上，matK 条形码并不适用。因此，本研究最终确定ITS2 和psbA-trnH 序列为最佳DNA 条形码，matK 序列为辅助条形码，适用于八角茴香及其易混品的DNA条形码鉴别研究。

由于八角茴香用途广泛，出口量大，需求量高，价格昂贵，其易混品多且便宜，存在较大的安全隐患，因此本研究利用核糖体片段ITS2 和2 个叶绿体片段psbA-trnH、matK 对八角茴香及其易混品进行鉴别，为八角茴香及其易混品的准确、客观鉴定提供了新的技术手段，可以实现对八角茴香基原物种、粉末以及细胞、组织等材料来源的准确快速鉴定，可以满足不同行业不同科研背景工作者对八角茴香鉴定的要求。本研究结果在八角茴香中药材流通领域、产企业的原料监管、医院饮片的真伪鉴定、海关进出口鉴定与管理、出入境检验检疫等方面发挥潜在应用价值。本文建议以ITS2 和psbA-trnH 为主，matK 为辅的分子标记应用于八角茴香与其易混品的鉴别。

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