褪黑素(melatonion,MT),又名N-乙酰基-5-甲氧基色胺,是主要由动物松果体产生并广泛存在于松果体外多种外周组织和体液中的一种胺类激素,属于吲哚杂环类化合物,具有良好的热稳定性。褪黑素参与多种生物调节活动[1],有促进睡眠、提高免疫、影响生殖、抗氧化等众多生物学功能[2-3],具有较高的应用价值。有研究表明,褪黑素的分泌随着人们年龄的增长而下降,可能与失眠、神经退行性疾病等疾病的出现有关[4-5]。作为我国批准的保健品之一,褪黑素不仅可以改善睡眠质量,还有延缓衰老、调节免疫等重要作用,更重要的是,褪黑素的生物半衰期短,不易在体内蓄积[6],毒性极低,是较为安全的内源性物质。
褪黑素的分泌受光周期控制,但胃肠部位的褪黑素却不受此影响,而是受食物摄入的节律控制[7]。有研究表明,摄入富含褪黑素的食物可能会通过增加循环褪黑素而对健康产生有益影响[8-10]。大多数食物中均含有褪黑素[11],在动物性食物中,鸡蛋、鸡肉都存在微量褪黑素,鸡蛋和鱼肉中的褪黑素浓度高于肉类[12],而鸡蛋的性价比较高,被世界各地的人们广泛食用,若能通过常规饮食满足人体对褪黑素的需求,则可为睡眠障碍人群补充褪黑素提供便利。
目前国内外检测褪黑素的方法有高效液相色谱-荧光检测法[13-15]、高效液相色谱-紫外检测法[15-17]、高效液相色谱-质谱联用法[18-19]、放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)[20]、酶联免疫法等[21-23]。有关检测蛋中褪黑素含量的方法则大多采用酶联免疫法,该方法对前处理的要求相对较低、检测速度快,但精确度较差。高效液相色谱法具有灵敏度高,准确度高,可较快检测大批量样本的优点。本研究采用高效液相色谱法对市售鸡蛋中的褪黑素含量进行检测,为鸡蛋中褪黑素含量的检测提供理论支撑,同时为人们选购不同品种的鸡蛋提供参考。
乌鸡蛋、柴鸡蛋、普通鸡蛋各30 枚:市售;三氟乙酸(色谱纯):上海麦克林生化科技股份有限公司;褪黑素标准品(纯度≥99.0%):北京索莱宝科技有限公司;甲醇(色谱纯):德国默克公司;正己烷(分析纯):天津市汇杭化工科技有限公司;纯净水:娃哈哈集团有限公司;乙酸乙酯(分析纯):天津市风船化学试剂科技有限公司;亲水亲油平衡(hydrophile-lipophile balance,HLB)固相萃取柱(200 mg/6 mL):深圳逗点生物技术有限公司。
高效液相色谱仪配紫外-可见光检测器(1260):美国安捷伦科技有限公司;分析天平(FB223):上海舜宁恒平科学仪器有限公司;真空冷冻干燥机(Coolsafe 100-9pro):丹麦Labogene 公司;UVF 超声波清洗机(XM-600UVF):小美超声仪器(昆山)有限公司;多用途涡旋混合仪(VORTEX-6):海门市其林贝尔仪器制造有限公司;旋转蒸发仪(IKA HB10):上海巴玖有限公司;固相萃取仪(JL-SPE-24D):上海靳澜仪器制造有限公司;低速离心机(H1850R):长沙湘仪离心机仪器有限公司;氮吹仪(NEVP-111):美国Organ-omation 公司。
1.3.1 标准溶液的配制
标准储备液:精确称取10 mg 褪黑素标准品,用甲醇溶解定容至10 mL 棕色容量瓶中,配制成浓度为1 mg/mL 的标准储备液,4 ℃避光封闭保存。
标准工作液:准确吸取0.5 mL 标准储备液于50 mL 棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成浓度为10 μg/mL 的标准工作液。分别准确吸取6、3、1 mL的10 μg/mL 标准储备液于10 mL 棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,分别配制成浓度为6、3、1 μg/mL 的标准工作液。将1 μg/mL 的标准工作液进行梯度稀释,分别配制成浓度为0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 μg/mL 的标准工作液,以上溶液均现用现配。
1.3.2 样品前处理方法
取30 颗鸡蛋样品,分离蛋清蛋黄,分别称重混匀,倒入一次性培养皿中,用保鲜膜密封,-20 ℃预冻24 h,冻干30 h,将冻干后的蛋清蛋黄分别称重,磨成细粉混匀备用。
1.3.2.1 蛋黄样品前处理
称取50 g 蛋黄粉平均置于5 个100 mL 离心管中,每管加入25 mL 乙酸乙酯,室温超声20 min,涡旋30 s,5 000 r/min 离心20 min,取上层清液。重复提取1 次,合并两次提取液,移入蒸馏烧瓶,40 ℃下旋蒸至瓶中液面不再下降。取50 mL 5%甲醇水润洗蒸馏烧瓶,将溶液平均移入5 个50 mL 离心管,每管加5 mL正己烷,涡旋20 s,5 000 r/min 离心20 min,弃上层正己烷,收集下层溶液,合并备用。
依次用甲醇10 mL、纯水10 mL 活化HLB 固相萃取小柱,取备用液过柱,控制流速不要过快,用5 mL 纯水淋洗,5 mL 甲醇洗脱,收集洗脱液备用。
将洗脱液置于40 ℃水浴条件下氮气吹干,1 mL甲醇溶解残余物,经0.22 μm 滤膜过滤,供高效液相色谱仪测定。
1.3.2.2 蛋清样品前处理
称取50 g 蛋清粉平均置于5 个100 mL 离心管中,每管加入25 mL 乙酸乙酯,室温超声20 min,涡旋30 s,5 000 r/min 离心20 min,取上层清液。重复提取1 次,合并两次提取液,移入蒸馏烧瓶,40 ℃下旋转蒸发至干。取10 mL 5%甲醇润洗蒸馏烧瓶,所得溶液备用。
依次用甲醇10 mL、纯水10 mL 活化HLB 固相萃取小柱,取备用液过柱,控制流速不要过快,用5 mL 纯水淋洗,5 mL 甲醇洗脱,收集洗脱液备用。
将洗脱液置于40 ℃水浴条件下氮气吹干,1 mL甲醇溶解残余物,经0.22 μm 滤膜过滤,供高效液相色谱测定。
1.3.3 色谱条件的优化
色谱柱:Agilent AQ-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:0.05% 三氟乙酸水溶液∶甲醇=40∶60(体积比),流速0.6 mL/min,检测波长222 nm,柱温30 ℃,进样量10 μL。
1.3.3.1 流动相的优化
取同一浓度的褪黑素标准溶液为样品,选择甲醇为有机相,其他色谱条件相同,比较酸的种类(0.1%甲酸、0.1%冰乙酸、0.1%三氟乙酸、纯水)、不同三氟乙酸浓度(0.05%、0.1%、0.5%)、不同流动相体积比(25∶75、30∶70、35∶65、40∶60)、不同流速(0.7、0.6、0.55、0.5 mL/min),对目标峰峰型及保留时间的影响。
1.3.3.2 不同柱温对褪黑素出峰的影响
取同一浓度的褪黑素标准溶液为样品,调节柱温分别为20、25、30、35 ℃时进样,比较不同柱温对褪黑素色谱峰峰面积及保留时间的影响。
1.3.3.3 不同检测波长对褪黑素出峰的影响
取同一浓度的褪黑素标准溶液为样品,储存其在200~400 nm 下的光谱信息,再调节检测波长为222、245、265、278 nm 进样,比较不同检测波长对褪黑素色谱峰峰面积的影响。
1.3.4 标准曲线的建立
按照1.3.1 中标准工作液的配制方法,共制备10、6、3、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 μg/mL 9 个浓度梯度的褪黑素标准工作液。参照1.3.3 中高效液相色谱条件进行测定分析,以标准溶液浓度为横坐标,标准品峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
1.3.5 方法学验证
按照1.3.1 配制标准溶液,按照1.3.2 处理鸡蛋样品,参照1.3.3 中高效液相色谱条件进行测定分析。
精密度:配制1 μg/mL 的褪黑素标准工作液,重复进样6 次,记录峰面积,测定精密度。
特异性:取空白溶液、褪黑素标准品溶液、蛋黄溶液、蛋清溶液,分别测定并记录色谱图,考察本试验方法测定蛋清、蛋黄样品中褪黑素与其他物质的分离情况,确定特异性。
稳定性:取处理好的蛋黄溶液重复进样7 次,每次间隔2 h,记录峰面积,确定稳定性。
回收率:将处理好的蛋清蛋黄样品各4 份,添加0、0.2、0.4、0.6 μg/mL 的褪黑素标准品溶液,涡旋30 s使其充分混合后经高效液相色谱检测分析,各样本重复测定3 次,对照标准曲线计算方法回收率。
1.3.6 3 种市售鸡蛋中褪黑素含量的测定
按照1.3.2 方法对普通鸡蛋、乌鸡蛋和柴鸡蛋进行处理,按1.3.3 中高效液相色谱条件进行测定分析,样品中的褪黑素含量根据标准曲线方程进行计算。
采用IBM SPSS Statistics 26 软件对试验数据进行显著性分析,P<0.01 表示组间差异极显著,P<0.05 表示组间差异显著,P>0.05 表示组间差异不显著,所有数据均以平均值±标准差进行表示。
2.1.1 酸的种类对褪黑素色谱峰的影响
酸的种类对褪黑素色谱峰的影响如表1 所示。
表1 酸的种类对褪黑素色谱峰的影响
Table 1 Effect of acid types on melatonin chromatographic peak
酸的种类纯水0.1%甲酸0.1%冰乙酸0.1%三氟乙酸保留时间/min 8.846 8.847 8.855 8.863峰高/mAU 7.60 7.55 7.63 8.00峰宽/min 0.254 8 0.246 7 0.248 9 0.244 4峰面积/(mAU·s)125.50 123.20 124.45 125.80对称因子0.803 0.830 0.850 0.898
由表1 可知,水相中是否加酸以及加酸的种类对褪黑素色谱峰的保留时间几乎无影响。在流动相中加酸可修饰峰形,其中,加入三氟乙酸的峰形最好,且峰面积比加入甲酸、冰乙酸的峰面积略大,故本试验选用三氟乙酸水溶液作为流动相。
2.1.2 三氟乙酸浓度对褪黑素色谱峰的影响
三氟乙酸浓度对褪黑素色谱峰的影响如表2所示。
表2 三氟乙酸浓度对褪黑素色谱峰的影响
Table 2 Effect of trifluoroacetic acid concentration on melatonin chromatographic peak
浓度/%0.05 0.10 0.50峰高/mAU 8.6 8.0 8.5峰宽/min 0.228 0 0.244 4 0.233 2峰面积/(mAU·s)128.8 125.8 127.0对称因子0.897 0.898 0.874 pH 值3 2 1
由表2 可知,三氟乙酸水溶液浓度为0.05% 的对称因子与0.1% 时相近,且都大于0.5% 的对称因子,三氟乙酸水溶液浓度为0.05% 的峰高与0.5% 相近,且都大于0.1%的峰高。浓度为0.05%时褪黑素标准品的峰面积最大。三氟乙酸酸性较强,长期使用pH值≤2 的流动相会对色谱柱柱效造成不可逆转的损伤,故而选取浓度为0.05%的三氟乙酸水溶液作为本试验的流动相。
2.1.3 不同流动相比例、流速对褪黑素出峰的影响
不同流动相比例、流速对褪黑素出峰的影响如表3 所示。
表3 不同流动相比例、流速对褪黑素出峰的影响
Table 3 Effect of different mobile phase ratios and flow rates on melatonin output peak
0.05% TFA∶甲醇(体积比)25∶75 30∶70 35∶65 35∶65 40∶60 40∶60 40∶60流速/(mL/min)0.70 0.70 0.70 0.60 0.60 0.55 0.50保留时间/min 5.422 5.938 6.726 7.799 9.117 9.975 11.060峰面积/(mAU·s)38 480.9 41 124.2 43 902.4 50 613.3 54 512.2 59 108.9 65 365.3
由表3 可知,有机相比例越高,流速越快,褪黑素出峰时间越早,但当流动相比例一定时,流速越慢,目标峰峰宽越大,甚至会出现平头峰的现象。综合考虑流动相比例与流速对褪黑素出峰的影响,本试验选用0.05% TFA∶甲醇=40∶60(体积比),流速为0.6 mL/min。
2.1.4 不同柱温对褪黑素出峰的影响
不同柱温对褪黑素出峰的影响如表4 所示。
表4 不同柱温对褪黑素出峰的影响
Table 4 Effect of different column temperatures on melatonin output peak
柱温/℃20 25 30 35保留时间/min 9.246 9.131 8.839 8.714峰面积/(mAU·s)249.3 253.1 255.3 252.6
由表4 可知,柱温为30 ℃时,峰面积最大,故本试验选用柱温为30 ℃。
2.1.5 不同紫外检测波长对褪黑素出峰的影响
不同紫外检测波长对褪黑素出峰时间及峰面积的影响见表5。不同样品的光谱图见图1。
图1 褪黑素光谱图
Fig.1 Melatonin spectrum
表5 不同检测波长对褪黑素出峰的影响
Table 5 Effect of different detection wavelengths on melatonin output peak
检测波长/nm 222 265 278保留时间/min 8.828 8.829 8.831峰面积/(mAU·s)143.5 24.4 31.3
由表5 可知,褪黑素在检测波长为222 nm 时的紫外吸收峰最大。由图1 可知,褪黑素在222 nm 和278 nm处均有较大吸收峰值,故选用222 nm 作为本试验的检测波长。通过比对褪黑素标准溶液和蛋黄、蛋清样品的图谱,样品在8.8 min 处色谱峰的吸光度波形与标准品相似,故而判断其为同一物质。
褪黑素标准曲线如图2 所示。
图2 褪黑素标准曲线
Fig.2 Melatonin standard curve
由图2 可知,褪黑素浓度在0.1~10 μg/mL 时线性关系良好,标准曲线方程为y=128.57x-3.158 8,相关系数R2=0.999 9。
精密度试验结果如表6 所示。
表6 精密度试验结果
Table 6 Precision test results
编号1 2 3 4 5 6峰面积/(mAU·s)127.6 128.8 128.1 127.9 127.5 128.4平均值/(mAU·s)128.05 RSD 值/%0.38
由表6 可知,同一样品连续进样6 次时,所测得峰面积范围为127.5~128.8(平均值为128.05),相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)值为0.38%,方法精密度较高。
特异性试验结果如图3 所示。
图3 特异性试验结果
Fig.3 Specific test results
由图3 可知,溶剂甲醇在褪黑素出峰位置无干扰(图3A),褪黑素标准品的保留时间约为8.854 min(图3B),用此方法测定鸡蛋蛋黄、蛋清中的褪黑素含量时色谱峰分离情况良好、峰形良好(图3C、图3D)。
稳定性试验结果如表7 所示。
表7 稳定性试验结果
Table 7 Stability test results
检测时间/h 0 2 4 6 8 10 12峰面积/(mAU·s)73.3 74.2 72.9 70.4 73.3 73.3 73.1平均值/(mAU·s)72.94 RSD 值/%1.51
由表7 可知,以此方法处理检测的样品放置12 h内,褪黑素峰面积平均值为72.94,其RSD 值为1.51%,稳定性良好。
蛋黄样品和蛋清样品中加标回收率见表8、表9。
表8 蛋黄样品加标回收率
Table 8 Recovery rate of yolk samples added standard
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9样品值/(μg/mL)3.357 3.357 3.357 3.357 3.357 3.357 3.357 3.357 3.357加标量/(μg/mL)0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.6 0.6 0.6测定值/(μg/mL)3.510 3.512 3.509 3.681 3.679 3.678 3.865 3.856 3.864回收率/%98.7 98.7 98.6 98.0 97.9 97.9 97.7 97.5 97.7平均回收率/%98.69 97.93 97.59 RSD值/%0.04 0.05 0.12
表9 蛋清样品加标回收率
Table 9 Recovery rate of egg white samples added standard
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9样品值/(μg/mL)3.405 3.405 3.405 3.405 3.405 3.405 3.405 3.405 3.405加标量/(μg/mL)0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.6 0.6 0.6测定值/(μg/mL)3.590 3.587 3.559 3.756 3.752 3.750 3.888 3.874 3.885回收率/%99.6 99.5 98.7 98.7 98.6 98.6 97.1 96.7 97.0平均回收率/%99.28 98.64 96.94 RSD值/%0.49 0.07 0.19
由表8 可知,蛋黄平均回收率为97.59%~98.69%,RSD 值为0.04%~0.12%;由表9 可知,蛋清平均回收率为96.94%~99.28%,RSD 值为0.07%~0.49%。
本试验采用信噪比法进行测定,得出方法的最低检测限为0.019 6 μg/mL,定量限为0.065 2 μg/mL。
3 种市售鸡蛋中的褪黑素含量结果如图4 所示。
图4 3 种市售鸡蛋中的褪黑素含量
Fig.4 Melatonin content in three commercially available eggs
由图4 可知,普通鸡蛋的蛋黄中褪黑素含量极显著低于乌鸡蛋和柴鸡蛋(P<0.01),乌鸡蛋的蛋黄中褪黑素含量略低于柴鸡蛋,但差异不显著(P>0.05)。普通鸡蛋的蛋清中褪黑素含量极显著低于乌鸡蛋和柴鸡蛋(P<0.01),乌鸡蛋的蛋清中褪黑素含量略低于柴鸡蛋,但差异不显著(P>0.05)。乌鸡蛋、柴鸡蛋和普通鸡蛋的蛋黄中的褪黑素含量分别为78.64、79.04 ng/g 和76.77 ng/g,乌鸡蛋、柴鸡蛋和普通鸡蛋的蛋清中的褪黑素含量分别为75.53、75.82 ng/g 和72.57 ng/g。
Talebianpoor 等[16]以甲醇∶0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(30∶70,体积比)为流动相,流速为1 mL/min,测定人血浆中的褪黑素;李珍妮等[17]以甲醇∶0.5 moL/L 磷酸氢二钠(45∶55,体积比)为流动相,流速1 mL/min,测定保健品中的褪黑素。以上方法重现性好,回收率高,提取时间短,但流速较大,易造成柱压不稳、系统漏液等情况,使用盐溶液做流动相容易使液相系统的阀件中析出结晶,造成色谱柱、单向阀等的损坏,严重影响机器的使用寿命。赵建芬等[24]以无水甲醇∶水(50∶50,体积比),流速1 mL/min,柱温室温,测定芦荟、枸杞叶和桑叶中的褪黑素,该方法检测速度快,精密度高、稳定性号和准确度高,但褪黑素的保留时间过于靠前,检测成分复杂的生物样品时会出现目标峰与杂峰分离不完全的情况。GB/T 5009.170—2003《保健食品中褪黑素含量的测定》[15]以甲醇∶水∶三氟乙酸(45∶55∶0.05,体积比)为流动相,流速0.8 mL/min,柱温室温,对胶囊或片剂包装的保健食品中的褪黑素进行测定,目标物褪黑素出峰时间早,峰形良好,与杂峰分离完全。本试验根据实验室条件对柱温、流动相比例和流速进行优化,确定了以0.05%三氟乙酸水溶液∶甲醇=40∶60(体积比)为流动相,流速0.6 mL/min,柱温30 ℃的色谱条件。以此方法测定市售鸡蛋中的褪黑素含量,保留时间较早,峰形良好、重复性高、精密度高。
不同品种的鸡蛋中营养物质的种类与含量都不尽相同。黄涛等[25]研究表明,高原鸡蛋中各种必需元素种类齐全,硒含量相对较高。董传豪等[26]研究证明大恒鸡和科宝鸡鸡蛋蛋黄中的铜含量显著高于沪宁鸡;泸宁鸡和大恒鸡鸡蛋中的钙、锌和磷含量显著高于科宝鸡;大恒鸡蛋鸡蛋中钙、锌和猛含量显著高于泸宁鸡和科宝鸡鸡蛋。吴少锋[27]研究发现,与白、粉、褐壳鸡蛋相比,绿壳鸡蛋中硒、碘、锌、维生素E 和氨基酸含量更高,胆固醇含量更低,蛋黄颜色等级更高。姜峻玥等[28]研究表明松针绿壳鸡蛋的总氨基酸、钙、铁和锌含量高于市售其它品种的鸡蛋。
功能性鸡蛋是指采用外源性营养调控法,通过改变营养物质在饲粮中的配比,促进营养物质向蛋中的沉积所获得的,食用后有益于人体健康的动物性产品。多年来关于功能性鸡蛋的开发已取得了不少进展,包括低胆固醇蛋[29]、ω-3 不饱和脂肪酸蛋[30-31]、高微量元素蛋[32]、高维生素蛋[33-35]等。功能性鸡蛋深受世界各国消费者的喜爱,具有很高的经济价值。而褪黑素生物学功能众多[2],参与多种疾病防治[36-37],开发富褪黑素功能性鸡蛋具有良好的市场前景。
本试验优化建立一种测定鸡蛋中褪黑素含量的高效液相色谱法,其色谱条件为流动相:0.05%三氟乙酸水溶液∶甲醇=40∶60(体积比),流速0.6 mL/min,柱温30 ℃,检测波长222 nm,进样量10 μL。该方法回收率较高,精确度高,特异性强,适用于测定鸡蛋中的褪黑素含量。使用上述方法对市售不同品种鸡蛋中的褪黑素含量进行检测分析,结果显示乌鸡蛋、柴鸡蛋中的褪黑素含量极显著高于普通鸡蛋,乌鸡蛋中的褪黑素含量与柴鸡蛋差别不大;蛋黄中的褪黑素含量要远高于蛋清,从褪黑素含量的角度考虑,乌鸡蛋和柴鸡蛋的营养价值要高于普通鸡蛋。
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