乳铁蛋白是转铁蛋白家族中一种功能性铁结合糖蛋白,含约700 个氨基酸残基,分子量约为80 kDa[1],富含于哺乳动物的乳汁中,在牛奶和初乳中含量最高(7 g/L)[2]。乳铁蛋白(lactoferrin,Lf)具有多种生物活性,如抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性以及治疗贫血等[3],此外在降低新生儿疾病和促进其免疫系统发育等方面也发挥着重要作用[4]。目前,Lf 已作为一种营养强化剂被广泛应用于食品中。据GB 14880—2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中规定,乳铁蛋白在乳制品及婴幼儿配方食品中的最大添加量为1.0 g/kg。
目前针对乳铁蛋白检测的仪器分析方法有高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法和高效毛细管电泳(high-performance capillary electrophoresis,HPCE)法,其 中HPLC 法 多 使 用 反 相HPLC[5],同时也发展出其它衍生方法,如尺寸排阻-HPLC 法[6]、HPLC-荧光法[7]、HPLC-串联质谱法[8]等。HPCE 法设备结构简单、分离效率高,近年来也被应用在乳制品中Lf 的检测[9-10]。传统仪器方法均依赖于色谱柱或毛细管的分离效率,使得样品中具有相似性质、等电点或电泳迁移率的蛋白质难以区分[5,11],此外仪器法受设备限制,便携性较差、成本较高且对操作人员技术要求较高。Lf 的快速检测方法主要有生物传感器法和酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法等。生物传感器法多基于Lf 抗体或适配体的特异性识别,与电化学[12]、表面等离子体共振[13]、表面增强拉曼[14]等技术结合完成检测。该方法在灵敏度及特异性方面表现优异,但可重复性易受环境因素影响,同样依赖相对较昂贵的仪器。ELISA 方法快速便捷,已有相应市售Lf 检测产品,并逐渐开发出基于不同模式的检测方法[15-16],但抗体制备较为复杂耗时,产品价格也较为昂贵。为此,亟需建立一种便捷、灵敏且具有良好经济性的Lf 检测方法。
核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到的[17],可与靶标进行高亲和力特异结合的单链寡核酸序列(ssDNA 或RNA),具有高稳定性、易合成、易修饰、价格低等诸多优点[18],并在生物传感器、靶向治疗、药物传递、环境监测等方面展现出应用潜力[19]。目前已有报道基于核酸适配体检测奶粉中Lf 的方法[20-22],其中酶联适配体(enzymelinked aptamer assay,ELAA)法因其原理与ELISA 相似,同样具有可视化且经济性突出而广受关注,但目前相关研究尚少。
本研究建立一种酶联核酸适配体间接竞争型比色法以检测奶粉中Lf 含量。生物素化Lf 适配体通过链霉亲和素(streptavidin,SA)-生物素作用与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)缀合形成检测探针,在与样品溶液混合孵育后加入至微孔板中,使样品中Lf 与包被在微孔板上的Lf 竞争结合检测探针,最终通过酶催化底物的颜色变化快速测定Lf 含量,以期为实验室及基层抽检、临检等检测奶粉提供新思路。
乳铁蛋白(来源于牛乳,纯度≥85%)、α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-La,来源于牛乳,纯度≥85%)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg,来源于牛乳,纯度≥90%)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN,来源于牛乳,纯度≥90%)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,纯度≥98%)标准品:西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS):上海碧云天生物技术有限公司;吐温-20、SA、SA-HRP:上海阿拉丁生化科技股份有限公司;96 孔微孔板:美国Thermo Fisher Scientific 公司;单组分3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液、0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液(carbonate buffer solution,CBS)、0.05 mol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris hydroxymethyl aminomethane hydrochloride,Tris-HCl)缓冲液(pH7.2):北京索莱宝科技有限公司;婴幼儿配方奶粉:市售;乙酸、硫酸(均为优级纯):国药集团化学试剂有限公司;超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm,25 ℃):默克化工技术(上海)有限公司。
生物素化Lf 适配体序列[23](5′-biotin-TGGTGCTGCCCCTAGTCTCCGGCTGATAGCTGCTTCTTGG-3′)由上海生工生物工程股份有限公司合成纯化。
Multiskan™FC 酶标仪:美国Thermo Fisher Scientific 公司;IKA V2 S025 漩涡混合器:德国IKA 公司;Neofuge 15 高速冷冻离心机:上海力申科学仪器有限公司;Milli-Q 超纯水系统:美国Millipore 公司;HPCE512高效毛细管电泳仪:济南海能仪器股份有限公司。
1.3.1 检测原理
方法原理如图1 所示。
图1 间接竞争型酶联适配体法检测奶粉中Lf 原理
Fig.1 Schematic illustration for the detection of Lf in milk powder by indirect competitive enzyme-linked aptamer colorimetric method
由图1 可知,先将Lf 包被在微孔板上,并用BSA封闭多余位点,后将SA-HRP 通过SA-生物素识别结合作用缀合在生物素化适配体上形成检测探针;检测探针先与样品溶液混合并孵育,此后加入至微孔板中,样品溶液中Lf 与微孔板上的Lf 共同竞争结合检测探针,与样品中Lf 结合的检测探针将被洗脱,而与微孔板上Lf 结合的检测探针会被保留在孔内,加入TMB后,经保留在孔内的检测探针中辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)催化显色溶液变为蓝色,加入终止液后,溶液颜色变为黄色。样品中Lf 浓度与显色颜色深度成反比,测定450 nm 处的吸光度。
1.3.2 微孔板制备与检测探针合成
采用合适的包被缓冲液将Lf 标准品稀释成一定浓度,取100 μL 加入微孔板内,包被过夜(4 ℃、12 h),之后用300 μL 含吐温-20(0.05%)的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered solution with Tween-20,PBST)洗涤3 次。Lf 包被结束后向每孔加入200 μL 一定浓度的BSA 溶液,26 ℃封闭一定时间,使用PBST 缓冲液洗涤3 次,得到制备好的微孔板。
将一定浓度的生物素化适配体与一定稀释比例的SA-HRP 按体积比1∶1 混合,并于室温下孵育10 min,得到酶联适配体检测探针。
1.3.3 竞争型酶联适配体检测Lf
将200 μL 待测溶液与200 μL 检测探针充分混合,取100 μL 混合液加入制备好的微孔板中孵育一定时间,用300 μL PBST 缓冲液洗涤3 次。之后向孔内加入100 μL TMB 显色液,显色10 min 后加入100 μL 2 mol/L H2SO4 终止显色,采用酶标仪测定450 nm 处吸光度。
1.3.4 包被缓冲液优化
分别使用3 种不同包被缓冲液(PBS、Tris-HCl、CBS)和纯水在微孔板内包被200 nmol/L 的Lf,此后按1.3.3 方法对其进行空白试样检测,分析3 种不同包被缓冲液对Lf 包被的影响,选取吸光度合适的包被缓冲液作为最优包被缓冲液。
1.3.5 Lf 包被浓度及适配体浓度优化
采用棋盘法,Lf 包被浓度为50、100、200、400、600、800 nmol/L,生物素化适配体浓度为20、50、100、200、300 nmol/L。按照1.3.3 方法对空白试样进行检测,分析不同组合对显色效果的影响,选取吸光度合适的组合作为最优Lf 包被浓度及适配体浓度。
1.3.6 BSA 封闭浓度与SA-HRP 稀释倍数优化
使用不同浓度(0.1%、0.5%、1.0%、2.0%)BSA 对微孔板封闭1、2、3 h,之后直接加入100 μL 用PBS 缓冲液稀释的SA-HRP[稀释倍数为1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000(体积比)]结合10 min,清洗3 次后加入TMB 显色。探究BSA 封闭浓度和封闭时间对SA-HRP 非特异性吸附的影响。
1.3.7 竞争反应时间优化
使用1.3.3 方法对7 组Lf 浓度为300 nmol/L 标准品溶液进行检测,其中加入微孔板后的孵育时间分别为10、20、30、40、50、60、80 min。探究反应时间对Lf竞争结合饱和程度的影响。
1.3.8 方法学评价
使用PBS 缓冲液和不含Lf 的奶粉样品基质溶液分别制备不同浓度(0、50、100、150、200、250、300 nmol/L)的Lf 溶液并对其进行测定,各浓度Lf 测定的A450 值,记为Ai;空白试样记为A0。以Lf 浓度的对数值为横坐标,相对吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,计算线性方程和相关系数,以评价该方法的灵敏度。相对吸光度(X,%)计算公式如下。
基质效应(M,%)根据如下公式评估。
式中:A 为待测物在标准溶液中的响应值;B 为相同浓度待测物在样品溶液中的峰面积。
为验证方法特异性,使用1.3.2 方法分别检测Lf、BSA、α-La、β-Lg、OPN 蛋白以及含有Lf 的阴性蛋白混合液。试验中Lf 浓度为300 nmol/L,其余蛋白浓度为1 μmol/L。
1.3.9 实际样品检测
对3 款市售奶粉进行检测,同时参照Li 等[24]的方法,采用HPCE 法进行Lf 含量测定。奶粉样品前处理方法:精密称取50 mg 样品于1.5 mL 离心管中,加入1 mL 50 mmol/L 乙酸溶液,使其成为50 mg/mL 的奶粉样液。混匀后静置10 min,8 000 r/min 离心10 min。离心后样品从上到下分别为脂肪层、乳清层和酪蛋白沉淀层。取一定量乳清层经0.22 μm 醋酸纤维素膜过滤后,使用PBS 缓冲液稀释3 倍,得到样品溶液。
使用Graph PAD prism 9 对数据进行统计学处理、分析并作图。
2.1.1 包被缓冲液
ELAA 与ELISA 方法相同,在检测过程中均涉及固相结合反应,因此微孔板内靶标的包被效果会直接影响试验灵敏度和稳定性。在基于蛋白质的微孔板包被中,蛋白通过亲水或疏水基团的随机吸附作用固定在经相应表面处理的微孔板上,由于各类蛋白等电点和分子量的不同,在相同条件下其与微孔板的结合能力也有所差异[25],因此需要对包被缓冲液进行优化,以选择包被效果最好的缓冲条件。不同包被缓冲液对Lf包被的影响如图2 所示。
图2 包被缓冲液对包被效果的影响
Fig.2 Influence of coating buffer on coating effect
由图2 可知,PBS 组与Tris-HCl 组吸光度显著高于CBS 组和纯水(P<0.05),但二者之间无显著差异(P>0.05)。为简化试验所需试剂,选择同时可作为结合缓冲液的PBS 缓冲液作为包被缓冲液。
2.1.2 Lf 包被浓度及适配体浓度
试验中Lf 包被浓度和适配体浓度直接影响检测方法的最终性能,理论上二者浓度增大可以实现更大浓度靶标的竞争反应,会获得更大的线性范围,但灵敏度可能发生相应下降[26-27],因此需要对二者的浓度进行优化。通过棋盘法测定不同Lf 包被浓度及适配体浓度组合的A450 结果如图3 所示。
图3 不同Lf 包被浓度及适配体浓度检测结果
Fig.3 Detection results of different Lf coating concentrations and aptamer concentrations
由图3 可知,随着Lf 包被浓度的提升,整体A450呈上升趋势,考虑酶标仪测定范围、颜色强弱以及试验灵敏度,选取A450 在2.5 附近的组合为最佳工作条件,因此,选择Lf 包被浓度为200 nmol/L,适配体工作液浓度为50 nmol/L。
2.1.3 BSA 封闭浓度、封闭时间与SA-HRP 稀释倍数
HRP 与TMB 的催化氧化反应是显色的关键因素,过高的非特异性吸附会造成试验本底颜色过高,影响检测的灵敏度[28],因此需要对微孔板上的多余位点进行封闭,以及优化SA-HRP 稀释倍数以降低其在微孔板上的非特异性吸附。不同BSA 封闭时间、封闭浓度与SA-HRP 稀释倍数对空白试样测定的A450 如图4所示。
图4 BSA 封闭时间、封闭浓度及SA-HRP 稀释倍数优化
Fig.4 Optimization of BSA blocking time,blocking concentration,and SA-HRP dilution factor
由图4A 可知,采用0.1% BSA 时封闭不完全,非特异性吸附过大,随着BSA 浓度的增大,SA-HRP 的非特异性吸附减小,吸光度出现下降趋势,且在2 h 后无明显变化。因此选择2.0% BSA 封闭2 h。由图4B 可知,1∶2 000 和1∶4 000 间的吸光度变化不显著(P>0.05),随着稀释倍数的加大,吸光度显著降低(P<0.05),因此选择SA-HRP 稀释倍数为1∶4 000。
2.1.4 竞争反应时间
竞争反应时间也是影响试验结果的因素之一,时间过短会造成结合不充分,从而影响检测灵敏度,但过长的反应时间会增加检测方法的时间成本。竞争反应时间对检测方法的影响如图5 所示。
图5 竞争反应时间优化
Fig.5 Optimization of competitive reaction time
由图5 可知,A450 随着竞争反应时间的延长而增大,当反应时间大于60 min 时,A450 变化无显著差异(P>0.05),表明竞争反应达到饱和,因此竞争反应时间定为60 min。
2.2.1 灵敏度
试验所用适配体筛选时使用的缓冲体系(PBS 缓冲液)与最终面向实际检测应用的样品体系在离子浓度、pH 值以及成分组成等各类环境变量上有所差异,而这些复杂的样品基质效应会对适配体的亲和力产生影响[29],进而影响检测探针的灵敏度。因此需要评价基质效应(matrix effects,ME)对检测灵敏度及可视化的影响并分析基于实际样品条件下的灵敏度,ME>0%说明具有基质抑制效应,ME<0%说明具有基质增强效应[31]。PBS 缓冲液体系和奶粉样品基质体系下的标准曲线方程和相关系数如图6 所示。
图6 Lf 在PBS 体系及样品基质体系下的标准曲线
Fig.6 Standard curves of Lf in PBS system and sample matrix system
由图6 可知,随Lf 浓度的增大,溶液颜色由蓝色逐渐变浅,在50~300 nmol/L 范围内,A450 值与Lf 浓度呈负相关。PBS 体系下线性回归方程为y=-94.938x+258.8(R2=0.993 3)。基质溶液体系下整体颜色变浅,对50~300 nmol/L 范围内各点基质效应为53.5%~60.0%,说明样品基质对检测具有抑制效应,实际应用时应使用基质标曲,其线性回归方程为y=-65.143x+179.92(R2=0.996 7),在50~300 nmol/L 范围内仍然具有良好的线性关系,参考GB/T 33411—2016《酶联免疫分析试剂盒通则》中对基于竞争法检测的相关要求,以空白溶液(n≥10)检测结果均值减2 倍标准差对应浓度表示检出限,计算检出限(limit of detection,LOD)为24.45 nmol/L。结果表明,本方法在基质条件下仍具有较低的检测限与较宽的线性范围,可实现实际样品中Lf 的高灵敏检测。
2.2.2 特异性
为验证该方法的特异性,防止样品中其它蛋白对检测过程的干扰,对试样(乳清层)中其它常见蛋白如BSA、α-La、β-Lg 和会与Lf 形成复合物的OPN 蛋白[31],以及含有Lf 的阴性蛋白混合液(Mix)进行测定,特异性检测结果如图7 所示。
图7 特异性检测结果
Fig.7 Results of specificity test
由图7 可知,Lf 和Mix 的A450 值显著低于其它几种蛋白(P<0.05),说明这几种蛋白对该方法干扰较小,方法特异性良好。
2.2.3 加标回收率为验证方法准确性,使用该方法进行实际样品加标回收率测定。利用HPCE 对空白奶粉试样进行检测,HPCE 检测结果如图8 所示。
图8 高效毛细管电泳法检测空白样品中Lf 含量电泳图
Fig.8 Electrophoretogram for the detection of Lf content in blank samples by HPCE
由图8 可知,该样品在Lf 特征峰位置未检测到峰,说明该样品不含Lf 或其含量可忽略不计。分别添加低、中、高3 种浓度水平的Lf 蛋白至50 mg 空白奶粉样品中,按1.3.8 方法处理后,Lf 终浓度分别为50、200、300 nmol/L。根据标准曲线计算Lf 检出量、加标回收率和相对标准偏差(relative standard deviatio,RSD),每个试验重复3 次,加标回收率结果如表1 所示。
表1 Lf 的加标回收率(n=3)
Table 1 Recoveries of Lf(n=3)
添加量/(nmol/L)50 200 300检出量/(nmol/L)57.7±6.2 182.6±7.3 274.2±4.8回收率/%115.4±12.5 91.3±3.6 91.4±1.6 RSD/%10.80 3.99 1.76
由表1 可知,Lf 的加标回收率为91.3%~115.4%,RSD 为1.76%~10.80%,说明该方法可以用于实际样品的检测。
为验证方法的实用性,对3 款标称额外添加Lf 的市售奶粉进行Lf 含量检测,同时使用HPCE 对其含量进行测定,并将HPCE 检测结果作为基准比对两种方法的一致率,对比检测结果如表2 所示。
表2 3 种奶粉样品检测结果及方法对比(n=3)
Table 2 Test results of three kinds of milk powder samples and method comparison(n=3)
样品1 2 3检出量/(mg/L)23.26 16.83 21.06 HPCE 测定量/(mg/L)24.64 15.37 21.42一致率/%94.39 109.50 98.30 RSD/%4.25 3.06 1.27
由表2 可知,该方法对3 款奶粉Lf 含量的测定结果与HPCE 接近,一致率为94.39%~109.50%,说明该方法可准确测定实际样品中的Lf 含量。
本研究建立一种基于间接竞争型酶联适配体比色法检测奶粉中的乳铁蛋白。该方法与仪器法和ELISA法相比具有高灵敏、高特异性等特点,表现出较好的经济性。该方法在50~300 nmol/L 靶标范围内具有良好的线性关系(R2=0.996 7),检出限为24.45 nmol/L,加标回收率为91.3%~115.4%,同时在实际样品检测中与HPCE 测定结果一致率为94.39%~109.50%。综上所述,该方法在奶粉中Lf 的检测方面具有一定应用前景,有望进一步开发。
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